需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

利用单分子定位显微镜分析人iPSC来源心肌细胞中的α-肌动蛋白结合蛋白网络

5.4K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/61605

⸱

2020年11月3日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiac Surgery, Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Rostock University Medical Center, 2Faculty of Interdisciplinary Research, Department Life, Light & Matter, University Rostock, 3Department of Cardiology, Rostock University Medical Center

本文内容

摘要

形成正确的肌节网络对于诱导多能干细胞来源的心肌细胞的成熟至关重要。我们提出了一种基于超分辨率成像的方法，可对干细胞来源心肌细胞的结构成熟度进行定量评估，从而优化促进心脏发育的培养条件。

摘要

iPSC来源的心肌细胞成熟度是其在再生治疗、药物筛选和疾病建模中应用的关键问题。尽管已开发出多种分化方案，但获得具有成人心肌细胞表型特征的iPSC心肌细胞仍具挑战性。心肌细胞成熟的一个重要方面是形成高度有序的肌节网络，以确保强大的收缩能力。本文介绍了一种基于超分辨率显微技术的半定量分析方法，用于评估心肌细胞中α-肌动蛋白素网络的结构。通过光激活定位显微技术，比较了iPSC来源的心肌细胞与新生儿组织分离的心肌细胞的肌节长度和Z盘厚度。同时，我们强调了采用合适成像条件以获得可靠数据的重要性。结果表明，该方法能够以高空间分辨率对心肌细胞的结构成熟度进行定量监测，从而检测到肌节组织中细微的结构变化。

引言

心肌梗死或心肌病等心血管疾病（CVD）仍然是西方世界的主要死亡原因1。由于人类心脏的再生能力较弱，亟需开发促进心血管疾病恢复的新策略。这些策略包括细胞替代疗法，以补充丢失的心肌细胞（CM），以及开发新型抗心律失常药物，实现有效且安全的药物干预。研究表明，诱导性多能干细胞（iPSC）是一种极具前景的细胞来源，可用于在体外无限生成人类心肌细胞，适用于再生治疗、疾病建模以及药物筛选检测的开发2,3,4。

尽管目前已存在多种不同的心脏分化方案，但诱导多能干细胞（iPSC）来源的心肌细胞（CM）仍缺乏某些表型和功能特征，限制了其在体外和体内的应用5,6。除了电生理、代谢和分子层面的变化外，心脏成熟过程还涉及肌节的结构组织，而肌节是实现细胞收缩和产生收缩力的基本功能单位7。成年心肌细胞具有高度有序的收缩装置，而iPSC来源的心肌细胞通常表现出肌节纤维排列紊乱，导致收缩能力下降以及收缩动力学异常8,9。与具有单轴向收缩模式的成熟心肌细胞不同，未成熟心肌细胞中无序的结构会导致整个细胞呈径向收缩，或促进局部收缩点的出现9,10。

为了促进心肌细胞的成熟，已采用多种方法，包括三维细胞培养技术、电刺激和机械刺激，以及使用模拟体内环境的细胞外基质11,12,13。为了评估这些不同培养条件的效果与效率，需要借助技术手段来监测和估计诱导多能干细胞来源的心肌细胞（iPSC CM）结构成熟的程度，例如通过显微成像技术。与传统的共聚焦成像相比，光激活定位显微镜（PALM）的分辨率大约高出10倍。该技术因而能够实现更精确的分析，检测到细胞结构的细微变化14。鉴于PALM成像具有高分辨率，本方法的总体目标是通过对z-盘厚度和肌节长度的精确定量，显微评估由iPSC衍生的心肌细胞中肌节的成熟度。在既往研究中，这些结构特征已被证实是评估心脏成熟度的合适参数15。例如，缺乏全长dystrophin的疾病特异性iPSC-CM与野生型细胞相比，其肌节长度和z带宽度均减小16。同样，通过测量单个肌节的长度，可用来研究拓扑线索对心脏发育的影响16。因此，我们应用该方法，通过定量测定肌节长度和z-盘厚度，评估iPSC-CM中肌节网络的结构成熟程度。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

本方案中涉及新生小鼠和成年小鼠的所有步骤均遵循罗斯托克大学医学中心动物护理的伦理指南。

1. 诱导多能干细胞来源心肌细胞的培养与解离

  1. 采用之前所述的二维单层培养法，将hiPSC-CMs分化培养25天17。
  2. 将消化培养基预热至37 °C，支持培养基平衡至室温。
  3. 用PBS洗涤细胞两次。
  4. 向细胞中加入预热的消化培养基，在37 °C、5% CO2条件下孵育12分钟。
  5. 向细胞中加入支持培养基。
    注意：所加支持培养基的体积应为步骤1.4中所用消化培养基体积的两倍。
  6. 使用5 mL血清移液管轻轻吹打使细胞脱落。
  7. 在200 x g条件下离心5分钟，弃上清，将细胞沉淀重悬于3 mL hiPSC-CM培养基中17。
  8. 以每孔75,000个细胞的密度将细胞接种至8孔玻璃底培养板中，培养3天。

2. 成年心肌细胞的分离

  1. 按照先前报道的方法分离并培养 NMRI 小鼠的成年心肌细胞18。
  2. 将细胞接种于 8 孔玻璃腔室载玻片中，培养一天。

3. 新生儿心肌细胞的分离与培养

  1. 新生小鼠心肌细胞的分离步骤按照先前所述方法进行，细胞来源于NMRI小鼠19。
  2. 将分离的细胞以每孔75,000个细胞的密度接种于8孔玻璃培养板中，并在新生小鼠心肌细胞培养基中培养3天19。

4. α-肌动蛋白网络的免疫荧光标记

注意：为获得最佳结果，细胞应培养在8孔玻璃底培养板中。标记操作应在成像前一天进行。

  1. 将4% PFA在37 °C预热。
  2. 通过将4%多聚甲醛直接加入培养基中（1:1稀释）固定iPSC-CM，并在37 °C孵育15分钟。固定的最终PFA浓度为2%。
  3. 将固定后的细胞在含0.2% Triton-X的PBS中室温孵育5分钟。
  4. 用PBS洗涤细胞两次，每次5分钟。
  5. 加入1% BSA溶液（用PBS稀释），室温孵育60分钟。
  6. 在含0.05% Triton-X的1% BSA溶液中按1:100稀释α-肌动蛋白抗体，配制150 µL一抗溶液。加入细胞中，室温孵育60分钟。
  7. 用0.2% BSA溶液洗涤细胞两次，每次5分钟。
  8. 在含0.05% Triton-X的1% BSA溶液中按1:100稀释羊抗小鼠Alexa647二抗，配制150 µL二抗溶液。加入细胞中，室温孵育40分钟。
  9. 用0.2% BSA溶液洗涤细胞两次，每次5分钟。
  10. 用PBS洗涤细胞两次，每次5分钟。将标记后的细胞避光保存于4 °C，直至进行PALM成像。

5. PALM 成像缓冲液的制备

注意：每次实验都必须 freshly 配制 PALM 成像缓冲液。

  1. 通过将 25 g 葡萄糖溶解于 50 mL 蒸馏水中，制备 50% 葡萄糖溶液。
  2. 制备含有 50 mM Tris-HCl、10% 葡萄糖和 10 mM 氯化钠的基础缓冲液。
    1. 使用盐酸将 pH 值调节至约 8.0。
  3. 通过将 0.6 mg 吡喃糖氧化酶溶解于 316 µL 基础缓冲液中，制备吡喃糖氧化酶溶液。
  4. 通过将 7 mg 过氧化氢酶溶解于 500 µL 基础缓冲液中，制备过氧化氢酶溶液。充分混匀后，在 10,000 x g 下离心 3 分钟。保留上清液以供后续使用。过氧化氢酶溶液可在 4 °C 下保存数天。
  5. 通过混合 316 µL 吡喃糖氧化酶溶液、25 µL 过氧化氢酶溶液、100 µL 50% 葡萄糖溶液、50 µL 半胱胺、5 µL 环辛四烯和 3.5 µL β-巯基乙醇，制备 500 µL PALM 成像缓冲液。吡喃糖氧化酶和过氧化氢酶的最终催化活性需分别为 7.5 U 和 35,000 U。
    注意：PALM 成像缓冲液可提供 3–5 小时的最佳成像条件。若荧光染料的闪烁能力下降，请重新配制新的缓冲液分装液。

6. PALM 图像采集

  1. 使用前至少提前3小时开启显微镜，并在成像前将样品恢复至室温，以确保热平衡。如果显微镜配备有培养箱，请将温度调节至30 °C。
  2. 使用适当的清洁溶剂清洁物镜和腔室载玻片的底部。
  3. 向标记细胞的一个孔中加入300 µL PALM成像缓冲液，并将腔室载玻片插入显微镜的载物台固定装置中。
  4. 设置PALM图像采集参数。
    1. 选择1.57 N.A. 100x油镜进行采集。
    2. 选择PALM模式并激活TIRF设置。
    3. 调整要采集的帧数。通常采集5,000–10,000帧足以获得理想结果。然而，实际所需帧数在很大程度上取决于标记效率以及荧光染料的闪烁能力，用户可根据情况调整。
    4. 将紫外激光功率设为0.1%，647激光设为0.2%。
    5. 将增益水平设为50–100。
    6. 开启激光照明并选择目标细胞。若信号强度过低（取决于荧光标记情况），可适当提高增益水平。
    7. 关闭激光照明。
  5. PALM图像采集
    1. 将增益降至0，并将激光功率（647激发）提高至100%。
    2. 对目标细胞进行约5秒的漂白。
    3. 将增益提高至50，开始PALM图像采集。
      注意：需调整增益以获得足够的信号强度，同时应避免像素过饱和。若信号强度下降，可提高增益水平。
  6. 可选：逐步提高紫外激光功率（0.1%–10%），以增强信号强度并促进荧光分子的闪烁行为。

7. PALM 数据的重建

  1. 打开 Image J 软件并导入 PALM 数据。
  2. 打开 Thunderstorm 插件并点击“运行分析”
    1. 在“相机设置”菜单中输入像素大小和 EM 增益。
      注意：当使用 100 倍物镜和 1.6 倍放大镜头时，100 nm 的像素大小是合适的。然而，由于像素大小取决于用于 PALM 成像的显微镜和相机的硬件特性，用户需要仔细检查并调整此参数。EM 增益值可从元数据中获取。
    2. 在“运行分析菜单”中设置参数如下：B 样条阶数：3，B 样条尺度：2.0，峰值强度阈值：stf(Wave.F1)，拟合半径：3，初始 sigma：1.6，放大倍数：5.0，更新频率：50，横向位移：2。点击“确定”按钮确认设置。
  3. 重建 PALM 图像的后处理
    1. 在“绘制直方图”菜单中选择“Sigma”参数。
    2. 使用“矩形”工具选择一个感兴趣区域（ROI），排除可能的伪影，并将该 ROI 应用于滤波器。ROI 的数值将显示在滤波器命令框中。
    3. 在 ROI 数值后添加“& uncertainty <25”。一个可能的滤波器命令示例如下：“(sigma > 48.6821 & sigma < 1117.40) & uncertainty <25”。应用所选的 sigma 值。
    4. 在“去除重复”菜单中，输入距离阈值“10 nm”并应用。
    5. 在“合并菜单”中，将最大距离设为“20”，每个分子的最大帧数设为“0”，最大关闭帧数设为“1”。应用设置。
    6. 在“漂移校正菜单”中，选择互相关方法，并将“分箱数”设为“5”，“放大倍数”设为“5.0”。应用漂移校正设置。
    7. 保存最终的 PALM 图像，并根据需要导出后处理数据。

8. 肌节肌丝的分析

  1. 肌节长度分析
    1. 打开 Image J 软件并导入重建的 PALM 图像。
    2. 在选定的肌节结构之间绘制一条垂直于 Z 盘的直线，以测量肌动蛋白结合蛋白丝之间的最短距离。
    3. 在“分析”菜单中选择“轮廓分布”功能，并获取两个峰之间的长度。由于肌节长度在单个细胞内可能存在差异，应在目标细胞的不同区域至少测量 20 个肌节。
  2. Z 盘厚度分析
    1. 打开 Image J 软件并导入重建的 PALM 图像。
    2. 将重建的 PALM 图像转换为 8 位模式图像。
    3. 打开脊线检测插件，并输入以下参数：线宽：20，高对比度：230，低对比度：10，sigma：0.79，下阈值：25.84，最小线长：20。
    4. 勾选“估算宽度”、“延伸线条”和“显示结果”选项。
    5. 点击“确定”，并从结果表格中使用“平均线宽”进行后续分析。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

为了评估心肌细胞（CM）结构成熟的程度，首先使用α-肌动蛋白抗体对新生期、完全成熟的成年期以及诱导多能干细胞（iPSC）来源的心肌细胞进行标记，以可视化肌节网络。在完成PALM成像后，对图像进行重建，并利用基于插件的图像处理软件测量Z盘厚度，该软件可自动检测单个肌丝的宽度。通过测量两个相邻强度峰之间的距离（对应于相邻肌丝）来计算肌节长度。图1展示了诱导多能干细胞（iPSC）来源的心肌细胞中肌节结构的评估结果。

如图2A所示，iPSC-CM与新生心肌细胞表现出相似的α-肌动蛋白素分布模式，具有不规则且排列紊乱的肌节结构。同样，定量评估显示，α-肌动蛋白素纤维的长度和厚度几乎相同，表明iPSC-CM处于未成熟的发育状态。更准确地说，平均肌节长度约为1.83 µm（成年型 vs. iPSC-CM vs. 新生儿CM：1.91 ± 0.02、1.83 ± 0.049 µm vs. 1.82±0.03 µm，n=20个细胞），而Z盘厚度约为74 nm（成年型 vs. iPS...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

在体外生成具有功能的诱导多能干细胞来源的心肌细胞（iPSC-CM）对于再生治疗、疾病建模以及药物筛选平台的开发具有重要意义。然而，这些心肌细胞成熟度不足是心血管研究中的主要障碍20。在此背景下，亟需高分辨率成像技术，以实现对iPSC来源心肌细胞结构成熟状态的监测。同时，超分辨率显微镜可成为精确分析特定蛋白功能的有力工具，这些蛋白对于肌节的正常形成至关重要，近期针对肌联蛋白（titin）和肌钙蛋白（troponin）的研究已证实了这一点10,21,22。

在本实验方案中，我们介绍了一种基于光激活定位显微镜（PALM）的方法，通过分析α-肌动蛋白素肌节网络来定量评估诱导多能干细胞来源心肌细胞（iPSC CM）的结构成熟度。

与传统的光学显微镜相比，PALM 能够以约 20–50 nm23<...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究由欧盟结构基金（ESF/14-BM-A55-0024/18）资助。此外，H.L. 得到罗斯托克大学医学中心 FORUN 项目（889001 和 889003）以及约瑟夫与凯特·克林茨基金会（T319/29737/2017）的支持。C.I.L. 得到罗斯托克大学医学中心临床科学家项目的支持。R.D. 得到德国研究基金会（DFG，DA1296/6-1）、DAMP 基金会、德国心脏基金会（F/01/12）以及联邦教育与研究部（BMBF，VIP+ 00240）的支持。

感谢 Madeleine Bartsch 在诱导多能干细胞培养和心肌分化方面的技术支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
人iPSC细胞系TakaraY00325
µ-Slide 8孔玻璃底培养板ibidi80827
0.5 ml离心管Eppendorf30121023
牛血清白蛋白Sigma AldrichA906
心肌细胞解离试剂盒Stem Cell Technologies05025
过氧化氢酶Sigma AldrichC40-1G
环辛四烯Sigma Aldrich138924-1G
半胱胺Sigma Aldrich30070-10g
不含Ca²⁺和Mg²⁺的杜氏磷酸盐缓冲液Thermo Fisher14190169
F(ab')2-山羊抗小鼠IgG Alexa Fluor 647Thermo FisherA-21237
Fiji图像处理软件（Image J）
葡萄糖Carl RothX997.2
盐酸Sigma AldrichH1758
LSM 780 ELYRA PS.1系统Zeiss
多聚甲醛Merck8187150100
吡喃糖氧化酶Sigma AldrichP4234-250UN
肌节性α-肌动蛋白抗体 [EA-53]Abcamab9465
氯化钠Sigma AldrichS7653
无菌水Carl Roth3255.1
Triton X-100Sigma AldrichX100
Trizma碱Sigma AldrichT1503
β-巯基乙醇Sigma Aldrich63689

参考文献

  1. McAloon, C. J., et al. The changing face of cardiovascular disease 2000-2012: An analysis of the world health organisation global health estimates data. International Journal of Cardiology. 224, 256-264 (2016).
  2. Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. hiPSCs Derived Cardiac Cells for Drug and Toxicity Screening and Disease Modeling: What Micro- Electrode-Array Analyses Can Tell Us. Cells. 8 (11), 1331(2019).
  3. Ylä-Herttuala, S. iPSC-Derived Cardiomyocytes Taken to Rescue Infarcted Heart Muscle in Coronary Heart Disease Patients. Molecular Therapy. 26 (9), 2077(2018).
  4. Kadota, S., Shiba, Y. Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Transplantation for Heart Disease Treatment. Current Cardiology Reports. 21 (8), 73(2019).
  5. Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: Current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).
  6. Feric, N. T., Radisic, M. Maturing human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in human engineered cardiac tissues. Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 110-134 (2016).
  7. Ali, H., Braga, L., Giacca, M. Cardiac regeneration and remodelling of the cardiomyocyte cytoarchitecture. The FEBS Journal. 287 (3), 417-438 (2020).
  8. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).
  9. Bedada, F. B., Wheelwright, M., Metzger, J. M. Maturation status of sarcomere structure and function in human iPSC-derived cardiac myocytes. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1863 (7), 1829-1838 (2016).
  10. Dai, Y., et al. Troponin destabilization impairs sarcomere-cytoskeleton interactions in iPSC-derived cardiomyocytes from dilated cardiomyopathy patients. Scientific Reports. 10 (1), 1-15 (2020).
  11. Huang, C. Y., et al. Enhancement of human iPSC-derived cardiomyocyte maturation by chemical conditioning in a 3D environment. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 138, 1-11 (2020).
  12. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  13. Lee, S., et al. Contractile force generation by 3D hiPSC-derived cardiac tissues is enhanced by rapid establishment of cellular interconnection in matrix with muscle-mimicking stiffness. Biomaterials. 131, 111-120 (2017).
  14. Baddeley, D., Bewersdorf, J. Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images. Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).
  15. Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Švindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: A comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  16. Mahadev, K., Wu, X., Donnelly, S., Ouedraogo, R., Eckhart, A. D., Goldstein, B. J. Adiponectin inhibits vascular endothelial growth factor-induced migration of human coronary artery endothelial cells. Cardiovascular Research. 78 (2), 376-384 (2008).
  17. Lemcke, H., Skorska, A., Lang, C. I., Johann, L., David, R. Quantitative evaluation of the sarcomere network of human hiPSC-derived cardiomyocytes using single-molecule localization microscopy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 2819(2020).
  18. Ackers-Johnson, M., et al. A simplified, langendorff-Free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
  19. Lemcke, H., et al. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 117-127 (2016).
  20. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  21. Krysiak, J., et al. Protein phosphatase 5 regulates titin phosphorylation and function at a sarcomere-associated mechanosensor complex in cardiomyocytes. Nature Communications. 9 (1), 1-14 (2018).
  22. Zaunbrecher, R. J., et al. Cronos Titin Is Expressed in Human Cardiomyocytes and Necessary for Normal Sarcomere Function. Circulation. 140 (20), 1647-1660 (2019).
  23. Fornasiero, E. F., Opazo, F. Super-resolution imaging for cell biologists. BioEssays. Fornasiero, E. F., Opazo, F. , Wiley Online Library. (2015).
  24. Jeziorowska, D., et al. Differential Sarcomere and Electrophysiological Maturation of Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes in Monolayer vs. Aggregation-Based Differentiation Protocols. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1173(2017).
  25. Kroll, K., et al. Electro-mechanical conditioning of human iPSC-derived cardiomyocytes for translational research. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130, 212-222 (2017).
  26. Zuppinger, C., et al. Characterization of cytoskeleton features and maturation status of cultured human iPSC-derived cardiomyocytes. European Journal of Histochemistry. 61 (2), 145-153 (2017).
  27. Jradi, F. M., Lavis, L. D. Chemistry of Photosensitive Fluorophores for Single-Molecule Localization Microscopy. ACS Chemical Biology. 14 (6), 1077-1090 (2019).
  28. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
  29. Lampe, A., Haucke, V., Sigrist, S. J., Heilemann, M., Schmoranzer, J. Multi-colour direct STORM with red emitting carbocyanines. Biology of the Cell. 104 (4), 229-237 (2012).
  30. Chamma, I., Levet, F., Sibarita, J. B., Sainlos, M., Thoumine, O. Nanoscale organization of synaptic adhesion proteins revealed by single-molecule localization microscopy. Neurophotonics. 3 (4), 041810(2016).
  31. Ma, H., Fu, R., Xu, J., Liu, Y. A simple and cost-effective setup for super-resolution localization microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
  32. Olivier, N., Keller, D., Gönczy, P., Manley, S. Resolution Doubling in 3D-STORM Imaging through Improved Buffers. PLoS One. 8 (7), 0069004(2013).
  33. Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without ph drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
  34. Mikhaylova, M., et al. Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies. Nature Communications. 6 (1), 1-7 (2015).
  35. Venkataramani, V., et al. Enhanced labeling density and whole-cell 3D dSTORM imaging by repetitive labeling of target proteins. Scientific Reports. 8 (1), 1-7 (2018).
  36. Erdélyi, M., et al. Origin and compensation of imaging artefacts in localization-based super-resolution microscopy. Methods. 88, 122-132 (2015).
  37. McGorty, R., Schnitzbauer, J., Zhang, W., Huang, B. Correction of depth-dependent aberrations in 3D single-molecule localization and super-resolution microscopy. Optics Letters. 39 (2), 275(2014).
  38. Ribeiro, M. C., et al. A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).
  39. Pioner, J. M., et al. Isolation and mechanical measurements of myofibrils from human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Reports. 6 (6), 885-896 (2016).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

α-辅肌动蛋白网络光激活定位显微技术肌节长度分析Z线厚度测量心肌细胞成熟度评估超分辨率成像PALM图像重建荧光分子定位
利用单分子定位显微镜分析人iPSC来源心肌细胞中的α-肌动蛋白结合蛋白网络
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。