本文介绍了一种精确采集胸导管淋巴细胞并利用延时摄影技术观察肠道趋向性淋巴细胞在大鼠派尔集合淋巴结中迁移过程的方法，观察时长为3小时。该技术可用于阐明在炎症条件下淋巴细胞动态行为的变化。
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本文内容
摘要
摘要
在生理条件下，初始淋巴细胞会从血液重新循环至淋巴组织，这一现象在肠道免疫中被认为具有重要意义。次级淋巴器官的基质，例如派尔集合淋巴结（Peyer’s patches, PPs）或肠系膜淋巴结，是初始淋巴细胞感知抗原的场所。初始淋巴细胞通过血液循环到达高内皮微静脉，由此进入PPs。据估计，某些免疫调节剂可能影响淋巴细胞的迁移，但对微循环动态进行精确评估非常困难，建立一种在体内观察淋巴细胞迁移的方法将有助于阐明其具体机制。我们优化了从淋巴管收集淋巴细胞的方法，并在大鼠PPs中观察了趋向肠道的淋巴细胞的详细动态。我们选用共聚焦激光扫描显微镜对大鼠PPs进行活体观察，并采用延时摄影技术进行记录。现在可以获得清晰的图像，有助于对淋巴细胞动态进行分析。
引言
派尔集合淋巴结（Peyer’s patches, PPs）由位于小肠黏膜下层的数百个淋巴滤泡组成。PPs 可分为滤泡区、滤泡间区以及位于滤泡下部的生发中心，在生发中心内淋巴细胞通过抗原呈递受到刺激。PPs 无传入淋巴管，抗原通过上皮细胞层从小肠腔侵入黏膜下层。覆盖淋巴滤泡的上皮区域称为滤泡相关上皮，其中分布有特化的微皱褶细胞（M细胞），可摄取黏膜抗原。M细胞从管腔侧摄取抗原后，抗原被树突状细胞捕获，并呈递给经高内皮微静脉（HEVs）内皮进入PPs的初始淋巴细胞1。PPs 在肠道免疫中发挥重要作用，并与炎症的早期阶段密切相关。许多分子相互作用参与淋巴细胞进入继发性淋巴器官（SLOs）的过程，包括黏附分子、趋化因子2,3以及鞘氨醇-1-磷酸4；因此，存在多种潜在的治疗靶点。因此，观察PPs内的淋巴细胞动态，有助于我们了解炎症的最初阶段，并评估多种有前景药物的有效性。
本文所述方法聚焦于派伊尔集合淋巴结（PPs）中淋巴细胞的迁移过程，包括若干操作步骤（胸导管插管5、收集淋巴细胞以及将细胞回输后进行长期观察）。由于这些操作较为复杂，且以往文献中难以准确了解每一步骤的具体实施方式，因此本文介绍了一些实现成功观察的关键技巧。例如，将导管插入胸导管的操作极具挑战性，初始插管成功率低于50%。然而，我们对方法进行了改进，使成功率提升至80%以上。本文还提及其他若干对于成功观察必不可少的技术要点，以实现在不同条件下对淋巴细胞跨内皮迁移进行定量评估。
在以往的研究中，理解随时间变化的三维动态较为困难，例如通过静脉注射印度墨水对派伊尔集合淋巴结（PPs）的血管结构进行染色6，或因显微镜仅具备单一焦平面而受限7。近年来，利用某些光转化荧光蛋白转基因动物（如Kaede小鼠）的观测方法，已阐明了体内系统的细胞迁移过程8。另一项研究揭示了淋巴细胞从派伊尔集合淋巴结外流的CD69非依赖性关闭机制9。我们采用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM），因其具有高分析能力。如今，我们能够轻松获取高分辨率图像，并用于分析淋巴细胞的动态行为。
在本报告中，我们展示了一系列用于评估派伊尔集合淋巴结（PPs）中淋巴细胞迁移的方法。首先，我们改进了胸导管插管技术以收集淋巴细胞。其次，我们从多个方面优化了观察方法，尽可能在显微镜观察过程中保持目标器官的稳定状态，从而能够连续获得长达3小时的高质量图像。第三，我们对淋巴细胞迁移的细胞运动进行了量化分析，以评估某些药物的作用效果。这些改进后的实验方案将有助于推动黏膜免疫学评估方法的发展。
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方案
实验方案已获国防医学院动物研究委员会批准（编号：16058）。动物饲养采用标准实验室饲料（CLEA Japan Inc，东京，日本）。实验动物的处理遵循美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）指南。
1. 淋巴细胞的收集与分离
注意：由于淋巴细胞必须保持新鲜，不能储存，因此每次实验都必须从大鼠体内新鲜采集。此外，肠道趋向性淋巴细胞必须直接从其循环经过的胸导管中收集。 所有操作应在6小时内完成，所有器械、手套和操作表面均需保持清洁。为了维持动物的生理稳定状态，实验中使用的所有生理盐水及其他液体均应保持温热。
- 将灌注管（直径1 mm）浸入热水（约80–90 °C）中软化后，弯成肝素曲线形状（曲率半径约5 mm），并提前数小时用胶带固定在塑料板上。
- 通过腹腔注射给予雄性Wistar大鼠（8–12周龄）混合麻醉剂（Midazolam 2 mg/kg、Domitor 0.15 mg/kg 和 Betulphar 2.5 mg/kg）进行麻醉，并使用电动剃毛器剃除腹部体毛。剃毛后彻底清除残留毛发，防止毛发进入腹腔。
- 通过夹趾法确认大鼠已达到手术所需稳定的麻醉深度后，使用手术剪从腹中线向左侧肋缘下区域做水平切口。操作时需在光照下观察壁层腹膜中的血管，避免损伤。
- 用湿润纱布包裹胃部，并轻柔地将胃向右侧体外移位，以暴露腹膜后器官。使用手术剪在脊柱竖脊肌与脂肪组织之间剪开一个小口，再用手指钝性分离两者。
- 仔细剥离胸导管周围的结缔组织。结缔组织的量随年龄增长而增加。从左侧膈肌脚下方开始向尾侧暴露胸导管，直至显露出约20 mm长的胸导管段。使用精密镊子或湿润棉签轻柔分离胸导管与主动脉之间的粘连。
- 此步骤需格外小心，因部分大鼠可能存在腹主动脉分支的小动脉跨越胸导管，或因淋巴丛位置较高而导致胸导管较短（即呈蛛网状分布的小胸导管）。应避免不必要的接触胸导管，以防诱发水肿。
- 在左侧膈肌脚下方的胸导管处用缝线（3-0 丝线）结扎。结扎后远端胸导管会膨胀。
- 用手术剪的刀尖在腹壁刺出一个直径约5 mm的孔，将呈发夹状弯曲的灌注管穿过该孔，并在一点处将其固定于腰大肌上。随后用含10 U/mL肝素的生理盐水充满灌注管。
- 在膨胀的胸导管下方预先穿入一根缝线（3-0 丝线），然后用灌注管锐利端刺入胸导管，将导管向尾侧插入约5 mm，并用缝线将胸导管与灌注管一起结扎固定。
- 为防止脱水，使用精密镊子在胃窦前壁刺出一个直径约3 mm的孔，将硅胶管（直径2 mm）经幽门环插入十二指肠。缝合手术切口后，将动物置于Bollman笼中，并开始通过硅胶管以3 mL/h的流速向每只大鼠的十二指肠内灌注含糖生理盐水。用纸巾覆盖整个笼子以保持温暖。
- 将灌注管固定在装有冰浴的50 mL锥形管盖中央的孔上，锥形管内含有含6 U/mL肝素、10%胎牛血清和RPMI 1640培养基（pH 7.4；参见材料表）的溶液，于冰上收集胸导管淋巴细胞（TDLs）。注意避免导管尖端接触锥形管管壁，以防导管内形成纤维蛋白凝块导致堵塞。在6小时内可收集约20 mL淋巴液，其中含有约1.0 × 108～109个淋巴细胞。为在完全麻醉状态下获取淋巴细胞 ，需持续监测麻醉深度并适时观察淋巴液流动情况。大鼠放入Bollman笼约3小时后，再次给予相同种类和剂量的麻醉剂，以维持6小时的深度麻醉状态。
2. 使用羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯（CFDSE）标记淋巴细胞
- 将CFDSE（材料表）溶于二甲基亚砜（DMSO）中，配制成15.6 mM的溶液（500 µg CFDSE溶于60 µL DMSO中）。
- 按照先前所述方法10，将淋巴细胞（1 × 108～109）与50 µL CFDSE溶液在50 mL RPMI 1640培养基中于37 °C孵育30分钟。
3. 微血管研究的实验设置
- 使用咪达唑仑（2 mg/kg）、多咪静（0.15 mg/kg）和贝塔芬（2.5 mg/kg）的混合物对受体大鼠（8–12周龄）进行腹腔注射麻醉，并通过夹趾反应确认麻醉深度。在剃毛前将腹部润湿，以减少毛发污染。随后通过腹中线切口打开受体Wistar大鼠的腹腔。
- 将大鼠置于一块便携式不锈钢板（约120 × 300 mm）上，板中央有一矩形孔，覆盖24 × 50 mm的玻璃盖片。选择包含派伊尔结（Peyer's patches, PPs）的大约10 cm长的回肠节段用于观察。
- 尽可能保持肠道温暖，并用预热至37 °C的磷酸盐缓冲液（PBS）保持湿润。用于覆盖小肠的纱布应浸透PBS。
- 在持续使用2%异氟烷进行麻醉的同时（参见材料表）， 将载玻片置于显微镜载物台上，选择派伊尔结中高内皮微静脉（HEVs）穿过浆膜的区域作为微循环观察部位。派伊尔结大小不一，较大的结更适合使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察微循环。小肠局部并非直线状，应选择至少2 cm长、无张力的直线段进行观察。
- 用PBS浸湿的吸水棉覆盖相邻的肠段和肠系膜。将待观察的肠段置于两个卷起的棉球之间，并尽可能远离大鼠身体，以避免受到心跳和呼吸引起的振动干扰。
- 使用1 mL注射器，将CFSE标记的胸导管淋巴细胞（TDLs，1 × 108 个细胞）缓慢注入受体大鼠的颈静脉（注射时间超过1分钟）。快速静脉注射可能影响全身血液循环。
4. 淋巴细胞的微循环
- 使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）持续监测派伊尔集合淋巴结（PPs）微血管中的TDLs，并以30秒为间隔进行延时摄影，连续记录3小时。从浆膜到PPs中高内皮微静脉（HEV）的深度约为25 μm，可实现对基质及毛细淋巴管至30 μm深度范围内的观察。
- 向每只受体大鼠颈静脉注射Texas Red–dextran（25 mg/kg）以标记血流，同时注射Hoechst 33342（5 mg/kg）以染色细胞核。
- （可选）为量化淋巴细胞动态，将黏附于HEV超过30秒的淋巴细胞定义为“黏附性淋巴细胞”，从HEV迁移至基质的淋巴细胞定义为“迁移性淋巴细胞”。随后计算每视野（约0.3 mm2）内迁移率的平均百分比（迁移性淋巴细胞 / 黏附性淋巴细胞 + 迁移性淋巴细胞）。
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结果
从淋巴液中收集淋巴细胞
为进行胸导管插管，需在紧张的胸导管上做切口，如图1所示，然后将大鼠置于Bollman笼中，如图2所示。
当淋巴细胞收集充分时，可获得约 20 mL/6 h 的淋巴液，其中含有约 107～108/mL 淋巴细胞。在胸导管淋巴细胞（TDLs）中，70% 表达 CD4，其中约 90% 的细胞表达 CD62L，表明 TDLs 的主要成分（>60%）为初始型肠道趋向性淋巴细胞。由于此处收集的淋巴细胞是特异性迁移至肠道的细胞，因此适用于评估派伊尔集合淋巴结（Peyer's patches）中的迁移状态。
显微观察
注射适量荧光标记的淋巴细胞后，将受体大鼠的肠道如图3所示置于载玻片上。生理状态下派伊尔结（Peyer...
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讨论
本文描述了一种收集 naïve 肠道趋向性淋巴细胞并观察其在大鼠派伊尔集合淋巴结（Peyer's patches, PPs）中迁移的实验方案。这些方法能够揭示淋巴细胞在PP微血管系统中的运动方式，并可实现对正常状态或药物干预条件下其动态行为的直观比较。尽管观察时间仅限于数小时内，但对这些动态过程的直接观察对于获得某些药物免疫调节作用的线索具有重要意义。
我们在方法部分提到了一些技巧。其中，最精细的操作之一是操作者必须快速而准确地插管胸导管。如果手术耗时过长或造成不必要的损伤，将导致明显出血和炎症，进而因结缔组织水肿和胸导管阻塞而减少胸导管淋巴液（TDL）的收集量。过去，我们通常使用剪切刃较小的剪刀在胸导管上做一小切口后再进行插管。然而，该操作会因淋巴液流出而干扰插管部位。因此，目前我们不再切开胸导管，而是用锐利的刀尖直接刺入。此方法使插管更简便，并提高了成功率。此外，胸导管上的切口位置非常关键，因为腹腔空间有限。若切口位置过于靠近膈肌，则插管的弯曲部分容易与膈肌发生碰撞；若切口位置距离膈肌过远，又会因尾侧胸导管的淋巴丛而难以将插管插入足够深度以确保固定。即使插管成功，插管也容易因纤...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究得到了日本国立国防医学院的资助，以及日本厚生劳动省难治性疾病研究项目的研究经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| A1R+ | Nikon | 共聚焦激光扫描显微镜 | |
| 羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯 | Thermo Fisher Scientific | C1157 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| 异氟烷 | Wako Pure Chemical Industries | 099-06571 | |
| RPMI 1640 培养基 | GIBCO | 11875093 | |
| Texas Red–葡聚糖 | Thermo Fisher Scientific | D1863 |
参考文献
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重印与许可
