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方法文章

淀粉颗粒大小分布的分析与表征

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DOI：

10.3791/61586

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2021年3月4日

 ,  , 
1Cooperative Agriculture Research Center, College of Agriculture and Human Science, Prairie View A&M University

本文内容

摘要

本文介绍了一种可重复且具有统计学有效性的淀粉颗粒粒径分布测定方法，并采用双参数乘法形式对测定的颗粒对数正态粒径分布进行描述。该方法适用于植物科学和食品科学研究中克级淀粉样品的所有颗粒粒径分析。 

摘要

所有植物来源的淀粉均由大小和形状各异、出现频率不同的颗粒组成，即表现出一定的粒径和形态分布。 采用多种颗粒粒径分析技术所测定的淀粉颗粒粒径数据常常存在可靠性问题，其原因在于某些难以克服的系统性误差导致结果重复性差或缺乏统计学意义，这些误差包括对颗粒形状的敏感性以及样品颗粒数量的局限性。本文概述了一种利用电阻感应区技术 reproducible 且具有统计学效力的淀粉颗粒粒径分布测定方法，并采用改进的双参数乘法形式对所测定的颗粒对数正态粒径分布进行表征，从而提高准确性和可比性。该方法适用于克级淀粉样品的颗粒粒径分析，因此有助于研究淀粉颗粒尺寸如何受淀粉生物合成装置与机制的调控，以及这些尺寸如何影响淀粉在食品和工业应用中的性质与功能。文中展示了采用该方法对甘薯淀粉样品颗粒粒径分布进行重复分析的代表性结果。我们进一步讨论了该方法中的若干关键技术要点，特别是颗粒对数正态粒径分布的乘法表征方式，以及克服颗粒聚集体频繁堵塞孔径的一些技术手段。

引言

淀粉粒是植物光合作用和贮藏组织中两种主要的同多糖聚合物——直链或轻度分支的直链淀粉和高度分支的支链淀粉——与少量其他组分（包括脂质和蛋白质）有序组装而成的物理结构。不同植物物种的淀粉粒呈现出多种三维（3D）形态（参见文献1,2综述），包括球形、椭球形、多面体、片状、立方体、长方体以及不规则管状结构。即使是同一植物物种的相同组织或不同组织中的淀粉粒，也可能具有一组形态，其出现频率各不相同。换言之，某一植物物种的淀粉粒可能具有特征性的统计形态分布，而非单一特定形态。由于淀粉粒形态的非均一性和非球形特征，准确测量和定义其粒径变得十分困难。此外，同一植物物种相同组织中的淀粉粒在尺寸上也存在不同比例的分布，即表现出特征性的粒径分布。这种粒径分布进一步增加了淀粉粒尺寸分析与描述的复杂性。

淀粉颗粒的大小已通过多种颗粒粒径分析技术进行分析（详见参考文献）。3），包括显微镜技术、沉降/空间场流分离（Sd/StFFF）、激光衍射和电感应区（ESZ）法。然而，当存在颗粒形状差异和粒径分布时，这些技术在测定淀粉颗粒大小方面的适用性并不相同。显微镜技术，包括光学显微镜、共聚焦显微镜和扫描电子显微镜，非常适合用于形态学研究4,5,6,7，结构8,9 和发育10,11 淀粉颗粒的直接测量或基于光学显微镜数据的软件辅助图像分析（IAOM）已用于测定多种物种（包括玉米）淀粉颗粒的大小，但由于存在某些固有缺陷，这些方法在确定颗粒尺寸分布方面几乎不适用。12，小麦13,14，马铃薯15 和大麦16，只能测量极少量（几十到几千个）淀粉颗粒图像的一维（通常为最大长度）或二维（表面积）尺寸。由于技术本身的限制，所采样的颗粒数量较少，而每单位质量淀粉中的颗粒总数极为庞大（约120 × 10⁹），因此这些小样本通常难以具有统计代表性。6 每克，假设全部 10 µm 1.5 g/cm 的球体³ 密度），因此可能导致实验结果的重复性较差。Sd/StFFF 技术可能具有较高的分离速度和分辨率，并能获得较窄粒径分布的淀粉颗粒组分17，但其应用较少，可能是因为其准确性会受到淀粉颗粒损伤、形态差异和密度不同的严重影响。激光衍射法是目前应用最广泛的技术，已用于所有主要农作物种类的淀粉颗粒粒径分析3,14,16尽管该技术具有诸多优点，但实际上并不适用于存在淀粉颗粒形状分布情况下的颗粒尺寸测定。目前大多数同步激光衍射仪器均基于米氏光散射理论。18 对于均匀球形颗粒及修正的米氏理论18 对于其他一些均匀形状而言，该技术对颗粒形状具有内在的高度敏感性，因此甚至并不完全适用于某些均匀形状的情况。19，更不用说对于具有多种不同比例形状的淀粉颗粒了。ESZ技术通过测量颗粒通过小孔时引起的与颗粒体积成正比的电场扰动，可提供高分辨率的颗粒体积大小、数量分布和体积分布等信息。由于ESZ技术不依赖于颗粒的任何光学特性（如颜色、形状、成分或折射率），且实验结果具有高度可重复性，因此特别适用于测定具有多种形状的淀粉颗粒的粒径分布。

淀粉颗粒的大小也通过多种参数进行定义。过去常使用平均直径进行简单描述，某些情况下该值是显微镜下测量的二维图像最大长度的算术平均值12,20，或等效球体直径的平均值3。在其他情况下，颗粒大小分布则通过尺寸范围21,22、分布的平均体积或平均直径（以球体等效直径表示，按数量、体积或表面积加权）来描述，并假设其符合正态分布14,23,24,25,26。这些来自不同分析方法的淀粉颗粒大小描述参数性质差异显著，不具备严格的可比性。若直接比较不同物种、甚至同一物种相同组织来源的淀粉颗粒“大小”，可能会产生严重误导。此外，在大多数研究中，所假设的正态分布的离散程度（或形状）参数，即标准差σ（或图形标准差σg），用于衡量分布宽度（即颗粒尺寸的离散程度），往往被忽略。

为解决上述淀粉颗粒粒径分析所面临的关键问题，我们提出了一种利用ESZ技术对淀粉样品颗粒粒径分布进行可重复且具有统计学意义测定的实验方案，并采用一种改进的双参数乘法形式27，以更准确、更具可比性的方式描述所测定的颗粒对数正态粒径分布。为验证并演示该方法，我们对甘薯淀粉样品进行了重复的颗粒粒径分析，采用图形几何平均直径 figure-introduction-1 和乘法标准差 s*，以 figure-introduction-2 x/（乘以和除以）s* 的形式，描述其微分体积百分比-体积当量球体直径的对数正态分布。

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方案

1. 淀粉样品的制备

  1. 按照既定方法，从不同植物物种的淀粉积累组织中制备两份（或三份）克级重复淀粉样品（例如马铃薯15、甘薯28、小麦籽粒13,29和玉米籽粒30等）。
  2. 用丙酮或甲苯彻底清洗淀粉样品3–4次，以尽量减少颗粒聚集体，并将其完全干燥。
    注意：应采用能够每批次提取获得超过1 g淀粉的提取方法。分别从三份或两份重复提取物中各取一份或两份0.5 g等分样品，用于一种淀粉提取物的颗粒尺寸分析。

2. 电解质制备

  1. 为四次重复淀粉样品的粒径测定运行，配制 500 mL 浓度为 50 g/L 的氯化锂甲醇溶液（每次运行需 100 mL，额外准备 100 mL）。建议以大体积批次配制电解液，例如每次配制 4 至 8 L，以尽量减少浓度波动。
  2. 将容器置于冰上或 4 °C 冷柜中冷却，以加快氯化锂的溶解。

3. 设置分析仪

  1. 选择一个孔径管，其颗粒直径范围应覆盖待分析淀粉样品已知的（来自文献或预实验）颗粒尺寸范围，例如，甘薯淀粉可选用100 μm孔径的孔径管。对于颗粒尺寸范围未知的淀粉样品，应通过预实验选择合适的孔径管，使用多个具有重叠颗粒直径范围的孔径管进行测试。
    注意：孔径管的颗粒直径范围是指在其孔径的2%至60%之间的精确测量范围，扩展测量范围可达孔径的80%。表1列出了三种最适用于主要作物淀粉颗粒尺寸分析的孔径管的特性。如果淀粉样品的颗粒尺寸范围超过单个孔径管的测量范围，应进行多管重叠分析，结合最多五个不同孔径测得的粒径分布结果。每个孔径管可通过其管体上标注的直径和部件编号进行识别。管体上的条形码包含其直径和序列号，可通过分析仪控制面板上的条形码读取器扫描输入分析软件中。
  2. 选择100 mL或200 mL的分析烧杯（而非比色皿）用于测定淀粉颗粒尺寸，并设置自动搅拌（见下文），以在测量过程中保持良好的颗粒悬浮状态。
  3. 创建标准操作方法（SOM）以规定运行参数，并创建偏好设置文件（Preferences file）用于分析、查看和打印结果。根据需要将SOM与偏好设置文件组合成标准操作程序（SOP）。
    注意：对于无法标准化的分析，可使用SOM运行分析，并根据需要通过编辑SOM窗口（见下文）在各次运行之间调整SOM设置。运行完成后，可根据需要更改偏好设置以分析、查看和打印运行结果。对于可标准化的颗粒尺寸分析，应使用SOP进行分析。
    1. 启动分析仪软件。在主菜单中点击SOP | 创建SOM向导或编辑SOM，或在状态面板中点击编辑SOM。使用向导或编辑SOM窗口为SOM选择相应设置。用于甘薯淀粉样品颗粒尺寸分析的典型设置总结于表2中。
    2. 在SOM向导-设置摘要窗口或编辑SOM窗口中，将创建的SOM保存为文件。
    3. 在主菜单中点击SOP | 创建偏好设置向导或编辑偏好设置。使用向导或偏好设置编辑窗口中的选项卡，选择如表3所示或其他所需的偏好设置。
    4. 在创建偏好设置向导-设置摘要窗口或编辑偏好设置窗口中，将所选偏好设置保存为文件。
    5. 在主菜单中点击SOP | 创建SOP向导。按照向导的逐步指引，输入描述信息，选择相应的SOM和偏好设置文件，创建并保存SOP。

4. 淀粉样品的颗粒粒径分析

  1. 准备分析仪
    1. 打开分析仪，启动计算机中的软件，并在软件与分析仪自动连接后，确认状态面板顶部显示为“就绪”状态。
    2. 向电解液瓶中加入电解液，必要时清空废液瓶。
    3. 根据用户手册中的指南，正确安装并固定所选的光阑管。对于未经校准的新光阑管，应按照逐步操作指南进行校准 校准 | 校准光圈 在主菜单中。对于已校准的光圈管，按照逐步指南验证校准。 更换光圈管向导 在……之下 运行或校准 | 验证光圈校准 在主菜单上。
    4. 通过按压左侧样品舱前壁中部的锁扣释放夹，解锁检测平台，并手动将平台降至底部。将装有100 mL电解液的分析杯放置于平台上，移动搅拌器至搅拌位置，然后手动将平台升至自锁的上部位置，使孔径管和搅拌器浸入电解液中。
    5. 点击 填充 在底部仪器工具栏上点击，使分析仪自动用电解液填充系统，然后点击 冲洗 让分析仪自动冲洗系统。
    6. 单击以加载 SOM 标准操作程序 | 加载 SOM 在主菜单上, 并使用SOM在没有首选项文件的情况下运行分析。或者，通过单击加载SOP 标准操作程序 | 加载一个标准操作程序 在主菜单上或 加载标准操作程序 在状态面板上，使用标准操作程序（SOP）运行分析。
    7. 如果使用标准操作程序（SOP），请点击 标准操作程序 | SOM 信息 或 偏好信息 在主菜单上验证 SOM 和首选项设置。单击 样本 | 输入样本信息 在主菜单上或 编辑信息 在状态面板上输入运行所需的样品信息。
  2. 制备淀粉-甲醇样品和浆料悬浮液
    1. 分别从两份或三份重复的淀粉提取物中，称取两份或一份0.5 g的样品。
    2. 将每份0.5 g淀粉等分试样加入50 mL锥形离心管中的5 mL甲醇中，使用低强度超声波（12–24 W/cm）进行数次脉冲处理，充分分散淀粉颗粒2来自超声波处理器。
    3. 使用一次性移液管，在持续搅拌的烧杯中将淀粉-甲醇悬浮液的一小滴（约 0.2 mL）加入 100 mL 浓度为 50 g/L 的 LiCl 甲醇电解质溶液中。关闭样品室门。
  3. 进行片段大小分析运行
    1. 点击 预览 在底部仪器工具栏中启动预览运行。在状态面板上，确认动态显示的浓度条为绿色，并显示悬浮液的标称浓度范围为5%至8%。
    2. 点击 停止 在底部工具栏上点击以停止预览运行。如有必要，通过将部分悬浮液替换为电解质来稀释淀粉-电解质悬浮液，然后重复一次预览运行。
      注意：悬浮液的标称浓度范围为5%至8%，这对于防止因颗粒聚集堵塞孔径而导致运行中断至关重要。如有需要，可调整滴加样品量和/或淀粉-甲醇悬浮液的浓度，以制备标称浓度处于最佳范围内的新淀粉-电解质悬浮液。
    3. 验证完成后，单击 开始 在底部工具栏上点击以开始运行。分析仪将自动完成运行，此时已计数颗粒的总数将与运行时间一同显示在 状态 面板 在一次运行中，达到设定的总细胞数（125,000 或 250,000）后 控制模式 根据悬液浓度（在5-8%范围内或更低），单次运行需要2至5分钟或更长时间。
      注意：当分析仪根据SOM的孔径堵塞检测设置自动检测到堵塞时，将中止当前运行，执行冲洗以解除堵塞，并启动新的运行。该堵塞处理操作最多重复四次，若仍未解决，分析仪将取消运行操作。此类因堵塞导致的运行中止问题可通过以下两种技术方法予以克服，如文中所述。 表2 并在讨论部分详细阐述。
    4. 如有需要，进行技术重复实验（参见 表 2 并使用相同的淀粉-电解质悬浮液，通过简单点击在讨论部分详细说明 开始 或 重复 位于底部工具栏。
    5. 运行结束后或重复运行完成后，倒空烧杯，用甲醇冲洗，并重新加入100 mL新鲜电解液以供下一次运行使用。
    6. 运行过程中，如果出现 扩展尺寸范围 当大于颗粒的计数达到时，通知对话框出现 60 µm 超过总数的0.1%（根据SOM设置），点击 运行 60% 至 80% 用于将动态尺寸测量范围扩展至孔径直径的80%。
      注意：该 扩展尺寸范围 设置针对大于孔径直径60%的颗粒的控制操作100 µm，在本例中）。SOM 中的设置规定包含大于 60 µm 当其计数超过总计数的0.1%时。运行的结束仍由总计数控制，所需时间可能略短于未纳入总计数中不足0.1%（视为统计学上无显著意义的数量）的大颗粒时的情况。
  4. 分析运行结果
    1. 如果使用 SOM 来控制运行，请根据需要选择首选项设置，以查看、打印结果并进行统计分析 创建首选项向导 或 编辑偏好设置 在……之下 标准操作程序 在主菜单上。
    2. 将多次运行的结果叠加在同一张图上进行比较。
      1. 点击 覆盖 在 主工具栏 或 文件 | 覆盖 在主菜单上点击以进入叠加窗口。在“文件”框中导航并选择多个所需的结果文件，然后单击 添加 将它们移至“已选文件”框，然后单击 好的 将选定的结果叠加在同一张图表上。
      2. 要向已打开的叠加图像中添加文件，请单击 运行文件 | 开放用于叠加 在“运行”菜单中打开叠加窗口，导航至目标文件，然后点击添加。
    3. 重复分析的平均结果（2 个提取物 × 2 次淀粉取样，或 3 个提取物 × 1 次淀粉取样），以列表或图表形式查看或打印平均颗粒大小分布及统计结果。
      1. 在主菜单中，单击 文件 | 文件工具 | 平均值 打开平均值窗口。在“文件”框中导航并选择多个所需的结果文件，然后单击 添加 将它们移至“已选文件”框，然后单击 好的 对选定结果进行平均，并将平均值显示在单个图表上。
      2. 在“运行”菜单中，单击以将额外的结果文件包含到平均分布中 运行文件 | 打开并添加至平均值 打开“添加至平均值”窗口，导航并添加文件。新的平均值将显示在运行（结果）窗口或列表的图表中。

5. 指定平均分布

  1. 在显示平均分布的“运行”菜单窗口中，点击“运行”菜单中的计算 | 平均统计值，以打开统计摘要窗口，该窗口以行为单位显示平均统计值，以列为单位显示平均分布的图形统计值。
  2. 利用图形几何平均值（figure-protocol-1）和图形标准差（s*）所在的图形统计值列，以 figure-protocol-2 x/ s* 的形式描述平均分布。通过将各重复分布的几何平均值的均值（µ，等同于平均分布的 figure-protocol-3）除以平均统计值行中列出的平均标准差（σ），计算用于衡量重复分布间变异程度的变异系数（CV）。
    注意：用于评估重复分布均值间变异程度的平均标准差（针对 µ）不同于用于衡量平均分布离散程度的图形几何标准差（针对 figure-protocol-4）。

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结果

为了验证该实验流程并证明所测定颗粒粒径分布的可重复性，我们对甘薯淀粉样品进行了重复的粒径分析。采用先前描述的方法28，从田间种植的育种品系SC1149-19甘薯材料中，在相近的发育时期制备了两组重复（S1和S2）淀粉样品。从每份淀粉提取物中取出两份0.5 g的等分试样（a和b），分别悬浮于5 mL甲醇中，并使用低能量超声波进行多次脉冲处理以破坏聚集体。将每组两个淀粉-甲醇悬浮液分别取液滴加入电解质溶液中，制成淀粉-电解质悬浮液，随后按照上述SOM方法各进行两次粒径测定（技术重复运行），每次总计分析125,000个颗粒。在每次单独的粒径测定过程中，当累计颗粒总数分别达到约65,000和约125,000时，所显示的微分体积-粒径分布的图形几何标准差（s*）和几何平均值（ figure-results-1 ）便不再发生显著变化。每组使用同一淀粉-甲醇悬浮液进行的两次重复测定运行结束后，数据合并为总计250,000个颗粒的粒径统计结果。

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讨论

本方案解决了现有淀粉颗粒大小分析方法中的一些关键问题，包括对三维颗粒进行不恰当的一维或二维测量、因颗粒形状不均一导致的尺寸测量失真、由于颗粒样本量有限而造成的重复性差和统计有效性存疑，以及在颗粒形状不规则且尺寸分布非正态的情况下对颗粒尺寸（尤其是使用平均尺寸）的不准确或不恰当描述。该方法采用等效球体积（ESZ）技术，可测量淀粉颗粒的三维尺寸（体积），且不受颗粒形状影响。通过设计对极大颗粒样本量（4 × 250,000）进行重复分析以获得平均颗粒尺寸分布，不仅使结果具有统计有效性并提高可重复性，还在技术上减轻了聚集或受损颗粒引起的测量失真，从而提升尺寸测定的准确性（下文详述）。如代表性结果所示，采用该方法测定的各重复分布几何平均值的平均值的变异系数（CV）通常小于5%，表明结果具有良好的可重复性。此外，对数正态分布的颗粒体积等效球尺寸分布的尺度（figure-discussion-1）和形状参数（s*）采用乘法形式进行描述，能更准确地反映淀粉样品中颗粒尺寸分布的真实特性，并且便于使用，适用于来自相同或不同来源的淀粉颗粒尺寸分析之间的通用比...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露

致谢

本工作部分得到农业与人类科学学院合作农业研究中心及综合粮食安全研究中心的资助，该学院隶属于 Prairie View A&M 大学&M 大学。感谢田华提供的技术支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
分析用烧杯Beckman Coulter Life SciencesA35595Smart-Technology (ST) 烧杯
孔径管，100 µmBeckman Coulter Life SciencesA36394用于 MS4E
一次性移液器Fisher Scientific (Fishersci.com)13-711-9AM其他具有相似孔径的一次性移液器也可使用。
Fisherbrand 圆锥形聚丙烯离心管，50 mlFisher Scientific (Fishersci.com)05-539-13任何其他类似类型的离心管也可使用。
玻璃烧杯，150 至 250 mlFisher Scientific (Fishersci.com)02-540K这些烧杯用于盛装甲醇，以便在每次运行之间清洗孔径管和搅拌子。
LiClFisher ChemicalL121-100
甲醇Fisher ChemicalA412-500建议批量购买，因为分析过程需消耗大量甲醇。
Mettler Toledo ML-T 精密天平Mettler Toledo30243412任何其他可读性为 0.01 g 至 1 mg 的精密天平均可使用。
Multisizer 4e 库尔特计数器Beckman Coulter Life SciencesB23005旧型号 Multisizer 3 也可使用，但需对参数进行轻微调整。4e 型号配备 100 μm 孔径管。不同直径的孔径管可向该公司单独购买。
超声波处理器 UP50HHielscher 超声技术公司UP50H其他具有低功率（<50 瓦）输出的实验室超声仪也可使用。该超声仪的 MS1 和 MS2 超声探头均可用于在 5 ml 甲醇中分散淀粉颗粒。应始终先使用最低设置（20% 振幅，0.1 或 0.2 占空比），若悬浮液中仍有聚集体，再逐步提高设置。

参考文献

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