从人体胫骨前肌上部隔室采集骨骼肌活检样本以进行力学评估

摘要

本技术报告描述了一种改良的 Bergström 技术变体，用于胫骨前肌的活检，可限制肌纤维损伤。

摘要

收缩骨骼肌纤维的力学特性是评估整体肌肉健康、功能和表现的关键指标。通常需要采集人体骨骼肌活检样本以开展此类研究。然而，除常用的股外侧肌外，针对其他肌肉的活检操作技术描述相对较少。尽管活检技术常需根据所研究肌肉的特性进行调整，但很少有技术报告将这些调整向更广泛的研究社区分享。因此，在操作者反复摸索过程中，常导致人体受试者的肌肉组织被浪费。拓展多种肌肉的活检技术资料，有助于减少活检失败的发生。本技术报告介绍了一种改良的 Bergström 技术在胫骨前肌（musculus tibialis anterior）上的应用变体，该方法可最大限度减少肌纤维损伤，并获取足以用于力学评估的足够长度肌纤维。该手术为门诊手术，可在一小时内完成。术后恢复时间因活动类型而异：轻度活动（如步行）可立即恢复，正常体力活动恢复需最多三天，伤口护理约需一周。所获取的组织可用于机械力实验，本文展示了典型的激活数据。该方案适用于大多数样本采集目的，可能适用于其他骨骼肌，并可通过改进取样针具进一步优化。

引言

出于临床或研究目的对人体肌肉生理学进行研究时，通常需要进行肌肉活检。例如，人体肌肉生理学和生物力学领域的一个主要挑战是区分并理解肌肉功能对运动产生的各种适应性变化。这些功能适应不仅包括结构上的适应（例如，收缩蛋白和肌肉结构的变化），还包括神经适应¹，而在对完整的人体原位肌肉进行测试时，若非不可能，也极难单独评估这些神经适应。在肌纤维水平上开展实验可消除这些高阶因素的影响，从而更直接地评估肌肉收缩功能，而所需样本可通过活检技术获取。肌肉活检的采集历史至少可追溯至1868年²。如今，采集肌肉活检的主要技术是改良的Bergström法^3,4,5，尽管也存在其他技术，例如使用Weil-Blakesley骨凿钳⁶或所谓的细针活检法^7,8。所有这些技术均使用特制的针状器械，将其插入肌肉以切割并获取组织样本。具体而言，改良Bergström法采用一种改良的大号针具（此处针具尺寸为5 mm；图1），其针尖附近设有一个窗口，内部包含一根较小的可上下移动的套管针芯，当针芯经过针窗时即可切断肌肉组织。在中空的套管内部还设有一根推杆，可沿套管轴向移动，将活检组织推向针窗位置。为了将肌肉组织吸入针窗，需连接一根吸力软管，通过抽出针内空气产生负压，从而将肌肉组织吸入针窗内。

肌肉活检常用于研究疾病引起或运动干预后蛋白质含量、基因表达或形态学的变化^1,9,10,11。肌肉活检的另一重要用途是进行力学实验，例如测定肌纤维收缩力、肌纤维刚度以及依赖于历史状态的肌肉特性^{12,13,14,15,16}。单根肌纤维或肌纤维束的力学特性可通过专用装置测量，将纤维连接在长度控制器和力传感器之间，在控制纤维长度的同时同步测量产生的力。通过透化（例如剥除）肌纤维，肌膜对浴液中的化学物质变得通透，从而可通过调节钙离子浓度来控制肌纤维的激活。此外，通过将待测试剂加入浴液中，可方便地评估化学物质、药物或其他蛋白质对收缩特性的影响。然而，尽管该技术在其他动物模型中广泛应用，但针对人类肌肉活检获取的透化肌纤维进行力学测试的研究却明显较少^17,18,19。其中一个原因是，现有的活检工具和操作方案旨在尽可能多地获取肌肉组织，而较少关注组织提取过程中造成的结构损伤程度。事实上，近期的一种活检方案建议将活检针插入肌肉并采集2至4块肌肉组织³。这种方法本身对DNA或蛋白质材料的破坏较小，但常常严重破坏肌纤维和肌节结构，导致肌纤维无法稳定激活甚至完全不能激活。此外，活检样本中肌纤维的长度通常较短（<2 mm），难以用于力学测试。理想的用于力学测试的肌纤维应较长（3–5 mm）且无结构性损伤。

更先进的组织提取技术可用于减少纤维损伤。例如，某一研究小组²⁰ 利用先前计划好的前臂开放性手术（例如骨折修复术），在这些手术中肌肉被完全暴露，外科医生能够直观观察肌肉结构，并仔细分离出相对较大且结构完好的肌肉组织样本（15 mm × 5 mm × 5 mm）。当受试者已计划接受此类手术时，优先采用这种“开放性活检”技术，但这也限制了潜在受试者的范围，尤其是对于健康成年人而言，通常不会进行此类手术。因此，许多用于研究目的的活检均作为门诊手术进行，切口尽可能小，以降低感染风险、减少瘢痕形成并缩短愈合时间。因此，大多数活检样本的获取方式为 盲目地 （即操作者无法看到穿刺针穿过筋膜进入肌肉的过程）。这意味着活检样本的质量几乎完全依赖于操作者的技能和经验。每块肌肉在取材时都有其特有的困难，例如可能损伤神经和血管的风险、理想取材深度与位置的选择，以及选择合适的身体姿势以使肌肉尽可能松弛。遗憾的是，大多数针对特定肌肉的操作技巧并未被系统记录，因此每位医师在对不熟悉的肌肉进行活检时都不得不“从头摸索”。这种经验的缺乏通常导致多次取材质量较低，直到医师摸索出该肌肉活检的最佳操作方法。初级医师通常通过与经验丰富的同事交流来学习这些技能，但目前关于该主题的翔实且经过同行评审的文献相对较少，尤其是对于那些传统上不常用于活检取材的肌肉。考虑到上述情况以及招募人类志愿者进行活检的困难，显然需要提供更多教学资料，以最大限度提高每位受试者的活检成功率。

因此，本文的目的是介绍一种肌肉活检技术，提供可成功获取长而无损伤肌纤维片段的肌肉活检操作方案，以用于力学测试。人体肌肉活检通常在股外侧肌（musculus vastus lateralis）上进行，且大多数活检培训材料也集中于此肌肉。由于其相对较大的肌肉体积以及相对于皮肤较浅的位置，便于获取足够的肌肉组织，同时最大限度地减少患者的不适感和身体创伤^1,21。然而，在纵向训练研究中使用股外侧肌存在一些局限性。例如，在包含训练计划的实验方案中，受试者必须在通常持续2至6个月的时间内避免参与研究以外的额外训练。对于运动员而言，这往往难以实现，因为股外侧肌通常会在常规锻炼（如深蹲、跳跃）中被训练，或在运动项目中普遍使用（如跑步、骑行）。这些与研究目的无关的独立训练经历可能导致肌肉产生适应性改变，从而影响肌肉的力学特性、结构和生理状态，使得难以或无法明确判断实验方案对肌肉特性的真正影响。对于此类研究，理想的选择是采用一个通常不是训练重点的靶向肌肉。胫骨前肌（musculus tibialis anterior, TA）是一种理想的靶向肌肉，能够满足上述要求。此外，可通过可控的方法（如使用测力计）针对TA实施训练干预。目前几乎不存在关于TA肌肉活检的培训资料。因此，我们开发了一种改良方案，用于从TA获取相对无损伤的肌肉活检样本。

方案

注意：以下概述了一种从已参与另一项正在进行研究的志愿者胫骨前肌（TA）中获取机械性无损伤肌纤维的方案。该方案类似于Shanely等人³所描述的在股外侧肌中应用改良Bergström技术的方法。本文所提供的信息已由我们的研究团队优化，但可能并不适用于所有实验室或组织架构。我们仅提供指导性建议，并强烈建议初次开展活检采集的实验室在尝试任何人体试验前，先咨询具有经验的实验室团队。

本文开展的所有研究均经波鸿鲁尔大学体育科学学院伦理委员会批准。参与者在参加研究前均自愿签署书面知情同意书。

1. 实验准备

1. 在参与者咨询期间，通过详细询问其病史来评估排除标准（见下文）。
   1. 如果参与者在活检前6周内目标肌肉受过损伤，则应予以排除。确保参与者总体健康，无已知的肌肉或凝血功能障碍，并且当前未服用导致血液稀释的药物（例如阿司匹林）。
      注意：本研究中，我们选择中等活跃程度的参与者，并要求他们在活检前至少3天避免进行高强度或不习惯的下肢锻炼。然而，针对其他研究问题，这些标准可能有所不同。
2. 遵循德国法律和常规实践所规定的消毒与无菌技术，并由团队医生监督执行^22,23。该操作通常可在“床旁”进行，或在门诊手术室中完成。请咨询当地监管机构以获取指导。
3. 组建活检团队。我们建议活检团队由4人组成：一名负责活检采集的医生（或经过培训的专业人员）、一名协助医生的医疗助理、一名负责监测并与参与者沟通的助理，以及一名在取出肌肉组织后立即处理样本的助理。配备足够人员可在操作过程中发生医疗紧急情况时迅速提供患者护理。若操作熟练，团队也可缩减为两人：即医生与医疗助理共同承担患者护理和组织处理工作。
4. 让参与者与项目负责人/医生会面，共同审阅、讨论并签署知情同意书。详细采集病史（包括过敏史、下肢及胫骨前肌的损伤或手术史），若符合任一排除标准则不予纳入。应充分说明术后恢复过程及切口护理注意事项。
   1. 向参与者说明，术后会感到酸痛，但可立即行走；在术后最初48小时内下坡或上下楼梯通常会感到不适，一般在72小时后可恢复正常活动。最后，应说明为减少感染和机械摩擦，切口部位需至少包扎1周并保持清洁。

2. 使用B型超声可视化胫骨前肌

1. 指导受试者以舒适的仰卧位躺下，并尽可能放松腿部肌肉。使用定制装置（见下文）或由助手将踝关节保持在轻度背屈的位置，以模拟活检过程中的状态。
   注意：受试者的胫骨前肌（TA）必须充分放松，以真实反映活检过程中的肌肉特性。检查期间，应要求受试者进行肌肉的收缩与放松，以便观察肌肉结构的变化。
2. 使用超声探头观察胫骨前肌（TA）的浅层和深层肌间隔，评估肌肉结构，并确定进针深度和穿刺角度（图2A-B）。在皮肤上标记解剖标志。
   1. 需特别注意选择目标区域时避开主要的静脉、动脉或神经。
   2. 评估肌肉的横截面，目标是识别出位于胫骨前肌肌腹中央的腱膜（约在膝关节下方腿长的1/3处，胫骨嵴外侧2 cm）（图2B）。记录中央腱膜的位置和深度（通常为1.5–3 cm），以便在取样（Bergström针）时避免穿刺超过该位置。
   3. 将超声探头置于目标区域的近-远端方向，观察肌束的羽状角和肌肉厚度（图2A）。利用这些信息，有助于在无直接视觉引导的情况下，成功将取样针插入肌腹。保存目标部位在两个平面上的超声图像，供手术过程中后续参考。
3. 根据上述信息，制定针头向目标区域移动的操作计划。
   1. 计划在目标活检区域远端1–3 cm处做切口。当针头进入肌肉后，沿肢体长轴方向将针头旋转至与皮肤呈约45°角，然后向近端推进至活检区域。该策略可降低因用力过猛而导致针头刺入中央腱膜的风险。此外，针头的推进方向（远端或近端）可根据 操作者的惯用手进行调整。

3. 活检操作步骤

1. 指导受试者仰卧于手术台上，放松腿部肌肉。确保用帘子遮挡受试者的视线，使其无法看到活检部位。
   1. 通过将受试者的肢体置于固定装置中，使踝关节处于轻度背屈位置（中立位0–5°；图3），以消除肌肉腹部的被动张力。询问受试者是否仍能放松肌肉，因为过度背屈可能使其难以完全放松。
      备注：我们发现，从足部轻度背屈（不超过中立位5°，即足底与小腿呈垂直）的状态下采集活检样本，所获得的组织更一致且体积更大，优于足底屈曲角度更大的情况。用于保持踝关节背屈的装置为定制设备，但也可使用多种（廉价）自制装置实现相同效果。
2. 按照标准操作规程对选定的切口区域进行剃毛、清洁和消毒²⁴。
   备注：受试者的“清洁”区域应覆盖切口部位近端至远端约20 cm，内侧至外侧约10 cm。但应始终参考所在机构和/或国家对此类操作的相关规定（如有）。消毒程序包括先彻底擦洗皮肤，再使用医用级消毒喷雾充分喷洒四次。若受试者因任何原因离开操作台，必须重新执行消毒程序。
3. 在活检部位皮下注射1.5 cc含肾上腺素的2%利多卡因，作为局部麻醉剂和血管收缩剂。等待约20–30分钟的起效时间。
   备注：这些药物具有肌毒性，因此绝不可注入肌肉组织，仅限皮下组织注射。由于血管收缩作用，注射部位可能出现发白（肤色较浅者）或发灰（肤色较深者）的现象。
4. 使用皮肤捏提试验及无菌手术刀轻刺，确认麻醉药物已起效。
5. 在预先标记的活检部位，使用无菌手术刀做一条长约1 cm、沿近远方向的切口，切开皮肤和筋膜，暴露肌肉腹部。注意完全切开筋膜，因为活检针头为钝头，无法穿透未切开的筋膜。
6. 将活检针以垂直于皮肤的方向插入肌肉0.5–1.0 cm（图2C, 2E）。
   备注：操作者在推进针头穿过不同组织时，会感受到所需力度的变化：脂肪组织阻力最小，筋膜最坚韧，肌肉介于两者之间（但因受试者个体差异可能有所不同）。
7. 将针头调整至与皮肤呈约45°角，沿腿部长轴方向推进针头额外1–2 cm，直至针尖到达肌肉内的目标位置（图2D, 2F）。
   备注：医生应参考保存的超声图像，以考虑个体间肌肉尺寸的差异。由于切口仅够插入针头，医生需盲穿进针。随着经验积累，操作者会逐渐掌握一种特有的“手感”。初学者必须在经过培训的活检操作人员指导下学习该技术（详见讨论部分）。
8. 将100 mL注射器和软管连接至活检针（图1G）。通过拉动注射器活塞约15–20 mL，对Bergström针施加负压，使肌肉组织被吸入针窗内。随后，快速推动套管覆盖针窗，切断并获取肌肉组织。
   备注：在抽吸前及抽吸过程中，有时可在针窗上方的皮肤施加轻微压力，有助于将肌肉组织推入针窗内。
9. 缓慢旋转并轻柔地将针头从腿部拔出。拔针时应仅有轻微阻力。若阻力较大，可能提示组织仅部分被切断。此时应将针头重新送至目标位置，并再次尝试取样。
10. 使用针内推杆将已切下的组织向针窗方向推出。
11. 小心地从针头中取出样本。
    备注：将针头浸入收集液（见肌纤维制备部分）通常可使活检组织脱离针头。此外，也可使用注射器向针内注入空气，将样本推出。这些方法可避免使用镊子直接接触活检组织，减少损伤风险。若工具、手部（无论是否戴手套）或非无菌溶液接触了针头，则该针头不得继续用于后续操作。因此，若需立即进行第二次活检，必须更换新的无菌针头。该情况较为常见，建议常规准备多个无菌针头备用。
12. 确认所取组织为肌肉组织，而非脂肪或结缔组织。肌肉组织因其深红色而易于与其他组织区分（图4A）。有时采集到的组织可能并非肌肉，而是脂肪或结缔组织。
    1. 若已采集到足够量的肌肉组织，继续执行后续流程；若肌肉量不足，应再次尝试活检。
    2. 若需进行第二次活检，应密切监测受试者状态，因第二次进针偶尔会引起比首次更大的不适感。
13. 立即用收集液清洗肌肉样本，并准备用于单根肌纤维实验（详见肌肉活检处理与保存）。
    1. 由经验丰富的助手检查样本质量（见下文），评估是否需要进行第二次活检。另一名助手负责将样本送至处理环节，其余团队成员继续照护受试者。
14. 闭合切口。
    1. 使用无菌Leukostrip胶带闭合切口。先用一或多条胶带垂直于切口长轴方向贴合切口边缘，再以星形方式叠加更多胶带，以抵抗多方向的牵拉力。
       备注：正确执行此步骤可减少瘢痕形成。缝合也可采用，但非必需。其他选择包括伤口粘合胶。
    2. 在切口部位覆盖无菌敷料（如Leucomed T plus），以防感染。
    3. 使用自粘性弹性绷带（如Unihaft）包扎腿部，以限制初期出血并防止外部机械冲击。
    4. 再用丙烯酸压缩绷带包扎腿部，以防止出血，并保护内层绷带松脱或损坏。

4. 活检后护理

1. 要求受试者在操作后立即行走。局部可能会有酸痛感。指导受试者尽可能正常行走。
2. 指导受试者不要拆除绷带，也不要让水浸湿绷带。绷带必须至少保留以下时间：丙烯酸类绷带保留一天，粘性弹性绷带保留三天，伤口敷料保留七天。告知受试者如有需要可重新包扎。
   1. 根据个体需求定制受试者的活检后护理方案。由经过培训的助手或医师对受试者进行评估，并制定适当的活检后护理计划。对于本操作，我们建议对胫骨前肌（TA）的任何进一步体内神经肌肉测试，应与活检间隔至少一周。

5. 肌肉活检样本的处理与保存

1. 组织提取后，立即将组织放入含有僵直收集液的5 mL小瓶中（单位：mM：Tris (50)、KCl (2)、NaCl (100)、MgCl₂ (2)、EGTA (1)、蛋白酶抑制剂片剂 (1)，pH 7.0），轻轻振荡4–6分钟以洗去血液。
2. 将僵直液更换为新鲜的僵直液，轻轻振荡4–6分钟，然后在4 °C下保存4–6小时，以促进蛋白酶抑制剂保存液与血液的交换。
3. 将僵直液更换为过夜僵直液（单位：mM：Tris (50)、KCl (2)、NaCl (100)、MgCl₂ (2)、EGTA (1)、蛋白酶抑制剂片剂 (1)、50:50甘油，pH 7.0），并在4 °C下保存12–18小时。
4. 将过夜僵直液更换为50:50的僵直液:甘油混合液，于-20 °C保存，最长可保存3个月，或在-80 °C冰箱中保存一年。
   注意：该过程可使肌纤维膜通透化，从而允许人工调控钙离子进出细胞。此过程耗时较长，且在不同肌肉和物种之间可能存在差异。

结果

参与者全程耗时约一小时（10分钟咨询、10分钟超声检查、20分钟手术准备与麻醉给药、10分钟手术操作、10分钟恢复）。通常情况下，参与者会无意识地激活其腹直肌（TA），需持续提醒其尽可能保持肌肉放松。当活检针插入肌肉内时，参与者通常报告在活检针周围区域有独特的“压迫感”，偶尔会出现中度至重度不适。曾有一次，一名参与者在操作过程中脚趾出现轻微痉挛，但在拔出针头后立即缓解。活检组织大小通常为约50–100 mg（湿重）。参与者对操作的反应往往难以预测：有时参与者预期自己不会受到干扰，但过程中却出现晕厥征兆；而另一些人虽术前紧张，但在操作期间却完全未受影响。因此，我们认为让参与者通过交谈或使用手机分散注意力是一种良好的操作实践，以避免其注意力完全集中在正在进行的操作上。负责与参与者交谈的助手同时需密切观察其是否有痛苦、不适或晕厥的迹象。有时，活检样本中仅包含脂肪组织或结缔组织（通过组织呈淡白色判断）， 图 4A）。在这种情况下，会在参与者同意后立即进行第二次活检。通常，一次成功的活检将获得 >80% 肌肉组织图 4A)...

讨论

在本报告中，我们描述了一种从胫骨前肌（TA）获取结构完整肌肉组织的活检技术。我们发现，该方法能够获得足够数量的可用肌纤维（每50 mg收集的组织可制备5-10束肌纤维），适用于力学测试。此外，我们还获得了足量的组织，可用于后续的力学、遗传学和蛋白质组学实验。

通常有几种方法用于采集肌肉活检样本^3,4,6,27,28。所谓开放性活检²⁰可获得质量最高的肌纤维，因为外科医生会完全暴露肌肉并直接解剖取出样本。然而，开放性手术是一种侵入性较强的手术，由于存在与开放手术相关的潜在风险，无论研究问题如何，都不适合对健康受试者实施。侵入性最小的活检方法是细针活检^29,<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
26 号皮下注射针头，配 2 ml 玻璃注射器	B. Braun Melsungen AG Carl-Braun-Straße 1 34212 Melsungen, Hessen Germany	4606027V	药物给药
5 mm Berstöm 针	自制	N/A	组织采集。与其他 Berstöm 针类似
Acrylastic	BSN medical GmbH 22771 Hamburg	269700	弹性压缩绷带
完全蛋白酶抑制剂混合物	Roche Diagnostics, Mannheim, Germany	11836145001	将蛋白酶抑制剂片剂加入所有保存肌肉组织的溶液中
Cutasept	PAUL HARTMANN AG Paul-Hartmann-Straße 12 89522 Heidenheim Germany	9805630	皮肤消毒喷雾剂
Leucomed T plus	BSN medical GmbH 22771 Hamburg	7238201	带伤口垫的透明敷料，用于封闭伤口并防止感染
Leukostrip	Smith and Nephew medical Limitied 101 Hessle road, Hull Great Britain	66002876	伤口闭合
一次性外科手术刀	Aesculap AG Am Aesculap-Platz 78532 Tuttlingen Germany	BA200 系列	切口
Unihaft 粘性弹性绷带	BSN medical GmbH 22771 Hamburg	4589600	具有粘性、弹性的绷带，可防止机械冲击
Xylocitin 2% 含肾上腺素	Milbe GmbH Münchner Straße 15 06796 Brehna Germany	N/A	受控药物麻醉，血管收缩