使用II导联记录麻醉小鼠的心电图

摘要

我们介绍一种在小型小鼠中技术上简便、成本低廉、快速且经济的ECG检测方案，并可实现更高的检测灵敏度。我们建议将该方法作为研究小鼠中药物作用、基因修饰及疾病模型的筛选手段。

摘要

心电图是评估心脏传导系统的重要工具。动物研究有助于获得有关心电图的新型遗传学和药理学信息。然而，在小动物（如小鼠）体内进行心电图测量一直具有挑战性。为此，我们采用了一种在麻醉小鼠中记录心电图的方法，该方法具有多种优势：技术操作简单、成本低廉、测量时间短，且适用于幼龄小鼠。尽管使用麻醉存在一定的局限性，但该方法仍可提高对照组与实验组之间比较的敏感性。我们使用自主神经系统激动剂和拮抗剂处理小鼠，以验证本方案的有效性，并将结果与既往研究报道进行比较。我们的ECG方案检测到：给予阿托品后心率和QTc间期增加；给予卡巴胆碱后心率和QTc间期降低；给予异丙肾上腺素后心率和QTc间期升高；而给予普萘洛尔后未观察到心电图参数的改变。这些结果与以往报道一致，证实了本ECG方案的可靠性。因此，该方法可作为一种筛查手段，用于原本因高成本和技术难度而难以实施的心电图测量。

引言

心电图（ECG）是一种测量心跳电活动的检测方法，是评估心脏传导系统的重要工具。ECG测量的参数包括心率、PR间期、QRS波群持续时间和QT间期。简而言之，PR间期代表电冲动从心房窦房结经房室结传导至浦肯野纤维所需的时间；QRS波群持续时间反映电冲动通过浦肯野系统和心室肌引起心室去极化所需的时间；QT间期则为心室复极化的持续时间。

小鼠心电图记录已帮助研究人员检查心脏功能，并确定心律失常、心房颤动和心力衰竭等心脏表型的生理和病理生理机制。大多数心血管研究涉及基因工程小鼠模型的研究。获取经过基因操作的小型小鼠的心电图记录中有意义的数据常常具有挑战性。

有多种方法可用于小鼠心电图（ECG）的检测¹。研究表明，在可能的情况下，优先选择清醒状态下的动物进行心电图记录，因为麻醉对心脏功能的影响已有充分证实²。目前有两种用于清醒小鼠心电图记录的方案值得注意¹。心电遥测系统是用于清醒小鼠长期连续心电监测的金标准^1,3。尽管该方法可在清醒状态下进行记录，但其存在若干局限性，包括设备和植入物成本高昂、需要操作经验极为丰富的人员、术后稳定期超过1周、要求使用体型较大的小鼠（> 20 g），以及仅能获取单导联的心电图记录¹。另一种系统则采用嵌入平台内的 paw-sized 导电电极，可在无需麻醉或手术植入的情况下实现清醒小鼠的心电图记录^1,4。这种非侵入性系统在无法使用遥测系统时可作为替代方法，具有多项优势：无需外科手术处理、无需麻醉、每只小鼠的检测成本较低（仅初始设备投入较高）、测量耗时短，并且适用于新生小鼠^1,4。该系统的主要缺点是不适用于长期连续监测¹。

本文介绍了一种在麻醉小鼠中进行心电图记录的低成本、简便且快速的新方法，并通过在心脏传导系统的自主神经阻断/刺激后进行心电图记录，验证了该方法的有效性和敏感性。我们建议将此心电图方法用于筛选药物、基因修饰以及小鼠疾病模型的影响。

方案

所有动物实验程序均经庆熙大学实验动物照护与使用委员会批准（许可证编号：KHUASP(SE)-18-108），并符合美国国立卫生研究院《实验动物照护与使用指南》的要求。

1. 实验动物

1. 根据《实验动物护理和使用指南》的要求，将所有小鼠（39只，Balb/c，雄性，7‒9周龄）饲养于无病原体环境中。
2. 将小鼠置于12小时光照/12小时黑暗循环条件下，保持恒定温度，并可自由获取食物和饮水。

2. 麻醉剂的制备

注意：与氯胺酮类组合物和异氟烷相比，三溴乙醇在小鼠麻醉过程中能更稳定地维持心率，并提高超声心动图检测结果的可重复性，因此优先选用三溴乙醇^1,5,6

1. 配制2,2,2-三溴乙醇储备液：每1 mL叔戊醇中加入1 g 2,2,2-三溴乙醇，于40‒45 °C温育24小时。4 °C保存，可稳定保存12个月。
2. 工作液的配制：取0.5 mL储备液，加入19.5 mL生理盐水（0.9% NaCl），稀释至终浓度为25 mg/mL，于40‒45 °C温育1小时。4 °C保存，可稳定保存1个月。

3. 心电图系统设置

1. 确保在2米范围内无噪音或振动，因为小鼠的ECG信号对环境噪声和运动非常敏感。
2. 准备硬件设备：数据采集系统、生物放大器以及安装有ECG数据分析软件的计算机。
   1. 使用电源线将数据采集系统连接至交流电源。
   2. 使用USB线将数据采集系统连接至计算机。
   3. 使用信号线将生物放大器后侧面板上的信号输出端连接至数据采集系统前面板上的模拟输入端口。
   4. 使用I²C线将数据采集系统的I²C输出端连接至生物放大器的I²C输入端。
   5. 将三导联生物放大器线缆连接至生物放大器前面板上的6针输入插座。
   6. 使用背面的开关打开数据采集系统。
      注：简而言之，信号通过生物放大器放大，并使用计算机化的数据采集与分析系统进行记录，其通道设置如下：采样率为2 k/s，量程为20 mV，低通滤波器设置为200 Hz。
3. 打开分析软件程序，并设置为ECG数据采集模式。
   1. 进入 设置 | 通道设置。将 采样率 设为2 k/s，将 量程 设为20 mV，将 输入放大器 设置为200 Hz低通滤波。
   2. 进入 ECG分析 | ECG设置。在检测与分析预设中选择“小鼠”。
   3. 在平均值面板中，选择将N个（例如4个心跳或60秒）连续的心动周期合并为单个平均信号，用于平均视图和表格视图。
   4. 在QTc面板中，选择“Bazett”方法，该方法定义为QT间期的心率校正值：QTc = QT / (RR/100)^0.5，RR间期 = 60 / 心率⁷。

4. 心电图测量

1. 将小鼠置于精密天平上，记录其体重。
2. 通过腹腔（i.p.）注射三溴乙醇工作液诱导小鼠麻醉（每千克体重注射 18 mL 工作液）。
3. 将麻醉后的小鼠仰卧放置，确保小鼠已完全麻醉（通常少于 2 分钟）。
4. 按照 II 导联心电图（ECG）连接方案，将带有针灸针的电极皮下插入小鼠右前肢、左前肢和左后肢，并用胶带固定（图 1）。确保实验过程中电极插入的深度和位置保持一致。
5. 将电极另一端通过卡扣连接至三导生物放大器线缆另一端的三个扣式连接器上。
6. 在给予麻醉剂 3 分钟后，进行药物腹腔注射（i.p.）（图 2）。
7. 在注射麻醉剂 10 分钟后开始记录心电图信号。记录完成后，使用注射麻醉剂后 12 至 17 分钟期间的 ECG 数据进行分析。
8. 心电图记录结束后，小心移除电极。

5. 心电图数据分析

1. 进入ECG Analysis | Averaging View，并确保软件正确识别每个心动周期中P波、QRS波群和T波的起始与终止位置。如有必要，可通过将错位的游标移动至正确位置，对手动校正这些波形和间期进行调整。
   注意：如图3A所示，PR间期从P波起始点延伸至QRS波群起始点（小鼠心电图中通常缺乏Q波）。QRS时限从Q波起始点（小鼠心电图中主要为R波）延伸至S波终点。QT间期从Q波起始点（小鼠心电图中主要为R波）延伸至T波终点。请注意，与人类心电图相比，小鼠心电图中的波形持续时间更短，且缺乏Q波和ST段⁸。
2. 进入ECG Analysis | Table View，在Averaging View窗口中勾选已正确识别的心电图数据，以选择有效的心电数据。
   注意：图3展示了多个实际的小鼠心电图信号示例。图3A为一个正常野生型信号，其P波、QRS波群和T波均被准确识别。计算机自动识别PQRS波时可能出现错误定位，例如图3B中正常野生型信号的P波起始点被错误标记；图3C中QRS波群终点被错误标记，导致QRS时限被高估；图3D中由于T波不明确，QRS波群终点被错误标记，导致QRS时限被低估；图3E中心电图信号的T波无法识别。若不加以排除或手动校正，PQRS间期可能被高估或低估。因此，应仅选择P波、QRS波群和T波均被准确识别且未遗漏目标波峰的信号。综上所述，B、C、D和E类情况（图3）在准确估算心电参数时通常应予以排除。
3. 在Table View中选择感兴趣的心电图数据，并将其复制/粘贴至电子表格文件中。

6. 统计分析

1. 使用统计学软件进行统计分析。对实验条件设盲后进行数据分析。两组比较时采用 Student’s t-检验和 Mann-Whitney U 检验。各图中的数字表示每组所使用的小鼠数量。结果以均值 ± 标准误（SEM）表示。
2. 根据 U 检验，将 p < 0.05 的差异视为具有统计学显著性：*，p < 0.05；**，p < 0.01；***，p < 0.005，相对于相应的对照组。

结果

药理学实验

为了确定我们的无创心电图测量是否能够反映自主神经调节对心脏传导系统的影响，我们对正常的Balb/c小鼠给予了自主神经系统（ANS）的激动剂和拮抗剂进行干预。分别使用阿托品和卡巴胆碱以实现副交感神经的阻断和刺激，而分别给予普萘洛尔和异丙肾上腺素以引起交感神经的阻断和刺激⁹。

与对照剂组相比，阿托品处理组（p < 0.05）和异丙肾上腺素处理组小鼠（p < 0.05）的心率显著升高，而卡巴胆碱处理组心率下降（p < 0.005）（对照剂组：391 ± 13 bpm 对比阿托品组：487 ± 15 bpm 对比卡巴胆碱组：158 ± 7 bpm；对照剂组：382 ± 14 bpm 对比异丙肾上腺素组：548 ± 8 bpm；对照剂组：404 ± 25 bpm 对比普萘洛尔组：303 ± 16 bpm）（图4）。...

讨论

该实验方案中有多个关键步骤。周围环境应无噪音和振动干扰。心电图电极必须稳定且一致地插入皮下，此插入步骤需要通过预实验反复练习，直至研究人员具备足够的技术经验。此外，麻醉剂应正确配制并妥善保存，并以适当的剂量使用。最后，在“平均视图”窗口中，应准确定位每次心电图搏动中的PQRS波。

我们的研究包括药物测试。然而，如果省略药理学测试，则可在注射麻醉剂5分钟后开始记录，心电图数据可采用10至15分钟期间的数据。麻醉后15分钟内心电图数值相对稳定，且在同一小鼠中，首次测量6小时后的心电图结果具有可重复性⁵。

药物对自主神经的阻断和刺激会引起心率的不同反应。在心电图研究中已采用多种实验方案。根据小鼠遥测心电图记录，阿托品、异丙肾上腺素和普萘洛尔对心率无显著影响，而卡巴胆碱则显著降低心率（野生型：739 ± 33 次/分钟；阿托品：726 ± 5 次/分钟；卡巴胆碱：205 ± 54 次/分钟；异丙肾上腺素：722 ± 32 次/分钟；普萘洛尔：560 ± 21 次/分钟）

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2,2,2-三溴乙醇	Sigma-Aldrich	T48402-25G	麻醉剂，Avertin
动物	Japan SLC, Inc., 静冈，日本		Balb/c 小鼠，雄性，7-9 周龄
阿托品	Sigma-Aldrich	A0123	副交感神经拮抗剂
BioAmp	AD Instruments, 贝拉维斯塔，澳大利亚	ML132	生物放大器
卡巴胆碱	Sigma-Aldrich	C4382	副交感神经激动剂
带电极的针灸针	DongBang Acupuncture Inc., 城南，韩国	DB106	0.20 × 15 mm
异丙肾上腺素	Sigma-Aldrich	I2760	交感神经激动剂
LabChart 8	AD Instruments, 贝拉维斯塔，澳大利亚		数据分析软件
小鼠饲料	LabDiet, 圣路易斯，密苏里州，美国	5L79	小鼠饮食
PowerLab 2/28	AD Instruments, 贝拉维斯塔，澳大利亚		数据采集系统
普萘洛尔	Sigma-Aldrich	P0884	交感神经拮抗剂
SPSS Statistics 程序	SPSS	SPSS 25.0	统计学程序