在血清型 1 型肺炎链球菌 菌株 519/43 中构建突变体

摘要

在这里，我们描述了一种 肺炎链球菌 血清型1菌株519/43，该菌株可以通过利用其自然获取DNA和自杀质粒的能力进行基因改造。作为原理证明，在肺溶血素（ply）基因中制造了同基因突变体。

摘要

肺炎链球菌血清1型仍然是低收入和中等收入国家的一个大问题，特别是在撒哈拉以南非洲。尽管它很重要，但由于缺乏遗传工具来修饰它，这种血清型的研究受到了阻碍。在这项研究中，我们描述了一种对血清型1临床分离株（菌株519/43）进行基因修饰的方法。有趣的是，这是通过利用肺炎球菌自然获取DNA的能力来实现的。然而，与大多数肺炎球菌不同，线性DNA的使用并不成功;为了突变这种重要的菌株，必须使用自杀质粒。这种方法为更深入地了解这种难以捉摸的血清型提供了手段，无论是在生物学上还是在致病性方面。为了验证该方法，已知的主要肺炎球菌毒素肺溶血素发生了突变，因为它具有众所周知且易于遵循的表型。我们表明，正如预期的那样，突变体失去了裂解红细胞的能力。通过能够突变感兴趣的血清型中的重要基因，我们能够观察到腹膜内和鼻内感染时功能丧失突变体的不同表型与其他血清型观察到的表型不同。综上所述，本研究证明菌株519/43（血清型1）可以进行基因改造。

引言

肺炎链球菌（肺炎链球菌，肺炎球菌）是全球发病和死亡的主要原因之一。直到最近，^{已经发现了近}100种肺炎链球菌血清型1，²，³，^4，5，^6，7。侵袭性肺炎球菌病（IPD）每年造成约70万人死亡，其中^{5岁以下儿童8}。肺炎链球菌^{是全球细菌}性肺炎、中耳炎、脑膜炎和败血症的主要原因9。

在非洲脑膜炎地带，血清型1是脑膜炎暴发的原因，其中序列型（ST）ST217是一种毒性极强的序列类型，占主导地位¹⁰，^11，12，13，^14，15。它在脑膜炎病理学中的重要性被比作非洲脑膜炎带脑膜炎奈瑟菌的重要性¹⁶。血清 1 型通常是 IPD 的主要原因;然而，它在运输中很少发现。事实上，在冈比亚，这种血清型占所有侵袭性疾病的20%，但仅在0.5%的健康携带者中发现¹⁴，^17，18，19。感受态肺炎球菌的遗传交换和重组通常发生在携带中，而不是在侵袭性疾病中发生²⁰。此外，血清型 1 已被证明是肺炎球菌中描述的最短携带率之一（仅 9 天）。因此，有人提出这种血清型的重组率可能比其他血清型低得多²¹。

有必要进行深入研究，以了解血清型1菌株携带率低的原因及其在撒哈拉以南非洲侵袭性疾病中的重要性。

在这里，我们报告了一种协议，该协议允许特定血清型1菌株的全基因组诱变，519/43。这种菌株可以很容易地获得新的DNA并将其重组到其基因组中。这种方法还不是菌株间，但在519/43背景下完成时非常有效（其他靶标已经突变，手稿正在准备中）。通过简单地使用519/43菌株，并利用其自然能力，以及替代提供外源DNA的方式，我们能够突变该血清型1菌株中的肺溶血素基因（ply）。该方法代表了Harvey等人提出的方法的改进²² ，因为它是一步完成的，无需通过不同的血清型传代DNA。然而，由于菌株间变异性，没有一种方法适用于所有菌株。突变特定基因并观察其影响的能力将使人们深入了解血清型 1型肺炎链球菌 菌株，并将为这些菌株在撒哈拉以南非洲脑膜炎中的作用提供答案。

方案

1. 通过SOE-PCR²³ 生成突变扩增子和扩增壮观霉素盒

1. 首先进行PCR以扩增菌株519/43中层基因侧翼区域的同源臂（分别为ply 5'（488 bp）和ply3'（715 bp））。Use primers plyFw1_NOTI （TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG）， ply5'R1_BamHI （CGAAATATAGACCAAAGGACGC GGATCC AGAACCAAACTTGACCTTGA）， ply3'F1_BamHI （TCAAGGTCAAGTTTGGTTCTGGATCC GCGTCCTTTGGTTTCG） 和plyRv2_NotI （TTTGCGGCCGCCATTTTCTACCTTATCCTCTACC）.
2. 对ply5'使用以下PCR条件:在94°C下变性60秒，步骤2:在94°C下变性30秒，步骤3:在58°C下退火30秒，步骤4:在72°C下延伸30秒，步骤5:返回步骤2并重复35个循环，步骤6:在72°C下最终延伸30秒。
   1. 对 ply3' 使用相同的 PCR 条件，但步骤 4 和步骤 6 的延长时间应为 60 秒。
3. 通过凝胶电泳分析PCR产物并从凝胶中切除扩增子。
4. 按照制造商说明（材料表）中描述的方案纯化PCR扩增子。
5. 在SOE-PCR中使用等摩尔量的两个同源臂作为模板。使用引物plyFw1_NOTI （TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG）和plyRv2_NotI（TTTGCGGCCGCCATTTTCTACCTTATCCTCTACC）的引物融合两个扩增子。
6. 使用以下SOE-PCR条件（步骤1:在94°C变性2分钟，步骤2:在94°C变性30秒，步骤3:退火58°C退火30秒，步骤4:在68°C下延伸60秒，步骤5:返回步骤2并重复25个循环，步骤6:最终在68°C下延伸90秒）。
7. 通过凝胶电泳分析SOE-PCR产物。使用凝胶提取试剂盒将其从凝胶中切除，并按照提供的说明进行操作。
8. 使用以下PCR条件扩增质粒pR412中的大观霉素盒:步骤1:在94°C变性60秒，步骤2:在94°C变性30秒，步骤3:在55°C下退火30秒，步骤4:在68°C下延伸60秒，步骤5:返回步骤2并重复25个循环， 步骤6:在68°C下最终延伸60秒。
   1. 使用引物BamHI_SP2F2（GGATCC CTA GAA CTA GTG GAT CCC CC）和BamHI_SP2R2（GGATCC AAT TCT GCA GAT TTT AC ATG ATC）。质粒pR412购自Marc PrudHomme博士（法国国家科学研究中心保罗·萨巴蒂埃图卢兹大学）。
9. 通过凝胶电泳分析PCR扩增子。如上所述切除和纯化所得的PCR扩增子。

2. 质粒pSD1的生成和 大肠杆菌 Dh5α的化学转化

1. 按照pGEMT简易系统I制造商说明（材料表）进行连接。在微量离心管中，加入 5 μL 2x 连接缓冲液、1 μL pGEMTeasy、2 μL ply_SOE产物、1 μL T4 DNA 连接酶和水，总体积为 20 μL。在4°C孵育过夜。 生成质粒pSD1。
2. 用pSD1转化化学含量 的大肠杆菌 Dh5α。首先将 50 μL 化学含量大 肠杆菌 Dh5α 与 3 μL pSD1 连接反应在冰上孵育 15 分钟。然后继续将细胞暴露于热冲击（42°C，30秒）。将细胞放在冰上2分钟。
3. 从冰上取出细胞并加入 350 μL S.O.C 培养基。将培养物在37°C，120rpm下孵育2小时。
4. 将转化接种在补充有 0.4 mM IPTG、0.24 mg/mL X-Gal 用于蓝/白选择和 100 μg/mL 氨苄青霉素的 Luria Bertani 琼脂 （LBA） 上，以确保平板中生长的所有菌落都具有质粒骨架。白色菌落含有pSD1。
5. 挑选三个白色菌落，在 10 mL LB 中建立过夜生长，并补充有 100 μg/mL 氨苄青霉素。将培养物在37°C振荡孵育过夜。
6. 第二天以3，082× g 离心培养物，并使用沉淀进行质粒提取。

3. 质粒DNA提取、pSD1和壮观霉素基因的限制性酶切及pSD2组装

1. 按照商业试剂盒随附的说明提取质粒DNA（材料表）。
2. 为先前扩增和纯化的pSD1质粒和大观霉素盒设置BamHI限制性酶切。使用以下条件和数量如 表1所示。
3. 将限制性酶切反应和对照在37°C孵育3小时。
4. 通过电泳分析限制性内切物，切除条带并按照商业试剂盒提供的说明进行纯化（材料表）。
5. 接下来，按照制造商说明（材料表）使用BamHI-消化的pSD1和大观霉素（来自步骤3.2）制备连接反应。在微量离心管中，加入以下反应组分:5 μL 2x 连接缓冲液、2 μL pSD1、2 μL 大观霉素盒、1 μL T4 DNA 连接酶，并在 4 °C 下孵育过夜。 生成质粒pSD2。
6. 如步骤2.2中所述，将质粒pSD2转化为化学感受态大 肠杆菌 Dh5α。
7. 根据携带质粒pSD2的转化体在补充有100μg/mL大观霉素和氨苄青霉素的LBA中生长的能力来选择转化体。
8. 按照上述说明并按照制造商的说明（μL）进行质粒DNA提取（pSD2）。

4. 肺炎链球菌 菌株的转化 519/43

1. 在BHI中制备肺炎链球菌519/43的过夜培养物，并使其在37°C，5%CO₂下静态生长。
2. 第二天，将培养物在 10 mL 新鲜 BHI 肉汤中以 1:50 和 1:100 稀释。在37°C下静态孵育培养物，直到OD_595nm 在0.05和0.1之间（最佳DNA采集接近0.1 OD）。
3. 一旦OD达到0.1，取860μL并转移到微量离心管中。在同一微量离心管中，添加:100 μL 100 mM NaOH、10 μL 20% （w/v） BSA、10 μL 100 mM CaCl 2、₂ μL 50 ng/mL CSP1²⁴ 和 500 ng pSD2。
4. 将反应在37°C下静态孵育3小时。
5. 将 330 μL 板铺在补充有 100 μg/mL 壮观霉素的 5% 血琼脂平板 （BA） 上，在 3 个孵育小时内每小时一次。
6. 将板在37°C，5%CO₂下孵育过夜。将大观霉素耐药菌落贴在补充有 100 μg/mL 大观霉素的另一块 BA 平板上以及补充有 100 μg/mL 氨苄西林的 BA 平板上。在上述条件下孵育两组板过夜。氨苄西林板用于测试质粒骨架的存在。
7. 使用NOTI plyFw1_（TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATGG） 和SPEC_REV（TAATTCCTCTAAGTCATAATTTCCG）的引物通过PCR确认大观霉素盒的存在。使用附着在突变区域外的引物plySCN1（CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA）和plySCN2（ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT）通过PCR确认突变。
8. 通过使用引物plySCN1（CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA），plySCN2（ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT）以及引物及其在大观霉素盒sqr1（CCTGATCCAACATGTAGTAGTACC）sqf2（CGTAGTTATCTTGGAGAGAATA）spec_sqf1（GGTACTTACATGTGTGGATCAGG）和spec_sqr2 TATTCTCTCCAAGATAACTACG中的引物测序，确认基因组正确位置的整合。

结果

这里描述的方案首先使用PCR扩增左右同源臂，同时从 层 基因的中间区域删除191 bp。在进行PCR时，在左同源臂的3'和右同源臂的5'端引入BamHI位点（图1A）。接下来是PCR-SOE，其中左和右同源臂融合成一个扩增子（图1B）。然后将该SOE-PCR扩增子克隆到pGEMTeasy中使用TA克隆以生成质粒pSD1（图1C）。成功转化将产生对氨苄青霉素耐药的白色菌落。任何蓝色菌落都是含有空pGEMTeasy质粒的转化体。然后，pSD1将在SOE-PCR时引入的BamHI位点被消化（图1D）并连接到壮观霉素盒（也为兼容端消化BamHI）。新的质粒称为pSD2（图1E）。通过限制性酶切确认pSD2的正确组装（图2A）。pSD2作为自杀质粒工作，因为它不包含革兰氏阳性...

讨论

肺炎链球菌，特别是血清1型，仍然是引起侵袭性肺炎球菌疾病和脑膜炎的全球威胁。尽管在非洲引入了各种疫苗，可以预防血清型1，但这种血清型仍然能够引起导致高发病率和死亡率的暴发¹³。由于其临床相关性，遗传操纵这种血清型的能力至关重要。本研究中描述的方法允许对该血清型中的代表性菌株进行遗传操作。侵袭性菌株 519/43 （ST5316），一种来自丹麦脑膜炎患者的临床分离株²⁵.

这里介绍的方法之所以成功，主要是由于所选择的菌株，因为它可以获得外源DNA，但也由于对用于 肺炎链球菌 转化的传统方案进行了更改，我们的转化方案的典型成功率约为70%。

使用这种方法，使用自杀质粒而不是通常的线性DNA至关重要。传统上，将使用线性DNA²⁶，^27，28...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AccuPrime Pfx DNA 聚合酶	Invitrogen	12344024	用于扩增片段
氨苄青霉素钠盐	Sigma Aldrich	A9518	用于第 1 阶段细菌选择 （pSD1）
血琼脂基础	Oxoid	CM0055	用于接种 肺炎链球菌 转化体
牛血清 白蛋白	sigma	55470	用于 S. pneumoniae 转化
脑心输注	Oxoid	CM1135	用于培养 S. pneumoniae 细胞
钙 Cacl2	Sigma	449709	用于 S. pneumoniae 转化
能力刺激肽 1	AnaSpec	AS-63779	用于 < > S. pneumoniae转化
Luria 肉汤琼脂	Gibco	22700025	用于 pSD1 和 pSD2
肉汤基础（Miller 配方）	Gibco	12795027	用于 pSD1 和 pSD2 的铺板和选择
Monarch 凝胶提取试剂盒	NEB	T1020S	用于从 DNA 凝胶
Monarch 质粒中提取条带小量制备试剂盒	NEB	T1010S	用于从细胞中提取质粒
pGEM T-easy	Promega	A1360	用作自杀质粒
S.O.C.	Invitrogen	15544034	用于转化后细胞的回收
氢氧化钠 （NaOH）	Sigma	S0899	用于 S.pneumoniae转化
酸大观霉素	SigmaAldrich	PHR1426	用于细菌选择
亚克隆效率 DH5α感受态细胞	Invitrogen	18265017	用于制备 pSD1 和 pSD2