淀粉颗粒大小分布的分析与表征

摘要

本文介绍了一种可重复且具有统计学有效性的淀粉颗粒粒径分布测定方法，并采用双参数乘法形式对测定的颗粒对数正态粒径分布进行描述。该方法适用于植物科学和食品科学研究中克级淀粉样品的所有颗粒粒径分析。 

摘要

所有植物来源的淀粉均由大小和形状各异、出现频率不同的颗粒组成，即表现出一定的粒径和形态分布。 采用多种颗粒粒径分析技术所测定的淀粉颗粒粒径数据常常存在可靠性问题，其原因在于某些难以克服的系统性误差导致结果重复性差或缺乏统计学意义，这些误差包括对颗粒形状的敏感性以及样品颗粒数量的局限性。本文概述了一种利用电阻感应区技术 reproducible 且具有统计学效力的淀粉颗粒粒径分布测定方法，并采用改进的双参数乘法形式对所测定的颗粒对数正态粒径分布进行表征，从而提高准确性和可比性。该方法适用于克级淀粉样品的颗粒粒径分析，因此有助于研究淀粉颗粒尺寸如何受淀粉生物合成装置与机制的调控，以及这些尺寸如何影响淀粉在食品和工业应用中的性质与功能。文中展示了采用该方法对甘薯淀粉样品颗粒粒径分布进行重复分析的代表性结果。我们进一步讨论了该方法中的若干关键技术要点，特别是颗粒对数正态粒径分布的乘法表征方式，以及克服颗粒聚集体频繁堵塞孔径的一些技术手段。

引言

淀粉粒是植物光合作用和贮藏组织中两种主要的同多糖聚合物——直链或轻度分支的直链淀粉和高度分支的支链淀粉——与少量其他组分（包括脂质和蛋白质）有序组装而成的物理结构。不同植物物种的淀粉粒呈现出多种三维（3D）形态（参见文献^1,2综述），包括球形、椭球形、多面体、片状、立方体、长方体以及不规则管状结构。即使是同一植物物种的相同组织或不同组织中的淀粉粒，也可能具有一组形态，其出现频率各不相同。换言之，某一植物物种的淀粉粒可能具有特征性的统计形态分布，而非单一特定形态。由于淀粉粒形态的非均一性和非球形特征，准确测量和定义其粒径变得十分困难。此外，同一植物物种相同组织中的淀粉粒在尺寸上也存在不同比例的分布，即表现出特征性的粒径分布。这种粒径分布进一步增加了淀粉粒尺寸分析与描述的复杂性。

淀粉颗粒的大小已通过多种颗粒粒径分析技术进行分析（详见参考文献）。³），包括显微镜技术、沉降/空间场流分离（Sd/StFFF）、激光衍射和电感应区（ESZ）法。然而，当存在颗粒形状差异和粒径分布时，这些技术在测定淀粉颗粒大小方面的适用性并不相同。显微镜技术，包括光学显微镜、共聚焦显微镜和扫描电子显微镜，非常适合用于形态学研究^4,5

方案

1. 淀粉样品的制备

1. 按照既定方法，从不同植物物种的淀粉积累组织中制备两份（或三份）克级重复淀粉样品（例如马铃薯¹⁵、甘薯²⁸、小麦籽粒^13,29和玉米籽粒³⁰等）。
2. 用丙酮或甲苯彻底清洗淀粉样品3–4次，以尽量减少颗粒聚集体，并将其完全干燥。
   注意：应采用能够每批次提取获得超过1 g淀粉的提取方法。分别从三份或两份重复提取物中各取一份或两份0.5 g等分样品，用于一种淀粉提取物的颗粒尺寸分析。

2. 电解质制备

1. 为四次重复淀粉样品的粒径测定运行，配制 500 mL 浓度为 50 g/L 的氯化锂甲醇溶液（每次运行需 100 mL，额外准备 100 mL）。建议以大体积批次配制电解液，例如每次配制 4 至 8 L，以尽量减少浓度波动。
2. 将容器置于冰上或 4 °C 冷柜中冷却，以加快氯化锂的溶解。

3. 设置分析仪

1. 选择一个孔径管，其颗粒直径范围应覆盖待分析淀粉样品已知的（来自文献或预实验）颗粒尺寸范围，例如，甘薯....

结果

为了验证该实验流程并证明所测定颗粒粒径分布的可重复性，我们对甘薯淀粉样品进行了重复的粒径分析。采用先前描述的方法²⁸，从田间种植的育种品系SC1149-19甘薯材料中，在相近的发育时期制备了两组重复（S1和S2）淀粉样品。从每份淀粉提取物中取出两份0.5 g的等分试样（a和b），分别悬浮于5 mL甲醇中，并使用低能量超声波进行多次脉冲处理以破坏聚集体。将每组两个淀粉-甲醇悬浮液分别取液滴加入电解质溶液中，制成淀粉-电解质悬浮液，随后按照上述SOM方法各进行两次粒径测定（技术重复运行），每次总计分析125,000个颗粒。在每次单独的粒径测定过程中，当累计颗粒总数分别达到约65,000和约125,000时，所显示的微分体积-粒径分布的图形几何标准差（s*）和几何平均值（ ）便不再发生显著变化。每组使用同一淀粉-甲醇悬浮液进行的两次重复测定运行结束后，数据合并为总计250,000个颗粒的粒径统计结果。

讨论

本方案解决了现有淀粉颗粒大小分析方法中的一些关键问题，包括对三维颗粒进行不恰当的一维或二维测量、因颗粒形状不均一导致的尺寸测量失真、由于颗粒样本量有限而造成的重复性差和统计有效性存疑，以及在颗粒形状不规则且尺寸分布非正态的情况下对颗粒尺寸（尤其是使用平均尺寸）的不准确或不恰当描述。该方法采用等效球体积（ESZ）技术，可测量淀粉颗粒的三维尺寸（体积），且不受颗粒形状影响。通过设计对极大颗粒样本量（4 × 250,000）进行重复分析以获得平均颗粒尺寸分布，不仅使结果具有统计有效性并提高可重复性，还在技术上减轻了聚集或受损颗粒引起的测量失真，从而提升尺寸测定的准确性（下文详述）。如代表性结果所示，采用该方法测定的各重复分布几何平均值的平均值的变异系数（CV）通常小于5%，表明结果具有良好的可重复性。此外，对数正态分布的颗粒体积等效球尺寸分布的尺度（）和形状参数（s*）采用乘法形式进行描述，能更准确地反映淀粉样品中颗粒尺寸分布的真实特性，并且便于使用，适用于来自相同或不同来源的淀粉颗粒尺寸分析之间的通用比.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
分析用烧杯	Beckman Coulter Life Sciences	A35595	Smart-Technology (ST) 烧杯
孔径管，100 µm	Beckman Coulter Life Sciences	A36394	用于 MS4E
一次性移液器	Fisher Scientific (Fishersci.com)	13-711-9AM	其他具有相似孔径的一次性移液器也可使用。
Fisherbrand 圆锥形聚丙烯离心管，50 ml	Fisher Scientific (Fishersci.com)	05-539-13	任何其他类似类型的离心管也可使用。
玻璃烧杯，150 至 250 ml	Fisher Scientific (Fishersci.com)	02-540K	这些烧杯用于盛装甲醇，以便在每次运行之间清洗孔径管和搅拌子。
LiCl	Fisher Chemical	L121-100
甲醇	Fisher Chemical	A412-500	建议批量购买，因为分析过程需消耗大量甲醇。
Mettler Toledo ML-T 精密天平	Mettler Toledo	30243412	任何其他可读性为 0.01 g 至 1 mg 的精密天平均可使用。
Multisizer 4e 库尔特计数器	Beckman Coulter Life Sciences	B23005	旧型号 Multisizer 3 也可使用，但需对参数进行轻微调整。4e 型号配备 100 μm 孔径管。不同直径的孔径管可向该公司单独购买。
超声波处理器 UP50H	Hielscher 超声技术公司	UP50H	其他具有低功率（<50 瓦）输出的实验室超声仪也可使用。该超声仪的 MS1 和 MS2 超声探头均可用于在 5 ml 甲醇中分散淀粉颗粒。应始终先使用最低设置（20% 振幅，0.1 或 0.2 占空比），若悬浮液中仍有聚集体，再逐步提高设置。