利用单分子定位显微镜分析人iPSC来源心肌细胞中的α-肌动蛋白结合蛋白网络

摘要

形成正确的肌节网络对于诱导多能干细胞来源的心肌细胞的成熟至关重要。我们提出了一种基于超分辨率成像的方法，可对干细胞来源心肌细胞的结构成熟度进行定量评估，从而优化促进心脏发育的培养条件。

摘要

iPSC来源的心肌细胞成熟度是其在再生治疗、药物筛选和疾病建模中应用的关键问题。尽管已开发出多种分化方案，但获得具有成人心肌细胞表型特征的iPSC心肌细胞仍具挑战性。心肌细胞成熟的一个重要方面是形成高度有序的肌节网络，以确保强大的收缩能力。本文介绍了一种基于超分辨率显微技术的半定量分析方法，用于评估心肌细胞中α-肌动蛋白素网络的结构。通过光激活定位显微技术，比较了iPSC来源的心肌细胞与新生儿组织分离的心肌细胞的肌节长度和Z盘厚度。同时，我们强调了采用合适成像条件以获得可靠数据的重要性。结果表明，该方法能够以高空间分辨率对心肌细胞的结构成熟度进行定量监测，从而检测到肌节组织中细微的结构变化。

引言

心肌梗死或心肌病等心血管疾病（CVD）仍然是西方世界的主要死亡原因¹。由于人类心脏的再生能力较弱，亟需开发促进心血管疾病恢复的新策略。这些策略包括细胞替代疗法，以补充丢失的心肌细胞（CM），以及开发新型抗心律失常药物，实现有效且安全的药物干预。研究表明，诱导性多能干细胞（iPSC）是一种极具前景的细胞来源，可用于在体外无限生成人类心肌细胞，适用于再生治疗、疾病建模以及药物筛选检测的开发^2,3,4。

尽管目前已存在多种不同的心脏分化方案，但诱导多能干细胞（iPSC）来源的心肌细胞（CM）仍缺乏某些表型和功能特征，限制了其在体外和体内的应用^5,6。除了电生理、代谢和分子层面的变化外，心脏成熟过程还涉及肌节的结构组织，而肌节是实现细胞收缩和产生收缩力的基本功能单位⁷。成年心肌细胞具有高度有序的收缩装置，而iPSC来源的心肌细胞通常表现出肌节纤维排列紊乱，导致收缩能力下降以及收缩动力学异常^8,

方案

本方案中涉及新生小鼠和成年小鼠的所有步骤均遵循罗斯托克大学医学中心动物护理的伦理指南。

1. 诱导多能干细胞来源心肌细胞的培养与解离

1. 采用之前所述的二维单层培养法，将hiPSC-CMs分化培养25天¹⁷。
2. 将消化培养基预热至37 °C，支持培养基平衡至室温。
3. 用PBS洗涤细胞两次。
4. 向细胞中加入预热的消化培养基，在37 °C、5% CO₂条件下孵育12分钟。
5. 向细胞中加入支持培养基。
   注意：所加支持培养基的体积应为步骤1.4中所用消化培养基体积的两倍。
6. 使用5 mL血清移液管轻轻吹打使细胞脱落。
7. 在200 x g条件下离心5分钟，弃上清，将细胞沉淀重悬于3 mL hiPSC-CM培养基中¹⁷。
8. 以每孔75,000个细胞的密度将细胞接种至8孔玻璃底培养板中，培养3天。

2. 成年心肌细胞的分离

1. 按照先前报道的方法分离并培养 NMRI 小鼠的成年心肌细胞¹⁸。
2. 将细胞接种于 8 孔玻璃腔室载玻片中，培养一天。

结果

为了评估心肌细胞（CM）结构成熟的程度，首先使用α-肌动蛋白抗体对新生期、完全成熟的成年期以及诱导多能干细胞（iPSC）来源的心肌细胞进行标记，以可视化肌节网络。在完成PALM成像后，对图像进行重建，并利用基于插件的图像处理软件测量Z盘厚度，该软件可自动检测单个肌丝的宽度。通过测量两个相邻强度峰之间的距离（对应于相邻肌丝）来计算肌节长度。图1展示了诱导多能干细胞（iPSC）来源的心肌细胞中肌节结构的评估结果。

如图2A所示，iPSC-CM与新生心肌细胞表现出相似的α-肌动蛋白素分布模式，具有不规则且排列紊乱的肌节结构。同样，定量评估显示，α-肌动蛋白素纤维的长度和厚度几乎相同，表明iPSC-CM处于未成熟的发育状态。更准确地说，平均肌节长度约为1.83 µm（成年型 vs. iPSC-CM vs. 新生儿CM：1.91 ± 0.02、1.83 ± 0.049 µm vs. 1.82±0.03 µm，n=20个细胞），而Z盘厚度约为74 nm（成年型 vs. iPS.......

讨论

在体外生成具有功能的诱导多能干细胞来源的心肌细胞（iPSC-CM）对于再生治疗、疾病建模以及药物筛选平台的开发具有重要意义。然而，这些心肌细胞成熟度不足是心血管研究中的主要障碍²⁰。在此背景下，亟需高分辨率成像技术，以实现对iPSC来源心肌细胞结构成熟状态的监测。同时，超分辨率显微镜可成为精确分析特定蛋白功能的有力工具，这些蛋白对于肌节的正常形成至关重要，近期针对肌联蛋白（titin）和肌钙蛋白（troponin）的研究已证实了这一点^10,21,22。

在本实验方案中，我们介绍了一种基于光激活定位显微镜（PALM）的方法，通过分析α-肌动蛋白素肌节网络来定量评估诱导多能干细胞来源心肌细胞（iPSC CM）的结构成熟度。

与传统的光学显微镜相比，PALM 能够以约 20–50 nm^23<.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
人iPSC细胞系	Takara	Y00325
µ-Slide 8孔玻璃底培养板	ibidi	80827
0.5 ml离心管	Eppendorf	30121023
牛血清白蛋白	Sigma Aldrich	A906
心肌细胞解离试剂盒	Stem Cell Technologies	05025
过氧化氢酶	Sigma Aldrich	C40-1G
环辛四烯	Sigma Aldrich	138924-1G
半胱胺	Sigma Aldrich	30070-10g
不含Ca²⁺和Mg²⁺的杜氏磷酸盐缓冲液	Thermo Fisher	14190169
F(ab')2-山羊抗小鼠IgG Alexa Fluor 647	Thermo Fisher	A-21237
Fiji图像处理软件（Image J）
葡萄糖	Carl Roth	X997.2
盐酸	Sigma Aldrich	H1758
LSM 780 ELYRA PS.1系统	Zeiss
多聚甲醛	Merck	8187150100
吡喃糖氧化酶	Sigma Aldrich	P4234-250UN
肌节性α-肌动蛋白抗体 [EA-53]	Abcam	ab9465
氯化钠	Sigma Aldrich	S7653
无菌水	Carl Roth	3255.1
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100
Trizma碱	Sigma Aldrich	T1503
β-巯基乙醇	Sigma Aldrich	63689