高分辨率完整视网膜与玻璃体成像的显微外科解剖与组织透明化技术

摘要

本文介绍了一种完整全 retina 成像的实验方案，通过手术去除眼球外部不透明/含色素的组织层，并应用光学透明化技术使 retina 变得透明，从而可在完整 retina 中利用光片荧光显微镜实现周边 retina 及玻璃体血管系统的可视化观察。

摘要

在生理和病理条件下，通过使用完整全视网膜成像技术，相较于传统的视网膜平铺制备和切片方法，能够更清晰地可视化和表征视网膜的神经元和血管结构。然而，完整全视网膜的免疫荧光成像受到眼球不透明外层（即巩膜、脉络膜和视网膜色素上皮层（RPE））以及视网膜各层光散射特性的阻碍，难以实现全层高分辨率光学成像。已有研究采用化学漂白色素层和组织透明化技术来克服这些障碍；但目前报道的方法尚不适用于在完整全视网膜中对绿色荧光蛋白（GFP）等内源性荧光分子进行成像。其他方法通过手术去除色素层及眼球前段以实现完整眼球成像，从而规避了这一限制，但会破坏周边视网膜和玻璃体结构。本文介绍一种结合巩膜/脉络膜/视网膜色素上皮层（RPE）的手术解剖、改良的组织透明化方法以及光片荧光显微镜（LSFM）的完整全视网膜及玻璃体免疫荧光成像方案。该新方法提供了前所未有的视网膜结构观察视野 视网膜中未受干扰的血管和神经结构，以及在病理状态下玻璃体和玻璃体血管系统。

引言

在健康和疾病状态下，视网膜神经元与血管成分之间的相互作用传统上通过免疫荧光技术对石蜡包埋或冷冻固定的视网膜组织切片，或视网膜铺片进行研究¹。然而，组织切片会破坏视网膜神经元和血管的连续性，尽管可通过相邻视网膜切片的三维重建来部分弥补，但该方法仍存在误差和人为假象。视网膜铺片制备也会显著破坏视网膜血管和神经元结构的完整性，以及相邻视网膜区域之间的空间连接关系²。作为替代方法，近年来已引入完整全视网膜成像技术，以在天然解剖位置下可视化视网膜神经元和血管成分的三维投射结构^2,3,4,5。

在完整全视网膜成像中，使用光片显微镜捕获完整全视网膜相邻区域（图块）中血管和神经元结构的荧光信号；随后将这些图块“拼接”在一起，以重建整个全视网膜的三维图像^2,3,4,5,<....

方案

所有实验均经德克萨斯大学医学分部机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。动物的使用与照护均遵循视觉与眼科研究协会（ARVO）关于在眼科与视觉研究中使用动物的声明。执行本实验所需的所有材料均列于材料表中。操作每一步骤时均需佩戴无粉手套。步骤6和步骤7还需参考显微镜的官方操作手册。

1. 动物准备

1. 根据适用的机构动物护理和使用委员会批准的方案处死实验小鼠（本实验采用的方法是：使用60 mg/kg氯胺酮和0.5 mg/kg右美托咪定联合麻醉，随后进行颈椎脱位）。立即开始将动物固定在解剖和心脏灌注用平台上。
   注意：实验动物的选择应根据具体研究设计而定。
2. 解剖腹部和胸腔以暴露心脏。通过将27 G针头插入左心室进行心脏灌注，同时在右心房制造一个小的（约1 mm）切口以允许血液流出²⁴。
   1. 首先灌注30–50 mL冰冻的磷酸盐缓冲盐水（PBS），然后灌注30–50 mL新配制的4%多聚甲醛（PFA）。
   2. 为确认PFA灌注成功，观察动物全身及尾部是否有明显的肌肉抽搐。随后进入眼球摘除步骤。

2. 眼球摘除与固定

1. 使用弯头钟表镊轻轻推挤上眼睑或下眼睑，使眼球从眼窝中突出。用另一把钟表镊或类似....

结果

视盘周围血管网络与小胶质细胞的零角度投影如图所示 图3A。此外，CX3CR1中完整全视网膜小胶质细胞的分布^-GFP 小鼠被展示于 图3B该方法的一个主要优势在于其能够对内源性荧光物质进行成像。 图3C，D 显示采用完整眼球成像方法制备的样本中代表性Z轴投影的微胶质细胞（绿色通道）图3C）以及平铺制备（图3D）。在随机选择的感兴趣区域中，对完整全层视网膜和视网膜平铺切片中的小胶质细胞进行了定量和比较。在小胶质细胞数量方面，视网膜平铺法与完整全层视网膜成像之间未观察到具有统计学意义的差异（图3E）。所有代表性图像均在 图3 从 CX3CR1 捕获^-GFP

讨论

视网膜和玻璃体的发育及其病理变化最适合通过完整眼球视网膜成像技术进行研究，该技术无需将视网膜切割成切片或制备成平铺标本。现有的完整眼球成像方法要么采用色素漂白，这会去除内源性荧光基团，要么需要物理性去除眼球的不透明外层结构（如视网膜色素上皮层、脉络膜和巩膜）以及眼前段组织，这些操作可能干扰周边视网膜和玻璃体结构。Chang 等人和 Prahst 等人去除了眼球的外层结构以及角膜，从而可能破坏玻璃体、玻璃体血管系统及周边视网膜^2,4。因此，他们的方法可能不适用于研究涉及玻璃体血管系统的视网膜与玻璃体发育及病理过程中的细胞特征。另一种方法中，Henning 等人和 Vigouroux 等人采用色素漂白技术使脉络膜和视网膜色素上皮层透明化以实现显微成像^3,5。然而，色素漂白会消除 GFP 信号，并可能影响其他内源性荧光基团以及用于活体染色的荧光探针的性能⁷。在本文.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
实验动物
CX3CR1-GFP 小鼠	杰克逊实验室	5582
麻醉剂
右美托咪定	Par Pharmaceutical	42023-146-25
氯胺酮	Fresenius Kabi
组织采集、固定与样本解剖
心脏灌注泵	费希尔科技	NC9069235
氰基丙烯酸酯超级胶水	amazon.com
精细剪刀—锋利型	精细科学工具	14160-10
精细镊子	精细科学工具	11412-11
多聚甲醛（PFA）	电子显微镜科学公司	15710-S
磷酸盐缓冲液（PBS）	吉比科	10010049
1号画笔	dickblick.com
直型弹簧剪	精细科学工具	15000-03
注射器，针头尖端，27号 × 1.25"	BD
1.5 ml、15 ml、50 ml 离心管	赛默飞世尔科技
Tween-20	赛默飞世尔	85114
免疫荧光染色
抗小鼠胶原蛋白IV抗体	Abcam	ab19808	1:200 稀释
抗兔 Alexa Fluor 568	英潍捷基	A-11011	1:200 稀释
正常山羊血清	赛默飞世尔	50062Z	10% 浓度
组织透明化
2,2′-硫代二乙醇（TDE）	Fluka analytica	STBD7772V
摇床振荡器	费希尔科技	02-217-765
显微成像
荧光微球	TetraSpeck	T14792
光片荧光显微镜（LSFM）	蔡司	Z1
小胶质细胞计数
ImageJ	美国国立卫生研究院