需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

区分肺内免疫细胞与血管内免疫细胞群体：颈静脉内途径

1.3K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/61590

⸱

2020年9月22日

 ,  ,  ,  ,  , 
1The Children's Hospital of Philadelphia, 2Systems Pharmacology and Translational Therapeutics, University of Pennsylvania, 3Institute of Translational Medicine and Therapeutics (ITMAT), University of Pennsylvania, 4Department of Pediatrics, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine

本文内容

摘要

本研究的目的是描述一种在肺部炎症研究中区分血管内与实质内免疫细胞的实验方案。我们在收获肺组织之前，通过颈静脉注射荧光标记的抗体。此外，我们采用基于膨胀的肺组织消化方法，以提高肺部白细胞的回收率。

摘要

昼夜节律是指以约24小时为周期发生的各种生物过程的振荡。在分子水平上，这种节律由核心时钟基因构成的转录-翻译反馈环路（TTFL）网络所驱动。各个组织和器官系统（包括免疫系统）均拥有自身的生物钟。在体循环中，CD45+ 细胞群体中的多个成员在一天中呈现节律性波动；然而，在组织驻留的CD45+ 白细胞群体中，许多此类节律并不相同甚至不相似。在研究昼夜节律对肺部炎症调控作用时，可能需要专门分析肺内的CD45+ 细胞。然而，尽管已优化灌注方法，仍会有部分循环中滞留的白细胞残留在肺组织中。本实验方案的设计目标是区分血管内与肺实质内的白细胞。为此，在收获肺组织前，通过颈静脉注射荧光标记的CD45抗体至小鼠体内。随后采用定制的肺组织消化技术对肺组织进行消化，以获得单细胞悬液。样本使用针对肺实质免疫细胞的标准抗体组合（包括另一种CD45抗体）进行染色。流式细胞术分析可清晰地区分不同细胞群体。因此，当肺内免疫细胞与循环免疫细胞在数量和功能上存在显著差异时，该标记和定义肺内CD45+ 细胞的方法将尤为重要。

引言

本文介绍了区分血管内白细胞与肺部白细胞的高效且可靠的方法。即使采用最佳的灌注技术，研究仍发现循环中的CD45+细胞在肺组织中存在残留。这会削弱区分循环系统与肺组织中细胞节律的能力，而在肺部炎症情况下，这一问题尤为突出。这对于研究炎症的昼夜节律调控具有重要意义。

昼夜节律是指各种生物过程以24小时为周期发生的日间振荡。该节律系统是一种在进化上保守的预测性机制，当机体面临环境变化（如感染威胁）时，可为宿主提供保护作用。在细胞水平上，生物钟由核心钟基因构成的自我维持的转录-翻译反馈环路所组织1。免疫系统拥有自身的生物钟，影响其对病原体和炎症损伤的应答2,3。由于肺是持续暴露于外界环境的器官，昼夜节律在肺中尤为重要4。肺内的多种免疫过程均受到生物钟的调控5,6,7。然而，肺部与全身循环中各种生物过程的相位并不相同8，这意味着白细胞在肺组织与循环系统中的振荡模式也可能存在差异。因此，在昼夜节律研究背景下，建立一种能够有效区分肺内与血管内白细胞的方法至关重要。

本研究的目的是建立一种能够可靠区分血管内与实质内白细胞的方法。为此，我们采用了血管内白细胞标记结合肺组织消化的方法。在标记血管内白细胞时，我们使用颈静脉注射，该方法靶向大血管，可在不同品系和大小的小鼠中重复应用。许多其他方法采用尾静脉注射9,10，但在Bl6小鼠中该操作尤为困难11。颈静脉注射需要使用麻醉，且最好在解剖显微镜或放大镜直视下进行。因此，应权衡颈静脉注射的便捷性与可靠性，以及对麻醉和特殊设备的需求。然而，鉴于大多数研究实验室均可方便获得这些设备，我们认为这并非限制性因素。但具体情况仍需具体分析。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

所有动物实验均经宾夕法尼亚大学机构动物护理和使用委员会批准，并符合《实验动物护理和使用指南》的规定。

注意：整个过程可分为 1）静脉内 CD45 标记，2）收获，3）消化，以及 4）染色与流式细胞术。这些步骤已在图 1中总结。

1. 溶液/试剂的配制

  1. 通过向500 mL DMEM中加入5 mL 2 mM L-谷氨酰胺、20 mL 胎牛血清（FBS）、1 mL 2-巯基乙醇和10 mL 青霉素-链霉素溶液，制备解离培养基。
    注意：解离培养基在2-4 °C保存时可稳定保存长达2个月。
  2. 通过向500 mL 不含镁和钙的PBS中加入10 mL FBS和500 mg叠氮化钠，制备荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液。
    注意：加入叠氮化钠后，FACS缓冲液可在2-4 °C下保存数月。
  3. 在样本采集当天，将DNase和Liberase溶液以1:100的比例稀释加入解离培养基中（即每1 mL解离培养基中加入10 µL DNase和Liberase）。
    注意：每只小鼠全肺消化需10 mL/只，半肺消化需5 mL/只。

2. 静脉内 CD45 标记

  1. 本实验使用8至12周龄的成年C57Bl6小鼠。
  2. 使用合适的麻醉剂对小鼠进行麻醉。本实验采用赛拉嗪（xylazine）与氯胺酮（ketamine）联合麻醉，但其他麻醉剂亦可接受。目标是达到中度至深度麻醉，持续时间约为5–10分钟。
    注意：赛拉嗪和氯胺酮麻醉混合物通过腹腔注射给药。赛拉嗪剂量为10–15 mg/kg，氯胺酮剂量为120–150 mg/kg。
  3. 当足底反射消失后，将动物仰卧位固定，并轻轻用胶带固定四肢，使头部尽可能保持在正中位置。
  4. 用镊子提起皮肤，使用锋利的手术剪剪开，暴露颈静脉和胸肌。
  5. 使用28 G针头将200 µL抗CD45抗体（流式细胞术级别抗体，用PBS按1:300稀释）注入颈静脉。等待2–4分钟，使抗体在血管系统中充分循环。
    注意：从较浅角度经胸肌进入颈静脉可有效避免大量出血。
  6. 随后将动物暴露于CO2中10分钟以实施安乐死。接着进行肺灌注，并收获肺组织及其他组织。
    注意：任何符合美国兽医医学协会（AVMA）动物安乐死指南的人道安乐死方法均可接受。

3. 解剖/收获（图1）

  1. 将动物仰卧于平板上，用针固定四肢，保持头部居中。
  2. 用70%乙醇喷洒动物体表。使用镊子和剪刀打开胸腔，暴露肺、心脏和气管。
  3. 在心脏左心室做一小切口，通过右心室注入10 mL冷PBS，对肺进行灌注。
  4. 剪开气管造口，插入静脉套管。套管插入后，将一段长约6-8 cm的缝合线从气管下方穿过，并在套管上打两次结固定。
  5. 将手术缝线塞入套管内，然后连接一支含有消化液的注射器（半肺使用5 mL，全肺使用10 mL），如图1B所示。
  6. 轻柔地将肺组织从身体其余部分剪下，将连接着肺的注射器放入一个50 mL锥形管中。

4. 消化制备单细胞悬液

  1. 将肺组织在 37 °C 下孵育 30–40 分钟，每 5 分钟注入 1 mL（半肺）或 2 mL（全肺）解离培养基。
  2. 当全部培养基注入完毕后，移除注射器和套管，将 50 mL 锥形管置于 180 rpm 的振荡水浴中继续孵育，以获得更高的细胞得率。
    注意：也可每 5 分钟手动振摇试管。
  3. 加入 10 mL 磷酸盐缓冲液（PBS），剧烈振摇 1 分钟以终止反应。
  4. 将溶液通过细胞滤筛（70 µm）过滤至新的 50 mL 锥形管中。使用 5 mL 注射器的橡胶塞将任何组织团块压过滤筛。加入 PBS，使最终体积达到 30 mL。
  5. 在 1,200 × g、4 °C 条件下离心 10 分钟。弃去上清液，避免扰动沉淀。用移液器吸除残留液体。
  6. 向细胞沉淀中加入 1 mL 红细胞（RBC）裂解缓冲液，通过移液混匀。
  7. 室温孵育 60–90 秒。加入 PBS 至最终体积为 30 mL，以终止裂解反应。
    注意：孵育时间取决于细胞沉淀中血液的含量；细胞沉淀越红，所需孵育时间越长。
  8. 在 1,200 × g、4 °C 条件下离心 10 分钟。弃去上清液，避免扰动沉淀。用移液器吸除残留液体。
  9. 向细胞沉淀中加入 1 mL FACs 缓冲液，通过移液混匀。

5. 流式细胞术的细胞染色

  1. 使用细胞计数器测定细胞悬液中的细胞总数。
  2. 将细胞悬液转移至各已标记的FACS管中，使每份样品的细胞总数为3 × 106个。
  3. 加入Fc阻断剂（按1:100稀释），冰上孵育15分钟。
  4. 在4 °C条件下，以1,200 × g离心5分钟，弃上清液，注意不要扰动沉淀。
  5. 用指定的抗体混合物对样品进行染色，避光冰上孵育20分钟（例如用铝箔包裹管子）。孵育至一半时间时，通过轻轻晃动试管架使管内液体混匀。
  6. 加入1 mL FACS缓冲液，用移液器吹打混匀以洗涤细胞。
  7. 将细胞悬液缓慢通过35 µm滤网，用移液器转移至另一FACS管中。
  8. 在4 °C条件下，以1,200 × g离心5分钟，弃上清液，注意不要扰动沉淀。
  9. 每管加入150 µL FACS缓冲液，用移液器吹打混匀。
  10. 上机前立即每管加入10 µL DAPI（1:100稀释）。
    注意：样品现已准备好用于流式细胞仪检测。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

采用该技术，未处理的解离肺组织总细胞数（代表性数据仅使用左肺叶）在 27.3 × 106 至 71.1 × 106 个细胞/mL 之间。在根据细胞大小设门并排除双联体和死细胞后（设门策略见图2），白细胞计数范围为 6.9 × 106 至 13.5 × 106 个细胞/mL。即使经过灌注清除肺部，仍滞留在其中的循环白细胞约占实验中活细胞的 4% 至 13%。解离肺组织中的所有白细胞均在 PE-Cy7 荧光通道中对 CD45 染色阳性，但只有循环白细胞在两种荧光染料（PE-Cy7 和 Pac Blue）标记的 CD45 抗体中均呈双染。尽管已标准化灌注流程，我们发现解离肺组织中约有 24% 至 70% 的总白细胞属于循环白细胞群体。未校正血管内标记时的平均白细胞计数为 10.2 × 106 个细胞/mL，而校正后的数值为 4.93 × 106 个细胞/mL（图3A）。因此，若未能区分灌注后仍残...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

对肺部炎症和肺免疫应答进行细致研究，对于理解多种疾病状态至关重要。流式细胞术常规用于计数肺部白细胞并确定其功能意义。白细胞的功能至少部分取决于其所在位置。尽管已有越来越多的证据表明，即使采用完美的灌注方案，肺部仍会残留大量血管内白细胞，但大多数研究并未区分肺实质内与血管内的白细胞。此外，灌注后残留在肺部的血管内白细胞可能因样本制备方式不同而在各样本中随机分布，因此无法预测其对实验结果的影响。这限制了研究结果的普适性，也对涉及流式细胞术的研究之严谨性和可重复性构成威胁12。

本文介绍了一种用于区分血管内残留白细胞与真正肺实质内白细胞的方法。尽管此类方法此前已有应用9,13,14，但我们优化了标记及组织消化步骤，使该制备方法达到最高效率。其他研究曾描述采用眶后静脉或尾静脉注射进行血管内标记10。眶后注射对动...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由NHLBI-K08HL132053（SS）资助。作者感谢G. A. FitzGerald博士提供解剖显微镜和摇动水浴设备的使用。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
博克尔科学中等水浴锅博克尔科学基金290200
10 mL BD 注射器，带 BD Luer-Lok 接头BD 生物科学309604
5 mL BD 注射器，带 BD Luer-Lok 接头BD 生物科学309646
抗-CD45-Pac BlueBiolegend103114
抗CD45-PE/Cy7Biolegend103114
细胞滤网 70 µm 尼龙Fisher352350
康宁50 mL圆锥底离心管Avantor21008-714
康宁Falcon带细胞过滤帽的离心管EMSCO10004637
解剖显微镜OlympusSZX-SDO2
DMEM，高糖Life Technologies11965084
Dnase罗氏10104159001
不含 Ca 的 DPBS++ && Mg++14190136
Fc阻断Biolegend101320
HyClone 胎牛血清GE HealthcareSH30071.03
L-谷氨酰胺（200 mM）Life Technologies25030-081
Liberase 研究级Sigma5401127001
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）Life Technologies15140-122
精密振荡水浴箱赛默飞世尔科技TSSWB15
红细胞裂解缓冲液SigmaR7757
4-0 丝线缝合线RobozSUT-15-2

参考文献

  1. Partch, C. L., Green, C. B., Takahashi, J. S. Molecular architecture of the mammalian circadian clock. Trends in Cell Biology. 24, 90-99 (2014).
  2. Man, K., Loudon, A., Chawla, A. Immunity around the clock. Science. 354, 999-1003 (2016).
  3. Haspel, J. A., et al. Perfect timing: circadian rhythms, sleep, and immunity - an NIH workshop summary. JCI Insight. 5, (2020).
  4. Nosal, C., Ehlers, A., Haspel, J. A. Why Lungs Keep Time: Circadian Rhythms and Lung Immunity. Annual Review of Physiology. 82, 391-412 (2020).
  5. Gibbs, J., et al. An epithelial circadian clock controls pulmonary inflammation and glucocorticoid action. Nature Medicine. 20, 919-926 (2014).
  6. Ehlers, A., et al. BMAL1 links the circadian clock to viral airway pathology and asthma phenotypes. Mucosal Immunology. 11, 97-111 (2018).
  7. Sengupta, S., et al. Circadian control of lung inflammation in influenza infection. Nature Communications. 10, 4107(2019).
  8. Zhang, R., Lahens, N. F., Ballance, H. I., Hughes, M. E., Hogenesch, J. B. A circadian gene expression atlas in mammals: implications for biology and medicine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 16219-16224 (2014).
  9. Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9, 209-222 (2014).
  10. Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. Isolation and Characterization of Mononuclear Phagocytes in the Mouse Lung and Lymph Nodes. Methods in Molecular Biology. 1809, 33-44 (2018).
  11. Vines, D. C., Green, D. E., Kudo, G., Keller, H. Evaluation of mouse tail-vein injections both qualitatively and quantitatively on small-animal PET tail scans. Journal of Nuclear Medicine Technology. 39, 264-270 (2011).
  12. Tighe, R. M., et al. Improving the Quality and Reproducibility of Flow Cytometry in the Lung. An Official American Thoracic Society Workshop Report. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 61, 150-161 (2019).
  13. Anderson, K. G., et al. Cutting edge: intravascular staining redefines lung CD8 T cell responses. Journal of Immunology. 189, 2702-2706 (2012).
  14. Gibbings, S. L., et al. Three Unique Interstitial Macrophages in the Murine Lung at Steady State. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57, 66-76 (2017).
  15. Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab Animals (NY). 37, 26-32 (2008).
  16. Ho, D., et al. Heart Rate and Electrocardiography Monitoring in Mice. Current Protocols in Mouse Biology. 1, 123-139 (2011).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

CD45

本文已发表

视频即将推出

联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。