荧光染料标记脂质体的体内组织特异性细胞摄取的制备、给药与评估

摘要

本实验方案的目的是合成荧光标记的脂质体，并利用流式细胞术在细胞水平上鉴定脂质体在体内的定位情况。

摘要

人们日益关注利用脂质体在体内递送化合物，特别是用于靶向治疗策略。根据脂质体的配方不同，其在体内可能被不同类型细胞优先摄取。这可能会影响治疗颗粒的疗效，因为不同疾病的进展具有组织和细胞类型的特异性。在本方案中，我们介绍一种使用DSPC、胆固醇、PEG-2000 DSPE以及脂质染料DiD作为荧光标记物合成并荧光标记脂质体的方法。本方案还介绍了一种在体内递送脂质体并通过流式细胞术评估细胞特异性摄取脂质体的方法。该方法可用于确定摄取脂质体的细胞类型，并量化脂质体摄取在不同细胞类型和组织中的分布及比例。尽管本方案未提及，但额外的实验方法，如免疫荧光以及流式细胞仪上的单细胞荧光成像，可进一步加强所得结果或结论的可靠性，因为这些方法允许评估细胞内染色情况。此外，根据所研究的具体组织，可能还需对方案进行相应调整。

引言

随着人们对开发基于纳米颗粒药物递送疗法的兴趣日益增长，制备和评估颗粒分布与摄取的方法也必须持续进步、拓展，并向科研界开放^1,2。本实验方案旨在评估在体内给予装载了tesaglitazar（一种过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）-α/γ激动剂）的DiD标记脂质体后，哪些确切的细胞类型摄取了这些脂质体^3,4。通过这些研究，我们能够确定哪些细胞类型直接受到脂质体包裹的tesaglitazar治疗的影响，评估靶向基团的有效性，并提出假说以解释我们观察到的治疗结果。此外，已有研究表明多种细胞类型具有特定的生物学功能，提示巨噬细胞、树突状细胞以及肝脏特异性的库普弗细胞等吞噬性细胞会摄取大部分脂质体^5,6,7。利用本方案，我们已证实非经典吞噬细胞同样能够摄取脂质体^3,4。

本方案介绍了一种优化的tesaglitazar溶解方法，通过逆相蒸发法制备脂质体，并使用醋酸钙作为远程药物装载的吸引剂。所介绍的方法适用于大多数实验室，无需难以获取的材料，也不涉及高温操作步骤。该方案制备的脂质体粒径适合体内延长循环时间⁸。此外，正如Su等人总结的，迄今为止，针对脂质体在体内的分布及组织摄取的评估方法已得到深入研究和验证⁹。正电子发射断层扫描（PET）、磁共振成像（MRI）和荧光分子断层成像（FMT）等技术已被用于定量分析组织特异性的生物分布与摄取情况^9,10,11。尽管这些技术已优化以最大限度提高体内检测灵敏度，但仍缺乏在细胞分辨率水平上定量测定脂质体体内摄取的能力。本文所述方案旨在通过流式细胞术来满足这一需求。最后，在本方案中，细胞摄取的研究聚焦于少数几种组织，包括脂肪组织。目前已有越来越多的文献探讨纳米颗粒在肥胖、代谢紊乱和炎症等疾病背景下用于递送治疗药物的潜力^{12,13,14,15,16,17}。因此，我们认为分享一套有效处理和分析脂肪组织的方法流程尤为重要，因为脂肪组织在这些病理过程中发挥着关键作用。

方案

本方案中的所有步骤均经弗吉尼亚大学动物护理与使用委员会批准，并遵循其指南。

注意：在脂质体给药前，应考虑后续分析步骤中一些重要的对照，这些对照总结于表1中。

1. 制备荧光标记的脂质体，包载乙酸钙和特斯格列他

1. 将DSPC（1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱）、胆固醇、PEG-2000-DSPE和DiD混合。具体方法为：将DSPC、胆固醇和PEG-2000-DSPE按质量比2:1:1混合。加入DiD脂质染料，浓度为每1 mL脂质体中加入1 mg DiD（DSPC:DiD的摩尔比为46:1）。
   注意：DiD是1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青染料的标准缩写。由于其具有两条与本配方中所用DSPC长度相同的十八烷基"脂肪尾链"，因此主要嵌入脂质膜中。DiO、DiD和DiI等脂质染料在脂质体研究中常规使用⁸，并被认为是非交换性的¹⁸。
2. 使用20 mL闪烁瓶进行反相乳化及脂质体制备。在该瓶中，将脂质的乙醚-氯仿溶液（2:1）与水相乙酸钙（Ca-乙酸盐，1 M，pH 7.4）混合。有机相与水相的体积比应为4:1，例如4 mL有机相与1 mL水相。
3. 在室温下对脂质的乙醚-氯仿溶液进行超声乳化，持续30秒。使用½英寸探头，超声仪设置为20 kHz、50%功率。
   注意：超声过程中探头尖端应靠近瓶底，以避免起泡。探头尖端不得接触玻璃，以免破裂。此外，氯仿需作为共溶剂加入乙醚中：在胆固醇存在下，仅使用乙醚的乳液会迅速分层，导致该步骤无法进行。
4. 立即将含有均质化水包油乳液的瓶子置于配备专用接头、压力计和压力调节阀的旋转蒸发仪上。旋转蒸发仪应连接真空管线以去除有机溶剂。设定转速为100 rpm，真空度为0.5 atm；若乳液起泡严重，则适当释放真空。当凝胶形成并消失后，将真空度提高至0.9 atm。
   注意：在去除挥发性有机相过程中，应逐步调节真空度，以避免快速起泡导致瓶内物质进入旋转蒸发仪主体而损失。当乙醚和氯仿部分蒸发，水相与有机相的体积比接近1:1时，会形成凝胶。蒸发应持续进行，直至凝胶消失，剩余水相介质再次完全变为液态。额外搅拌有助于加速有机溶剂的去除。可通过在蒸发瓶中放入聚四氟乙烯搅拌子，以增强旋转蒸发过程中黏稠凝胶的对流。
5. 使用核孔径聚碳酸酯膜过滤所得脂质体，以获得均一的粒径分布。
   1. 使用配备两个气密注射器的脂质体挤出器，将脂质体水分散液反复多次通过200 nm孔径的聚碳酸酯滤膜进行过滤。
      注意：建议使用较小的注射器（如0.5 mL），以确保产生足够的过滤压力。由于脂质体膜中胆固醇含量较高，无需高温，该步骤可在室温下进行。进行奇数次过滤（如21次），以确保最终产物位于滤膜的另一侧。若已预灭菌，则可收集无菌的、经滤膜调整粒径的脂质体样品。所得脂质体的粒径通常接近所选滤膜的孔径。可叠加使用两个滤膜（而非一个）以精细调节至更小的粒径。
   2. 使用动态激光光散射（DLS）^3,4验证粒径分布。
      1. 向一个四面透明的1 cm比色皿中加入1至3 mL生理盐水，再加入10–20 µL脂质体，小心混匀。将样品放入仪器中，选择以下参数进行测量：溶剂黏度、折射率、脂质的折射率。点击开始按钮。测量将持续数分钟，包含100次或更多次重复。
6. 使用脱盐离心柱去除外部的Ca-乙酸盐。取一半样品，加入含tesaglitazar的水溶液至10 mM HEPES缓冲液（pH 7.4）中，并在37 °C下混合孵育1小时。将另一半样品作为不含药物的对照脂质体制剂。
   注意：使用前，先用10 mM HEPES缓冲液（pH 7.4）对2 mL脱盐离心柱进行预平衡。具体操作为：向柱中加入1 mL HEPES缓冲液，在离心机中以1000 x g离心2分钟，弃去穿过滤液，重复此步骤四次。
7. 使用2 mL离心柱去除脂质体中未包封的tesaglitazar，并通过分光光度法测定包封药物的浓度。
8. 向干燥的柱床中加入不超过0.5 mL的脂质体样品，待样品完全进入凝胶后，以与之前完全相同的条件（1000 x g，2分钟）离心，并收集穿过滤液中已去除小分子质量化合物的脂质体样品。
9. 使用DLS和结合DLS-电泳光散射（ELS）系统^3,4在10 mM HEPES缓冲液（pH 7.4）、25 °C条件下，测定最终颗粒的特征：粒径和浓度以及zeta电位。
   1. 与步骤1.5.2类似，使用一次性鲁尔注射器或剪去尖端的移液枪，将脂质体分散液用测量缓冲液（如每1 mL缓冲液中加入10 µL脂质体）稀释后装入U形比色皿。确保“U”形管内无气泡，以保证电流路径连续。
   2. 将比色皿放入仪器中（请注意比色皿的前后方向，以确保电极与仪器正确连接）。关闭仪器门；随后在引导软件控制下自动进行测量（含多次重复）。

2. 准备用于体内给药的脂质体

1. 在生物安全柜中，将脂质体用无菌生理盐水稀释至适当浓度，终体积为 50 µL，用于体内给药。
   注意：在之前的研究中，我们的脂质体制剂含有 2 mg/mL 的 tesaglitazar，相当于约 4.89 µmol tesaglitazar/mL，我们以每公斤小鼠体重 1 µmol 药物的剂量给予脂质体。对于一只 40 g 的小鼠，需取 8.2 µL 脂质体，用生理盐水定容至终体积 50 µL。应使用动态光散射/电泳光散射（DLS/ELS）对载药脂质体和载对照溶剂脂质体的单位体积内脂质体数量进行定量，以确保每克小鼠体重所给予的对照溶剂脂质体数量与载药脂质体相等。
2. 在生物安全柜中，将脂质体溶液吸入 27 G 针头中。保持该溶液在室温下，以避免将低温溶液注入小鼠体内。

3. 通过眶后静脉注射施用脂质体

注意：也可采用其他方法进行静脉注射，例如尾静脉注射（如更倾向使用该方法）。虽然本方案未涵盖此方法，但已有已发表的方案对此进行了解释¹⁹。

1. 准备递送脂质体的工作区域。
   1. 使用70%乙醇清洁工作台面。确保所选空间可使用异氟烷麻醉系统。
   2. 打开加热垫，并在其上放置干净的垫子或毛巾，以使小鼠处于清洁表面。在开始操作小鼠前，留出足够时间让垫子预热。
   3. 设置麻醉系统，使麻醉诱导舱靠近，并将鼻罩置于加热垫上。
      1. 确保系统的其他所有部分均已准备就绪（例如，蒸发器中的异氟烷液位足够，活性炭过滤器已称重，管路连接正确）。
   4. 收集本实验步骤所需的其他材料：眼科润滑凝胶、用于给药后处理的局部麻醉剂、无菌纱布垫。
2. 在诱导舱中使用异氟烷对小鼠进行镇静。当小鼠对轻柔的足部轻触无反应时，迅速将其转移至操作区域，并通过鼻罩维持镇静状态。
   注意： 在继续操作前，应将动物维持在1.5%至2.5%的异氟烷浓度，并评估其麻醉深度是否适当（通过检测对 脚趾夹捏无反应）。
3. 将小鼠侧移以便进行脂质体给药。由于小鼠在麻醉期间不会眨眼，需在双眼涂抹少量眼科润滑剂，以在整个操作剩余过程中保持眼球湿润。
4. 轻轻按压暴露的眼部上下方的皮肤。眼球应略微突出于面部平面。
5. 将针头尖端小心插入内眦处，确保针头位于眼球下方且不接触眼球。一旦针头插入眼球后方区域，缓慢将脂质体注射至眶后腔。 拔出针头后，可能需要闭合眼睑数秒以实现止血。
   1. 若针头插入深度不足，溶液可能从眼部周围溢出。一旦观察到此现象，应立即停止注射，并重新调整针头位置。
6. 在眼部使用局部麻醉剂（如丙帕卡因），以预防操作后疼痛和不适。
7. 将小鼠留在加热垫上并持续监测，直至其苏醒，以确保其状态良好并维持正常体温。
8. 将小鼠放回其笼具及正常饲养环境中，直至达到目标观察时间点。
   注意：此操作应符合当地IACUC指南要求。

4. 准备组织收获、组织处理和流式细胞术染色所需材料

1. 准备用于组织收获、处理和染色的溶液（第5‒7节）：磷酸盐缓冲液（PBS）-肝素、HEPES缓冲液、2 mg/mL I型胶原酶、AKC裂解缓冲液、FACS缓冲液、PBS、固定缓冲液（表2）。除固定缓冲液外，所有溶液在操作过程中均需置于4 °C或冰上保存。
2. 准备用于组织收获和处理的带缓冲液及其他材料的离心管。
   1. 每只小鼠取血时，向一个1.5或1.7 mL微量离心管中加入10 µL 0.5 M EDTA，用于收集血液。EDTA可防止血液凝固。同时需要一个带25 G针头的1 mL注射器和一个15 mL锥形管。
   2. 对于脾脏，准备一个含1 mL HEPES缓冲液的1.5或1.7 mL微量离心管、一个1 mL注射器、两个50 mL锥形管，以及每份脾脏样品配两个70 µm滤器。
   3. 对于每种脂肪组织储存部位，每只小鼠每种脂肪组织类型需准备一个含1.5 mL HEPES缓冲液的20 mL聚乙烯瓶用于组织剪碎，另配一个50 mL锥形管和一个70 µm滤器。
3. 准备组织收获的工作区域。
   1. 用70%乙醇清洁实验台面。准备一个橡胶托盘用于固定小鼠，先用70%乙醇清洁托盘，并铺上吸水垫或纸巾。确保至少备有5枚固定针可供使用。
   2. 用PBS-肝素填充一个10 mL注射器，并安装25 G针头用于灌注。
   3. 收集组织收获过程中所需的工具和材料。需要准备两对镊子、剪刀、纸巾、无尘擦拭纸、含EDTA的微量离心管、含HEPES缓冲液的微量离心管，以及含HEPES缓冲液的聚乙烯瓶。

5. 收集组织

1. 通过 CO 处死小鼠₂ 窒息。不要进行颈椎脱臼，因为这可能会妨碍后续步骤中的有效采血和组织灌注。
2. 在清洁且具有充足操作空间和照明的工作台区域，放置橡胶解剖托盘、用于存放样本的冰桶，以及装有70%乙醇的喷雾瓶。用70%乙醇喷洒小鼠体表，以减少污染并控制毛发扩散。将小鼠仰卧置于橡胶托盘上，用大头针固定其四肢，使其向外展开并远离身体。
3. 为采集血液做准备，小心地在小鼠肋骨末端边缘的皮肤处做一切口。朝小鼠头部方向切开一条约1 cm长的小而笔直的切口，直至暴露胸肌。
   1. 在初始切口位置，沿朝向头部的方向做两个垂直于切口线的小切口。然后，仔细剥离暴露区域肋骨一侧的胸大肌。这有助于更好地暴露并观察进针位置。
   2. 采集血液时，将针头插入第三和第四肋骨之间的侧面 去除肌肉组织。由于小鼠心脏位于胸腔中央，应尽量将针头靠近肋骨的中线位置。插入后，轻柔地回拉注射器活塞，开始采集血液。
   3. 采集后，立即将血液转移至预先准备好的含EDTA的微量离心管中，并置于冰上保存。
      注意：若吸取约100 µL液体但未见血液进入注射器，可尝试将注射器向右或向左旋转，以防针尖紧贴心脏壁。若此操作无效，可缓慢将针头进一步插入胸腔或开始撤出。若此时血液开始在注射器内积聚，应继续缓慢回抽注射器活塞。可考虑旋转注射器和针头以成功获取血液。最后，若仍无法采集到血液，应撤出针头，因其可能未刺入心脏。可尝试重新插入针头，并重复上述操作过程。
4. 接下来，为了灌注小鼠，需打开胸腔以暴露心脏。
   1. 为此，沿肋骨末端向小鼠体侧两侧剪开皮肤。然后用镊子将胸骨提起，使其远离操作台面。在胸骨末端稍下方做一个小而浅的切口，以切开腹膜腔。沿小鼠两侧肋骨末端方向切开腹膜。此操作应暴露肝脏和胆囊。注意避免切伤这两种组织。
   2. 接下来，在肝脏上方的膈肌处做一个小而浅的切口。然后沿肋骨边缘切开膈肌，以打开胸腔。注意避免切到胸腔内的任何器官。
   3. 沿小鼠肋骨向头部方向做两个切口，切口位于中线两侧约2-3 mm处，长度约0.75 cm。
      注意：若切割位置过高，会切断位于胸廓顶部的动脉，从而影响灌注效果。
   4. 将肋骨笼的中央部分向后抬起，以暴露胸腔。移开任何脂肪或组织，以便暴露心脏。
   5. 在小鼠心脏的右心房上做一个小切口，以形成一个开口，用于挤出血液。
   6. 使用一个装有PBS-肝素的10 mL注射器，将针头插入小鼠心脏的左心室。
   7. 缓慢地将 PBS 尽可能轻柔地推入心脏。
      注意：应观察到血液从右心房流出并充满胸腔。务必保持心脏处于其生理位置，以避免抑制PBS-肝素经主动脉从心脏流出。
   8. 当10 mL PBS-肝素溶液完全灌注小鼠后，丢弃注射器和针头，并使用纸巾或无绒擦拭布清除胸腔内多余的血液和PBS-肝素溶液。
5. 接下来，开始提取组织时，沿小鼠尾部方向切开皮肤和腹膜，以打开腹腔。
6. 首先，从每侧小鼠身上取出腹股沟脂肪组织垫。
   注意：请仔细阅读此操作流程：务必从每个部位中分离出腹股沟淋巴结，以避免影响结果中脂肪组织的细胞组成。
   1. 用另一把镊子夹住腹膜，同时用这把镊子夹住该侧腹膜上方覆盖的皮肤边缘。轻轻将皮肤从腹膜上拉开，以分离这两层组织。沿皮肤寻找腹股沟脂肪组织库。将皮肤外缘固定，以便更好地暴露脂肪组织库。
   2. 在提取前，先在脂肪组织中央找到腹股沟淋巴结，必要时用镊子和剪刀将其移除。
      注意：如果可能，找到从储脂区外缘向中心延伸的三条较大的动脉。淋巴结位于这些动脉汇合处附近。
   3. 切除淋巴结后，用镊子夹住靠近固定点的脂肪组织末端，小心地在脂肪组织与皮肤之间的结缔膜处进行小切口。在切割的同时将脂肪组织从皮肤上抬起，以更充分地暴露结缔膜，确保完整取出整个脂肪组织。
   4. 将脂肪组织置于预置的聚乙烯小瓶中，加入HEPES缓冲液并置于冰上，以在后续收获过程中保持组织活性。
   5. 重复此操作以获取小鼠另一侧的脂肪组织。脂肪组织可合并消化处理，也可分别处理。若需分别处理每个脂肪组织，则需准备更多离心管。
7. 接下来，从腹腔尾侧端分离附睾脂肪组织。用镊子轻轻将第一块附睾脂肪组织从小鼠背侧拉开，找到附着于该脂肪组织上的附睾和输精管。
   注意：附睾脂肪组织有两个储存部位：分别附着于每侧附睾和输精管。
   1. 仔细在脂肪组织库与附睾及输精管之间进行切割，以将脂肪组织与其他组织分离。将分离出的脂肪组织置于含有HEPES缓冲液的聚乙烯小管中，并置于冰上，以在后续取材过程中保持组织活性。
8. 最后，取出位于胃左侧靠近膈膜的脾脏。用镊子轻轻将胃向腹腔中央牵拉，以暴露脾脏。
   1. 轻轻握住脾脏的一端，将其略微从胃部移开。剪开脾脏与其周围组织之间的膜，直至将器官完全分离。将脾脏放入预先准备好的含HEPES缓冲液的微量离心管中，并置于冰上保存。
9. 在处理下一只小鼠的组织或采集其组织之前，丢弃尸体以及任何被污染的纸巾或垫料，并擦拭工具。
   注意：如果有多只小鼠，在进行下一步处理之前，需对每只小鼠重复上述取材步骤。若包含对照组小鼠，建议先采集对照组小鼠样本，再采集脂质体处理组小鼠样本，以避免任何可能的污染。

6. 处理组织

注意：由于脂肪组织消化孵育时间较长，建议首先开始该步骤，并在消化期间同时处理血液和脾脏样本。

1. 首先，切碎并消化脂肪组织。使用一至两把剪刀，将每个聚乙烯小瓶中的脂肪组织剪碎，直至组织成为小于 0.5 mm 的小块。这有助于更高效地进行消化。
   1. 当所有小瓶中的组织均被剪碎后，向每个小瓶中加入 1.5 mL 浓度为 2 mg/mL 的胶原酶缓冲液。将小瓶置于设定为 37 °C 和 150 rpm 的摇床培养箱中，孵育 30 至 45 分钟。
      注意：如果脂肪组织特别大，可考虑向小瓶中额外加入 0.5 mL 至 1.5 mL HEPES 缓冲液以及等体积的胶原酶缓冲液，以确保组织完全浸没并含有足够的酶。无论最终溶液体积如何，消化时 I 型胶原酶的终浓度应为 1 mg/mL。此外，若无摇床培养箱，可将样品置于 37 °C 水浴中，并每 5 分钟轻轻振荡一次，以混合并重悬消化液。
   2. 在 30 分钟时检查样品。使用 1 mL 移液器反复吹打样品。如果组织块仍过大而不易移液，将样品放回培养箱继续孵育 15 分钟。
   3. 当样品完全消化后，再用移液器反复吹打 10 次，以确保形成单细胞悬液。
      注意：（可选）在 30 分钟时检查样品。使用 1 mL 移液器反复吹打样品。如果组织块仍过大而不易移液，将样品放回培养箱继续孵育 15 分钟。
   4. 将细胞悬液通过 70 µm 滤膜过滤至 50 mL 锥形管中。向空的消化小瓶中加入 5 mL FACS 缓冲液以清洗小瓶，并将此洗涤液通过滤膜加入细胞悬液中。
   5. 在其他样品处理期间将样品置于冰上保存。当所有样品均过滤完成后，在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 5 分钟。
   6. 通过抽吸去除脂肪细胞上清液，然后小心抽吸脂肪细胞上清液与沉淀之间的下层液体，保留基质血管组分（SVF）沉淀。
   7. 将沉淀重悬于 1 mL FACS 缓冲液中，并转移至洁净的 1.5 或 1.7 mL 微量离心管中。如需要，可在此时分装细胞。将样品置于冰上，直至所有样品准备进行流式细胞术染色。
      注意：若消化的脂肪库较大，可考虑仅使用样品的 50% 或 25% 进行流式细胞术染色与分析。此外，若需要为流式细胞术分析准备荧光减一（FMO）对照或其他额外对照（表 1），请务必分装额外样品至单独的管中进行处理。FMO 对照用于在实验所用完整抗体组合中，区分单个荧光标记抗体的阴性与阳性信号。
2. 其次，处理血液。
   1. 将 50 µL 血液转移至 15 mL 锥形管中。
   2. 向每管中加入 1 mL AKC 裂解缓冲液，并反复吹打以获得单细胞悬液。再向每管中加入 4 mL AKC 裂解缓冲液，孵育 5–10 分钟。如有摇床或旋转仪，应将管盖密封牢固后置于设备上以增强混合效果。
   3. 加入 5 mL FACS 缓冲液以终止裂解反应，并在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 5 分钟。弃去上清液并检查沉淀。若沉淀仍呈明显红色，则重复裂解步骤。否则，将沉淀重悬于 1 mL FACS 缓冲液中，并转移至洁净的 1.5 或 1.7 mL 微量离心管中。将样品置于冰上，直至所有样品准备进行流式细胞术染色。
3. 最后，处理脾脏。将脾脏转移至置于 50 mL 锥形管上方的 70 µm 滤膜上。用 1 mL FACS 缓冲液冲洗组织，然后使用 1 mL 注射器的推杆端将脾脏研磨并通过滤膜。在整个研磨过程中，使用更多 FACS 缓冲液将细胞冲洗入 50 mL 锥形管中。锥形管中的最终体积应为 10 mL。
   1. 在 4 °C 条件下以 300 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于 1 mL AKC 裂解缓冲液中。再加入 4 mL AKC 裂解缓冲液，孵育 5 分钟。加入 5 mL FACS 缓冲液以终止裂解反应，并在 4 °C 条件下以 300 × g 离心 5 分钟。
   2. 弃去上清液，将沉淀重悬于 1 mL FACS 缓冲液中。将悬液通过第二个洁净的 70 µm 滤膜过滤至 50 mL 锥形管中。加入 4 mL FACS 缓冲液冲洗原管，并将冲洗液通过滤膜，最终体积为 5 mL。
   3. 将 50 µL 细胞悬液转移至洁净的 1.5 或 1.7 mL 微量离心管中，并置于冰上，直至所有样品准备进行流式细胞术染色。如需或需要更多样品，可将额外分装液转移至其他管中。
      注意：脾细胞是进行活/死单染对照的理想细胞。建议额外分装一份样品用于此对照。

7. 对组织来源的细胞进行染色以用于流式细胞术

1. 在 400 × g、4 °C 条件下离心分装的样品 5 分钟。
2. 弃去上清液，将样品重悬于 50 µL Fc 封闭液（已稀释）中（表 2），冰上孵育 5 分钟。
3. 向每个样品中加入 50 µL 2 倍浓度的抗体混合液（表 3），冰上避光孵育 20 分钟。
   注意：任何单染样品均不应使用此抗体混合液染色。此外，若需使用荧光减一对照（FMO），必须单独配制相应的 FMO 抗体混合液。
4. 用 1 mL PBS 洗涤样品，在 400 × g、4 °C 离心 5 分钟。弃去上清液，将样品重悬于 200 µL 活性染料中（表 3），冰上避光孵育 20 分钟。
   注意：在此步骤中，切勿遗漏之前预留用于活/死细胞单染的样品。
5. 用 1 mL FACS 缓冲液洗涤样品，在 400 × g、4 °C 离心 5 分钟。弃去上清液，除活/死细胞单染样品外，其余样品重悬于 50 µL 固定液（试剂 A）中以固定细胞，室温避光孵育 15 分钟。
   1. 将活/死细胞单染样品重悬于 100 µL 2% 多聚甲醛（PFA）中，室温避光孵育 5 分钟。
   2. 用 1 mL FACS 缓冲液洗涤样品，在 800 × g、4 °C 离心 5 分钟。弃去上清液，将样品重悬于 250 至 500 µL FACS 缓冲液中，4 °C 保存，待上流式细胞仪检测。
6. 用 1 mL FACS 缓冲液洗涤样品，在 800 × g、4 °C 离心 5 分钟。弃去上清液，将样品重悬于 50 µL 穿膜液（试剂 B）中，并加入针对胞内蛋白的抗体。室温避光孵育 20 分钟。
7. 用 1 mL FACS 缓冲液洗涤样品，在 800 × g、4 °C 离心 5 分钟。弃去上清液，将样品重悬于 100 µL 2% 多聚甲醛（PFA）中，室温避光孵育 5 分钟。
8. 用 1 mL FACS 缓冲液洗涤样品，在 800 × g、4 °C 离心 5 分钟。弃去上清液，将样品重悬于 250 至 500 µL FACS 缓冲液中，4 °C 保存，待上流式细胞仪检测。

结果

脂质体生产

本文发表的结果与我们先前发表的研究^3,4,20相似。利用本方案，我们预期制备的脂质体粒径约为150‒160 nm。动态光散射（DLS）结果显示，脂质体的平均直径为163.2 nm，泽塔电位（zeta potential）为-19.2 mV（图1A）。冷冻电子显微镜（cryo-EM）成像显示脂质体呈圆形结构（图1B），DLS粒径分布图显示其相对于平均直径的标准偏差较小（图1C）。

阳性脂质体结合需要 PBS 处理的对照

我们课题组先前采用本方案的研究探讨了在体内给药一周后，脂肪组织SVF、脾脏和血液中的哪些细胞亚群能够与脂质体结合^3,4。使用PBS处理的小鼠，对其腹腔和脾脏细胞采用与脂质体处理小鼠样本相同的抗体组合进行染色。在处理一周后采集组织（图2A）。PBS处理小鼠的样本作为DiD的FMO对照，用于设定DiD阳性门控（图2B,C）。虽然可利用DiD阳性信号设定阳性门，但也必须使用不含DiD信号的样本，以确认该阳性门不会纳入任何DiD阴性样本。

需要进行滴定以优化荧光信号

在开展完整实验之前，必须优化多种条件，包括细胞染色过程中使用的荧光标记抗体浓度以及脂质体配制过程中使用的脂质染料浓度。流式细胞仪对荧光强度具有检测上限，因此脂质体中掺入过多染料将导致样本在流式细胞仪检测时DiD信号超出可定量范围。此外，脂质体中DiD染料过多可能导致非特异性染料转移水平升高，从而影响细胞摄取结果的准确性。图3展示了通过梯度稀释脂质染料浓度以确定在所用流式细胞仪检测范围内产生最佳信号浓度的实验结果。该优化实验在最终实验所关注的组织上进行：血液（图3A）、腹股沟脂肪组织基质血管组分（SVF）（图3B）和附睾脂肪组织基质血管组分（SVF）（图3C）。测试选用的染料浓度分别为每1 mL脂质体加入10 mg DiD（高浓度，红色）、1 mg DiD（中浓度，蓝色）或0.1 mg DiD（低浓度，灰色）。脂质体中使用的最高浓度在所有三种组织中均过高，超出了流式细胞仪的可定量检测范围（图3A‒C，红色）。最低DiD浓度显示出一定信号（图3A‒C，灰色），但未能观察到明显区别于PBS处理细胞的细胞群（图3A‒C，黑色）。定量分析显示，每种组织在不同浓度下的DiD平均荧光强度（MFI）算术均值表明，PBS对照组与中浓度DiD处理组之间存在明显差异（图3D）。因此，如实验方案所述，我们选择中等浓度（图3，蓝色）用于后续脂质体的制备。

使用多抗体组合可实现对不同细胞亚群摄取脂质体的鉴定

使用表3中列出的抗体组合，对巨噬细胞、B细胞、T细胞、树突状细胞、单核细胞和内皮细胞的标志物进行染色（图4）。每种组织类型需要略微不同的设门策略，但大多数相同的细胞类型均可在各类组织中被识别。其中一些例外情况包括内皮细胞，其通常不存在于血液中；以及单核细胞，其在血液中的频率通常高于其他组织。在确定各细胞群后，可定量分析每个细胞群体的总数量及其为DiD⁺细胞的频率。还可进一步计算以表征DiD⁺细胞群体：例如DiD⁺细胞中巨噬细胞、内皮细胞等所占的比例。请注意，此处所示为示例性的设门策略，并非分析样本的唯一方法。具体分析应根据所选抗体组合及可用的流式细胞仪而定。

图1：制备的脂质体的典型特性示例。
（A）粒径和ζ电位的测量方法如上所述，并以表格形式报告。各参数均以均值±标准差表示。（B）采用冷冻电镜（Cryo-EM）对制备的脂质体进行成像。白色标尺长度为50 nm。（C）采用动态光散射（DLS）技术生成该批次脂质体直径的直方图。本图改编自Osinski等人的研究³。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：PBS 或脂质体处理小鼠中典型的 DiD 染色结果。
（A）PBS 与脂质体处理的实验示意图。PBS 或脂质体在一周内注射三次。在处理第 8 天采集组织。（B, C）代表性流式图显示，经脂质体处理的小鼠（C）中 DiD 染色呈阳性，而 PBS 处理的小鼠（B）中未见阳性染色。FSC，前向散射。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：脂质体中DiD的滴定。
制备含有三种不同浓度DiD的脂质体并注射入小鼠体内。灰色代表低浓度组，即每1 mL脂质体含0.1 mg DiD；蓝色代表中浓度组，即每毫升脂质体含1 mg DiD；红色代表高浓度组，即每毫升脂质体含10 mg DiD。以PBS处理的小鼠作为阴性对照（黑色）。注射后24小时采集血液（A，圆形）、腹股沟脂肪组织（B，三角形）和附睾脂肪组织（C，方形），并制备成单细胞悬液。使用流式细胞仪检测各样本中可检测到的DiD水平。各组织的直方图展示了不同处理组的叠加结果，以显示不同浓度下的荧光强度（A–C）。同时对每种组织和浓度下的DiD算术平均值进行定量分析并作图（D）。SSC = 侧向散射。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4：脂肪SVF、血液和脾脏中细胞亚群的代表性流式细胞术分析。
(A‒C) 用于鉴定脂肪SVF (A)、脾脏 (B) 和血液 (C) 中细胞亚群及DiD⁺细胞的设门策略示意图。缩写：FSC = 前向散射；LD = 活/死细胞；L-DCs = 淋巴样树突状细胞；M-DCs = 髓样树突状细胞；SSC = 侧向散射。本图改编自Osinski等³。请点击此处查看该图的放大版本。

对照	目的
用 PBS 或生理盐水处理的小鼠	使用该小鼠的细胞进行以下流式细胞术对照：
	1. 未染色细胞
	2. 活/死细胞单染
	3. 使用完整抗体组合染色但不含脂质体荧光信号的细胞，用于分析时确定脂质体阳性信号
	该/这些小鼠还将用于确定脂质体在体内是否具有任何效应，因为实验中将包含无脂质体的对照组。
空载脂质体	如果您的脂质体中加载了化合物，则应合成一部分不含该化合物的脂质体批次，以排除脂质体本身可能引起的体内效应。
单独 DiD 染料	由于 DiD 也可能被细胞膜摄取，将部分小鼠给予与脂质体中等量的游离染料，有助于消除任何背景膜染色的影响。
荧光减一对照（FMO 对照）	这些细胞使用除一种抗体外的所有抗体进行染色。与上方第 3 项类似，这有助于在分析时确定该抗体的真实阳性信号。

表1：本方案中应使用的对照。

溶液	成分	每批/每只小鼠所需近似体积
脂质体的制备
醋酸钙	1 M 醋酸钙水溶液（H2O）	50 mL
HEPES缓冲液	10 mM HEPES水溶液（H2O），pH 7.4	50 mL
HEPES中的Tesaglitazar	溶于10 mM HEPES	10 mL
组织收获、处理与染色
磷酸盐缓冲液（PBS）	137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4，1.8 mM KH2PO4，溶于蒸馏水（ddH2O）	2 mL
PBS-肝素	0.1 mM 肝素PBS溶液	10 mL
HEPES缓冲液	20 mM HEPES PBS溶液	5 mL
消化缓冲液	2 mg/mL I型胶原酶溶于HEPES缓冲液	5 mL
AKC裂解缓冲液	0.158 M NH3Cl，10 mM KHCO3，0.1 mM Na2EDTA，溶于ddH2O，pH 7.2	15 mL
FACS缓冲液	1% BSA，0.05% NaN3 PBS溶液	15 mL
Fc阻断剂（稀释后）	FACS缓冲液中1:50稀释的Fc阻断剂	250 µL
固定缓冲液	2% 多聚甲醛PBS溶液	200 µL

表2：需配制的溶液。

A	B	C	D
胞外染色（2倍抗体混合液）
抗原	荧光素	每100 µL检测所需抗体体积	所需总体积：
CD45	PerCP	0.5 µL	C列 × 1.2 × 样本总数
CD11b	PerCP Cy5.5	0.25 µL	(0.5 µL/次检测) × (1.2) × (样本数)
F4/80	PE Cy7	0.25 µL	(0.25 µL/次检测) × (1.2) × (样本数)
CD19	PE-CF594	1 µL	(0.25 µL/次检测) × (1.2) × (样本数)
CD3	FITC	1 µL	(1.0 µL/次检测) × (1.2) × (样本数)
CD31	BV605	0.25 µL	依此类推…
CD11c	APC ef780	1 µL
CD115	PE	1.5 µL
配制抗体混合液时，将D列计算出的抗体总量加入FACS缓冲液或Brilliant Violet染色缓冲液*中，最终体积为(50 µL × 1.2 × 样本总数)
活/死细胞染色（1倍）
活/死细胞染料	荧光素	每200 µL检测所需染料体积	所需总体积：
Live/Dead	Aqua	0.67 µL	C列 × 1.2 × 样本总数
胞内染色（1倍）
抗原	荧光素	每50 µL检测所需抗体体积	所需总体积：
αSMA	FITC	0.125	C列 × 1.2 × 样本总数
*若您的抗体组合中包含两种或以上偶联至Brilliant Violet荧光素的抗体，应使用Brilliant Violet染色缓冲液。

表3：用于流式染色的示例抗体组合及染色混合液的计算方法。

讨论

本文介绍一个三部分实验方案：（i）制备负载抗糖尿病药物tesaglitazar并标记荧光脂质染料的脂质体；（ii）通过小鼠眶后静脉注射给予脂质体；（iii）采集、处理并染色组织，通过流式细胞术在细胞水平检测脂质体的摄取情况。本方案概述了约150 µm脂质体的制备及其在脂肪组织、血液和脾脏中摄取情况的评估。该脂质体制备方法可放大生产，主要在室温下操作，并采用反相蒸发法以最大化药物包封率并去除有机溶剂。使用本方案，纯化后的脂质体样品中药物tesaglitazar浓度可达2 mg/mL。制备好的脂质体可在HEPES缓冲液中4 °C保存超过一年。根据我们的经验，其平均粒径变化极小。通过超滤法使用10 kDa离心滤膜将脂质体与游离药物分离后，紫外分光光度法检测显示药物含量损失低于10%。

在制备脂质体的过程中，有一些关键步骤和因素需要考虑。首先，操作流程的顺序至关重要，必须严格遵守。其次，在包载tesaglitazar时所使用的溶液pH值必须维持在7.4，以最大化其溶解度和有效包载效率。第三，设备和滤膜的正确组装可确保每一步骤的产物具有合适的粒径和纯度。例如，若100 nm和200 nm滤膜未正确组装，则可能导致脂质体批次粒径不均且不符合预期。第四，在药物包载前必须彻底去除乙酸钙，以最大化tesaglitazar向脂质体内的转移。为检测乙酸钙是否完全去除，可采用高速离心法去除脂质体后，测定非脂质体溶液中的乙酸钙水平。第五，记录并称量每一步骤中加入脂质体制备体系的所有物料质量至关重要，以确保能够准确计算浓度并维持所需物料比例。最后，若操作技术不当，可能导致过度的异质性。必须使用动态光散射（DLS）及其他方法（如电子显微镜）对这一参数进行充分检测。为提高均一性，可考虑调整所选滤膜孔径或串联使用两层滤膜。

此外，在全面开展本实验方案之前，必须提前规划并优化流式细胞术的对照和抗体组合（表1，表3）。应测试抗体以确保染色时使用了适当的浓度，并尽量减少荧光染料之间的重叠。在设计抗体组合时，还必须考虑脂质体制备过程中所用染料的激发和发射波长。在我们的实验结果中，使用了DiD染料，其激发和发射波长与别藻蓝蛋白（Allophycocyanin, APC）和AlexaFluor 647等荧光染料相似。因此，我们在抗体组合中未选择与这些荧光染料偶联的抗体。此外，本实验方案未包含同型对照。原因是本方案所选用的抗体均为经过充分验证、商业可得的抗体。然而，如果计划使用此前未优化过的抗体，建议在开展完整实验前，先在目标组织上将该抗体与同型对照进行比对测试。

尽管本实验方案展示了如何从小鼠经处理后提取并处理血液、脾脏、腹股沟脂肪组织和附睾脂肪组织，但这一通用方法也可应用于其他组织。根据具体研究的组织类型，其处理与消化方案可能需要相应调整，相关方法已在以下组织中发表：肺²¹、肝²²、腹膜腔³、骨髓^3,23、脑²⁴。

需要考虑的本方法的一个重要局限性是，每只动物只能在一个时间点评估摄取情况。因此，将本方案与其他非侵入性成像技术结合使用，或进行相应规划以确保有足够的资源完成评估，可能是有利的。细胞摄取的时间以及细胞更替是需要考虑的重要因素：脂质体在最初24小时内会在体内循环，而根据摄取脂质体的细胞的寿命或其对摄取的反应，可能发生细胞死亡或进一步的吞噬作用。我们之前的研究表明，在不同时间点，DiD⁺细胞群体的特征会发生变化³。因此，在较早的时间点或与所关注机制的生物学过程最相关的时间点评估摄取情况非常重要。此外，尽管本方案可用于对整个组织中的细胞摄取进行定量，但流式细胞术无法揭示摄取细胞在组织中的定位。将该方法与组织学技术相结合，有助于弥补这一局限性。

总体而言，本方案可作为组织学和全身体荧光成像等现有方法的补充。随着流式细胞术工具和方法的持续进步，构建更大规模的抗体组合以检测越来越特异的细胞亚群将成为可能。我们建议将本方案与上述方法联合使用，以更全面地评估细胞对颗粒的摄取情况，并提供通过流式细胞术验证实验结果的机会。例如，若流式细胞术结果显示脂肪组织中的大部分颗粒被巨噬细胞摄取，则可保留同一份脂肪组织的另一等分试样，进行免疫荧光分析：将其固定、切片并用巨噬细胞标志物染色，以确认该细胞类型确实能够摄取脂质体。该联合策略可增强纳米颗粒生物分布检测的严谨性：验证细胞特异性靶向性、量化细胞摄取水平、识别非靶向摄取现象，并有望为观察到的治疗效果提供机制性假说依据。本方案还可适用于未来的研究，例如使用不同类型的脂质体、探究其他组织中的摄取情况，或在肥胖症、代谢紊乱及其他适合采用纳米颗粒递送作为治疗策略的疾病背景下测试新化合物。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 注射器	BD	309659
10 mL 注射器	BD	302995
25 号针头，无菌，用于眶后注射	BD	305122
27 号针头，无菌，用于眶后注射	BD	305620
抗小鼠 B220 BV421	Biolegend	103251	克隆株 RA3-6B2
抗小鼠 CD115 PE	eBioscience	12-1152-82	克隆株 AFS98
抗小鼠 CD11b PerCP Cy5.5 抗体	BD Biosciences	550993	克隆株 M1/70
抗小鼠 CD11c APC ef780 抗体	eBioscience	47-0114-82	克隆株 N418
抗小鼠 CD19 PE CF594	BD Biosciences	562291	克隆株 1D3
抗小鼠 CD3 FITC 抗体	BD Biosciences	553061	克隆株 145-2C11
抗小鼠 CD31 BV605	Biolegend	102427	克隆株 390
抗小鼠 CD45 PerCP	BD Biosciences	557235	克隆株 30-F11
抗小鼠 F4/80 PE Cy7	Biolegend	123114	克隆株 BM8
牛血清白蛋白	Gemini Bio-products	700-107P
脱盐离心柱	ThermoFisher	89889, 89890	Zeba 离心柱
DPBS	Gibco	14190-144
动态光散射 Nicomp 370	Particle Sizing System, Inc
FIX & PERM 细胞通透化试剂盒	ThermoFisher Scientific	GAS004
纱布海绵	Dermacea	441211
肝素	Sigma	3393-1MU
脂质体挤出器	Millipore Sigma	Z373400	LiposoFast
活/死细胞染料 Aqua	ThermoFisher Scientific	L34957
Nanosight	Malvern Instruments Ltd	NS300
眼科润滑剂	Optixcare		20 g/70 oz 无菌
多聚甲醛，16% w/v 水溶液，无甲醇	Alfa Aesar	433689L
用于组织剪切的聚乙烯小瓶	Wheaton	986701
旋转蒸发仪	Buchi	Re111
超声破碎仪	Misonix	XL2020
T/Pump 热疗泵及垫片	Gaymer Industries	TP-500
Tesaglitazar	Tocris	3965
径迹蚀刻聚碳酸酯膜	Thomas Scientific	1141Z**	Whatman, Nuclepore 聚碳酸酯亲水膜
ZetaSizer/DLS-ELS 系统	Malvern Instruments Ltd