构建1型Streptococcus pneumoniae菌株519/43的突变体

摘要

本文描述了一种S. pneumoniae 1型菌株519/43，该菌株可通过其天然摄取DNA的能力以及自杀型质粒实现遗传修饰。作为原理验证，我们构建了肺炎溶素（ply）基因的同源突变株。

摘要

Streptococcus pneumoniae 1型血清型在中低收入国家，特别是撒哈拉以南非洲地区，仍然是一个重大问题。尽管其重要性突出，但针对该血清型的研究一直受到缺乏有效遗传改造工具的限制。在本研究中，我们描述了一种对1型临床分离株（菌株519/43）进行遗传修饰的方法。有趣的是，该方法利用了肺炎链球菌天然摄取外源DNA的能力。然而，与大多数肺炎链球菌不同，线性DNA在此菌株中无法实现有效转化；为了成功对该重要菌株进行突变，必须使用自杀型质粒。该方法的建立为深入理解这一难以研究的血清型在生物学特性及致病机制方面提供了有力工具。为验证该方法的有效性，我们选择了肺炎链球菌中已知的主要毒素——肺炎溶素（pneumolysin）基因进行突变，因其具有明确且易于观察的表型特征。结果显示，与预期一致，该突变株失去了裂解红细胞的能力。通过对该血清型中重要基因的成功突变，我们观察到在腹腔和鼻腔感染模型中，功能缺失突变体表现出与其他血清型不同的表型特征。综上所述，本研究证实菌株519/43（1型血清型）可实现遗传修饰。

引言

Streptococcus pneumoniae（S. pneumoniae，肺炎链球菌）是全球范围内导致发病和死亡的主要病原体之一。迄今为止，已发现近100种S. pneumoniae血清型^{1,2,3,4,5,6,7}。每年，侵袭性肺炎链球菌疾病（IPD）导致约70万名5岁以下儿童死亡⁸。S. pneumoniae是全球细菌性肺炎、中耳炎、脑膜炎和败血症的主要致病原因⁹。

在非洲脑膜炎带，1型血清型是脑膜炎暴发的主要原因，其中序列型（ST）ST217是一种毒性极强的序列型，占主导地位^{10,11,12,13,14,15}。其在脑膜炎病理学中的重要性可与非洲脑膜炎带中的Neisseria meningitidis相提并论¹⁶。1型血清型通常是侵袭性肺炎球菌病（IPD）的主要病因；然而，它在无症状携带者中极为罕见。事实上，在冈比亚，该血清型占所有侵袭性疾病病例的20%，但在健康携带者中仅占0.5%^14,17,18,19。肺炎链球菌在具有感受态时的基因交换和重组通常发生在无症状携带状态，而非侵袭性疾病过程中²⁰。此外，已有研究表明，1型血清型在所有肺炎链球菌中具有最短的携带持续时间之一（仅为9天）。因此，有研究提出，该血清型的重组率可能远低于其他血清型²¹。

需要进行深入研究，以了解血清型1菌株在撒哈拉以南非洲地区携带率低的原因及其在侵袭性疾病中的重要性。

本文报道了一种针对特定1型血清型菌株519/43进行全基因组范围突变的实验方案。该菌株能够高效摄取外源DNA并将其重组至基因组中。目前该方法尚不能在不同菌株间通用，但在519/43遗传背景下具有很高的效率（其他靶基因的突变研究正在进行中，相关论文在撰写中）。通过直接使用519/43菌株，利用其天然感受态特性，并改变外源DNA的递送方式，我们成功在该1型血清型菌株中实现了肺炎溶素基因（ply）的突变。该方法相较于Harvey等人²²所提出的方法有所改进，仅需一步即可完成，无需将DNA通过其他血清型菌株进行传代。然而，由于不同菌株之间存在遗传差异，目前尚无适用于所有菌株的标准化突变方法。能够对特定基因进行突变并观察其表型效应，将有助于深入理解1型S. pneumoniae菌株的生物学特性，并为阐明这些菌株在撒哈拉以南非洲地区脑膜炎发病机制中的作用提供答案。

方案

1. 通过重叠延伸PCR（SOE-PCR）²³ 生成突变扩增子并扩增壮观霉素抗性盒

1. 首先通过 PCR 扩增来自菌株 519/43 的 ply 基因侧翼区域的同源臂（分别为 ply 5’（488 bp）和 ply3’（715 bp））。使用引物 plyFw1_NOTI（TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG）、ply5’R1_BamHI（CGAAATATAGACCAAAGGACGCGGATCC AGAACCAAACTTGACCTTGA）、ply3’F1_BamHI（TCAAGGTCAAGTTTGGTTCTGGATCC GCGTCCTTTGGTCTATATTTCG）和 plyRv2_NotI（TTTGCGGCCGCCATTTTCTACCTTATCCTCTACC）。
2. 对 ply5’ 使用以下 PCR 条件：第一步：94 °C 变性 60 秒；第二步：94 °C 变性 30 秒；第三步：58 °C 退火 30 秒；第四步：72 °C 延伸 30 秒；第五步：返回第二步，重复 35 个循环；第六步：72 °C 最终延伸 30 秒。
   1. 对 ply3’ 使用相同的 PCR 条件，但第四步和第六步的延伸时间应为 60 秒。
3. 通过凝胶电泳分析 PCR 产物，并从凝胶中切下扩增片段。
4. 按照制造商说明书中的方案（材料表）纯化 PCR 扩增产物。
5. 在 SOE-PCR 中使用等摩尔量的两个同源臂作为模板。使用引物 plyFw1_NOTI（TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG）和 plyRv2_NotI（TTTGCGGCCGCCATTTTCTACCTTATCCTCTACC）连接两个扩增片段。
6. 使用以下 SOE-PCR 条件（第一步：94 °C 变性 2 分钟；第二步：94 °C 变性 30 秒；第三步：58 °C 退火 30 秒；第四步：68 °C 延伸 60 秒；第五步：返回第二步，重复 25 个循环；第六步：68 °C 最终延伸 90 秒）。
7. 通过凝胶电泳分析 SOE-PCR 产物。使用凝胶回收试剂盒从凝胶中切下产物，并按照提供的说明进行操作。
8. 使用以下 PCR 条件从质粒 pR412 中扩增链霉素抗性盒：第一步：94 °C 变性 60 秒；第二步：94 °C 变性 30 秒；第三步：55 °C 退火 30 秒；第四步：68 °C 延伸 60 秒；第五步：返回第二步，重复 25 个循环；第六步：68 °C 最终延伸 60 秒。
   1. 使用引物 BamHI_SP2F2（GGATCC CTA GAA CTA GTG GAT CCC CC）和 BamHI_SP2R2（GGATCC AAT TCT GCA GAT TTT AC ATG ATC）。质粒 pR412 由法国图卢兹 CNRS-保罗萨巴捷大学的 Marc PrudHomme 博士提供。
9. 通过凝胶电泳分析 PCR 扩增产物。按照上述方法切下并纯化所得的 PCR 扩增片段。

2. 质粒pSD1的构建及化学转化 E. coli Dh5α

1. 按照pGEMT-easy system I制造商说明（材料表）进行连接反应。在微量离心管中加入5 µL 2x连接缓冲液、1 µL pGEMTeasy、2 µL ply_SOE产物、1 µL T4 DNA连接酶以及水，总体积为20 µL。4 °C过夜孵育。此步骤构建质粒pSD1。
2. 将pSD1转化至化学感受态的E. coli Dh5α中。首先将50 µL化学感受态E. coli Dh5α与3 µL pSD1连接反应液在冰上孵育15分钟。随后进行热激处理（42 °C，30秒）。再将细胞置于冰上放置2分钟。
3. 从冰上取出细胞，加入350 µL S.O.C培养基。在37 °C、120 rpm条件下孵育培养物2小时。
4. 将转化产物涂布于添加了0.4 mM IPTG、0.24 mg/mL X-Gal用于蓝白斑筛选以及100 µg/mL氨苄青霉素的Luria Bertani琼脂（LBA）平板上，以确保平板上生长的所有菌落均含有质粒骨架。白色菌落含有pSD1质粒。
5. 挑取三个白色菌落，接种于10 mL LB液体培养基中（含100 µg/mL氨苄青霉素），过夜培养。37 °C振荡培养过夜。
6. 次日，在3,082 x g条件下离心培养物，收集菌体沉淀用于质粒提取。

3. 质粒DNA提取、pSD1质粒和壮观霉素抗性基因的限制性酶切以及pSD2质粒的构建

1. 按照商业试剂盒提供的说明提取质粒DNA（材料表）。
2. 对pSD1质粒和先前扩增并纯化的壮观霉素抗性盒均进行BamHI限制性酶切。使用表1中所述的条件和用量。
3. 将限制性酶切反应及对照样品在37 °C下孵育3小时。
4. 通过电泳分析酶切产物，切下目标条带，并按照商业试剂盒说明书进行纯化（材料表）。
5. 接下来，根据生产商说明书（材料表），使用经BamHI酶切的pSD1质粒和壮观霉素抗性盒（来自步骤3.2）进行连接反应。在微量离心管中加入以下组分：5 µL 2x连接缓冲液、2 µL pSD1、2 µL 壮观霉素抗性盒、1 µL T4 DNA连接酶，于4 °C孵育过夜。由此获得质粒pSD2。
6. 将质粒pSD2转化至化学感受态的E. coli Dh5α中，操作同步骤2.2所述。
7. 根据转化子在含有100 µg/mL壮观霉素和氨苄青霉素的LBA培养基上的生长能力，筛选携带质粒pSD2的阳性克隆。
8. 按照上述方法及生产商说明书进行质粒DNA提取（pSD2）（µL）。

4. 转化 S. pneumoniae 菌株 519/43

1. 制备过夜培养物 S. pneumoniae 在BHI中于37 °C、5% CO₂条件下静置培养519/43₂.
2. 次日，将培养物用10 mL新鲜BHI肉汤按1:50和1:100比例稀释。于37 °C静置培养，直至OD_{595 nm} 在0.05至0.1之间（DNA最佳获取量接近0.1 OD）。
3. 当 OD 达到 0.1 时，取 860 µL 转移至微量离心管中。在同一微量离心管中加入：100 µL 100 mM NaOH、10 µL 20% (w/v) BSA、10 µL 100 mM CaCl₂，2 µL 的 50 ng/mL CSP1²⁴ 和 500 ng 的 pSD2。
4. 在37 °C下静置孵育反应体系3小时。
5. 每小时在含100 μg/mL链霉素的5%血琼脂平板（BA）上接种330 µL，持续3小时孵育期间共接种3次。
6. 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育培养板过夜₂将壮观霉素抗性菌落分别接种到另一块添加了100 μg/mL壮观霉素的BA平板以及添加了100 μg/mL氨苄青霉素的BA平板上。在上述条件下，将两组平板过夜培养。氨苄青霉素平板用于检测质粒骨架的存在。
7. 使用引物 plyFw1_NOTI（TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG）和 SPEC_REV（TAATTCCTCTAAGTCATAATTTCCG）通过 PCR 验证壮观霉素抗性盒的存在。使用位于突变区域外的引物 plySCN1（CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA）和 plySCN2（ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT）进行 PCR，以确认突变。
8. 通过使用引物 plySCN1（CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA）、plySCN2（ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT），以及结合于链霉素抗性盒上的引物 sqr1（CCTGATCCAAACATGTAAGTACC）、sqf2（CGTAGTTATCTTGGAGAGAATA）、spec_sqf1（GGTACTTACATGTTTGGATCAGG）和 spec_sqr2（TATTCTCTCCAAGATAACTACG）进行测序，确认其在基因组中的正确整合位置。

结果

本方案首先通过PCR扩增ply基因的左侧和右侧同源臂，同时删除其中间区域的191 bp片段。在PCR过程中，在左侧同源臂的3’端和右侧同源臂的5’端引入BamHI酶切位点（图1A）。随后进行PCR-SOE（重叠延伸PCR），将左侧和右侧同源臂融合为一个扩增片段（图1B）。该SOE-PCR产物通过TA克隆法插入pGEMTeasy载体，构建质粒pSD1（图1C）。成功转化的菌落呈白色且对氨苄青霉素具有抗性；任何蓝色菌落均为含有空pGEMTeasy质粒的转化子。随后，用BamHI酶切pSD1中在SOE-PCR时引入的BamHI位点（图1D），并与经BamHI酶切处理以产生兼容末端的壮观霉素抗性盒连接，获得新的质粒pSD2（图1E）。通过限制性酶切分析验证pSD2的正确构建（图2A

讨论

Streptococcus pneumoniae，特别是1型血清型，仍然是导致侵袭性肺炎球菌病和脑膜炎的全球性威胁。尽管已推出多种理论上可对1型血清型提供保护作用的疫苗，但在非洲，该血清型仍可引发导致高发病率和高死亡率的疫情¹³。由于其重要的临床意义，对该血清型进行基因操作的能力至关重要。本研究中描述的方法实现了对该血清型代表性菌株的基因操作。菌株519/43（ST5316）为一株侵袭性菌株，分离自丹麦一名脑膜炎患者的临床样本²⁵。

本文所采用的方法之所以成功，主要归因于所选菌株能够摄取外源DNA，同时也得益于对传统肺炎链球菌（S. pneumoniae）转化实验方案的改进；本转化方法的典型成功率为约70%。

采用该方法时，必须使用自杀质粒而非常规的线性DNA。传统上通常使用线性DNA^26,2...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AccuPrime Pfx DNA 聚合酶	Invitrogen	12344024	用于扩增片段
氨苄青霉素钠盐	Sigma Aldrich	A9518	用于第一阶段（pSD1）的细菌筛选
血琼脂基础	Oxoid	CM0055	用于涂布 S. pneumoniae 转化子
牛血清白蛋白	sigma	55470	用于 S. pneumoniae 转化
脑心浸液培养基	Oxoid	CM1135	用于培养 S. pneumoniae 细胞
氯化钙 CaCl2	Sigma	449709	用于 S. pneumoniae 转化
感受态刺激肽1	AnaSpec	AS-63779	用于 S. pneumoniae 转化
LB 琼脂培养基	Gibco	22700025	用于 pSD1 和 pSD2 的涂布与筛选
LB 培养基基础（Miller 配方）	Gibco	12795027	用于 pSD1 和 pSD2 的涂布与筛选
Monarch 凝胶回收试剂盒	NEB	T1020S	用于从 DNA 琼脂糖凝胶中回收条带
Monarch 质粒小提试剂盒	NEB	T1010S	用于从细胞中提取质粒
pGEM T-easy	Promega	A1360	用作自杀型质粒
S.O.C. 培养基	Invitrogen	15544034	用于转化后细胞的复苏
氢氧化钠（NaOH）	Sigma	S0899	用于 S. pneumoniae 转化
壮观霉素盐酸盐	SigmaAldrich	PHR1426	用于细菌筛选
Subcloning Efficiency DH5α 感受态细胞	Invitrogen	18265017	用于构建 pSD1 和 pSD2