构建1型Streptococcus pneumoniae菌株519/43的突变体

摘要

本文描述了一种S. pneumoniae 1型菌株519/43，该菌株可通过其天然摄取DNA的能力以及自杀型质粒实现遗传修饰。作为原理验证，我们构建了肺炎溶素（ply）基因的同源突变株。

摘要

Streptococcus pneumoniae 1型血清型在中低收入国家，特别是撒哈拉以南非洲地区，仍然是一个重大问题。尽管其重要性突出，但针对该血清型的研究一直受到缺乏有效遗传改造工具的限制。在本研究中，我们描述了一种对1型临床分离株（菌株519/43）进行遗传修饰的方法。有趣的是，该方法利用了肺炎链球菌天然摄取外源DNA的能力。然而，与大多数肺炎链球菌不同，线性DNA在此菌株中无法实现有效转化；为了成功对该重要菌株进行突变，必须使用自杀型质粒。该方法的建立为深入理解这一难以研究的血清型在生物学特性及致病机制方面提供了有力工具。为验证该方法的有效性，我们选择了肺炎链球菌中已知的主要毒素——肺炎溶素（pneumolysin）基因进行突变，因其具有明确且易于观察的表型特征。结果显示，与预期一致，该突变株失去了裂解红细胞的能力。通过对该血清型中重要基因的成功突变，我们观察到在腹腔和鼻腔感染模型中，功能缺失突变体表现出与其他血清型不同的表型特征。综上所述，本研究证实菌株519/43（1型血清型）可实现遗传修饰。

引言

Streptococcus pneumoniae（S. pneumoniae，肺炎链球菌）是全球范围内导致发病和死亡的主要病原体之一。迄今为止，已发现近100种S. pneumoniae血清型^{1,2,3,4,5,6,7}。每年，侵袭性肺炎链球菌疾病（IPD）导致约70万名5岁以下儿童死亡⁸。S. pneumoniae是全球细菌性肺炎、中耳炎、脑膜炎和败血症的主要致病原因⁹。

在非洲脑膜炎带，1型血清型是脑膜炎暴发的主要原因，其中序列型（ST）ST217是一种毒性极强的序列型，占主导地位^10,11,

方案

1. 通过重叠延伸PCR（SOE-PCR）²³ 生成突变扩增子并扩增壮观霉素抗性盒

1. 首先通过 PCR 扩增来自菌株 519/43 的 ply 基因侧翼区域的同源臂（分别为 ply 5’（488 bp）和 ply3’（715 bp））。使用引物 plyFw1_NOTI（TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG）、ply5’R1_BamHI（CGAAATATAGACCAAAGGACGCGGATCC AGAACCAAACTTGACCTTGA）、ply3’F1_BamHI（TCAAGGTCAAGTTTGGTTCTGGATCC GCGTCCTTTGGTCTATATTTCG）和 plyRv2_NotI（TTTGCGGCCGCCATTTTCTACCTTATCCTCTACC）。
2. 对 ply5’ 使用以下 PCR 条件：第一步：94 °C 变性 60 秒；第二步：94 °C 变性 30 秒；第三步：58 °C 退火 30 秒；第四步：72 °C 延伸 30 秒；第五步：返回第二步，重复 35 个循环；第六步：72 °C 最终延伸 30 秒。
   1. 对 ply3’ 使用相同的 PCR 条件，但第四步和第六步的延伸时间应为 60 秒。
3. 通过凝胶电泳分析 PCR 产物，并从凝胶中切下扩增片段。

结果

本方案首先通过PCR扩增ply基因的左侧和右侧同源臂，同时删除其中间区域的191 bp片段。在PCR过程中，在左侧同源臂的3’端和右侧同源臂的5’端引入BamHI酶切位点（图1A）。随后进行PCR-SOE（重叠延伸PCR），将左侧和右侧同源臂融合为一个扩增片段（图1B）。该SOE-PCR产物通过TA克隆法插入pGEMTeasy载体，构建质粒pSD1（图1C）。成功转化的菌落呈白色且对氨苄青霉素具有抗性；任何蓝色菌落均为含有空pGEMTeasy质粒的转化子。随后，用BamHI酶切pSD1中在SOE-PCR时引入的BamHI位点（图1D），并与经BamHI酶切处理以产生兼容末端的壮观霉素抗性盒连接，获得新的质粒pSD2（图1E）。通过限制性酶切分析验证pSD2的正确构建（图2A

讨论

Streptococcus pneumoniae，特别是1型血清型，仍然是导致侵袭性肺炎球菌病和脑膜炎的全球性威胁。尽管已推出多种理论上可对1型血清型提供保护作用的疫苗，但在非洲，该血清型仍可引发导致高发病率和高死亡率的疫情¹³。由于其重要的临床意义，对该血清型进行基因操作的能力至关重要。本研究中描述的方法实现了对该血清型代表性菌株的基因操作。菌株519/43（ST5316）为一株侵袭性菌株，分离自丹麦一名脑膜炎患者的临床样本²⁵。

本文所采用的方法之所以成功，主要归因于所选菌株能够摄取外源DNA，同时也得益于对传统肺炎链球菌（S. pneumoniae）转化实验方案的改进；本转化方法的典型成功率为约70%。

采用该方法时，必须使用自杀质粒而非常规的线性DNA。传统上通常使用线性DNA^26,2.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AccuPrime Pfx DNA 聚合酶	Invitrogen	12344024	用于扩增片段
氨苄青霉素钠盐	Sigma Aldrich	A9518	用于第一阶段（pSD1）的细菌筛选
血琼脂基础	Oxoid	CM0055	用于涂布 S. pneumoniae 转化子
牛血清白蛋白	sigma	55470	用于 S. pneumoniae 转化
脑心浸液培养基	Oxoid	CM1135	用于培养 S. pneumoniae 细胞
氯化钙 CaCl2	Sigma	449709	用于 S. pneumoniae 转化
感受态刺激肽1	AnaSpec	AS-63779	用于 S. pneumoniae 转化
LB 琼脂培养基	Gibco	22700025	用于 pSD1 和 pSD2 的涂布与筛选
LB 培养基基础（Miller 配方）	Gibco	12795027	用于 pSD1 和 pSD2 的涂布与筛选
Monarch 凝胶回收试剂盒	NEB	T1020S	用于从 DNA 琼脂糖凝胶中回收条带
Monarch 质粒小提试剂盒	NEB	T1010S	用于从细胞中提取质粒
pGEM T-easy	Promega	A1360	用作自杀型质粒
S.O.C. 培养基	Invitrogen	15544034	用于转化后细胞的复苏
氢氧化钠（NaOH）	Sigma	S0899	用于 S. pneumoniae 转化
壮观霉素盐酸盐	SigmaAldrich	PHR1426	用于细菌筛选
Subcloning Efficiency DH5α 感受态细胞	Invitrogen	18265017	用于构建 pSD1 和 pSD2