利用单分子定位显微镜分析人类 iPSC 衍生肌细胞中的α-Actinin 网络

摘要

形成适当的沙康网络对于 iPSC 衍生心肌细胞的成熟非常重要。我们提出了一种基于超分辨率的方法，允许对干细胞衍生心肌细胞的结构成熟进行定量评估，以改善促进心脏发育的培养条件。

摘要

iPSC衍生心肌细胞的成熟是它们在再生治疗、药物测试和疾病建模中应用的一个关键问题。尽管开发了多种分化方案，但类似成人表型的 iPSC 心肌细胞的生成仍然具有挑战性。心肌细胞成熟的一个主要方面是形成组织良好的沙科动物网络，以确保高收缩能力。在这里，我们提出了一种基于超分辨率的方法，用于对心肌细胞中α-actinin网络进行半定量分析。利用光激活定位显微镜，对从新生儿组织分离的 iPSC 衍生心肌细胞和心脏细胞的沙康长度和 z-disc 厚度进行了比较。同时，我们证明了适当的成像条件对于获得可靠数据的重要性。结果表明，该方法适合定量监测具有高空间分辨率的心脏细胞的结构成熟度，能够检测到沙康组织甚至细微的变化。

引言

心血管疾病（CVD）（如心肌梗塞或心肌病）仍然是西方世界^{的主要死因。}由于人类心脏只有不良的再生能力，因此需要制定战略来促进心血管疾病的恢复。这包括细胞替代疗法，以补充丢失的心肌细胞（CM），以及开发新的抗心律失常药物，以高效和安全的药物干预。诱导多能干细胞（iPSC）已被证明是一个有希望的细胞来源，无限代人类CM在体外，适合再生疗法，疾病建模，并用于药物筛选测定^{,2，3，43的发展}。²

虽然存在许多不同的心脏分化协议，iPSC衍生的CM仍然缺乏某些表型和功能方面，阻碍体外和体内应用^5,5，6。除了电生理、代谢和分子变化，心脏成熟过程涉及沙状物的结构组织，这是力生成和细胞收缩^{所需的基本单位}。虽然成人CMs表现出组织良好的收缩装置，iPSC衍生的CMs通常表现出不一和的沙康丝，与收缩能力降低和改变收缩动力学^8,8，9。与显示单轴收缩模式的成熟CM相比，未成熟CM中的迷失方向结构导致整个细胞的径向收缩或促进收缩焦点^{9、10,的出现}。

为了改善心脏成熟，已经应用了多种方法，包括3D细胞培养方法，电和机械刺激，以及使用细胞外基质模仿体内条件11，12，13。^11,12,13为了评估这些不同培养条件的成功和效率，需要技术来监测和估计 iPSC CM 的结构成熟程度，例如，通过微观技术。与传统共体成像相比，光激活定位显微镜 （PALM） 的分辨率高出约 10 倍。这种技术反过来允许更准确的分析，检测甚至微妙的变化的细胞结构^14。考虑到PALM成像的高分辨率，该方法的总体目标是通过精确测定z-Disc厚度和沙康长度，对psC衍生的CMs中沙科勒成熟度进行微观评估。在以前的研究中，这些结构特征已被证明是评估心脏成熟度^{15的适当参数}。例如，与野生细胞¹⁶相比，缺乏全长肌营养不良素的病症 iPSC-CM 表现出减少的沙康长度和 z 波段宽度。同样，测量单个沙形病的长度，以调查地形图线索对心脏发育^{的影响16。}因此，我们运用这种方法对 iPSC-CM 中沙康器网络的结构成熟度进行了定量测量，从而测量了沙康卡长度和 z-disc 厚度。

方案

本议定书中涉及新生儿和成年小鼠的所有步骤都按照罗斯托克大学医学中心动物护理的道德准则执行。

1. iPSC衍生心肌细胞的培养和分离

1. 使用 2D 单层方法区分 hiPSC-VM 25 天，如前面^所述。
2. 预热分离介质至37°C，支持中室温度。
3. 用 PBS 清洗细胞两次。
4. 将预预热分离介质添加到细胞中，在37°C和5%CO_{2下孵育12分钟}。
5. 向单元格添加支持介质。
   注:添加的支持介质的体积需要是步骤 1.4 中使用的分离介质的两倍。
6. 使用 5 mL 血清移液器将细胞分离。
7. 在200 x g的离心机 5分钟，并在3mL的hiPSC-CM培养介质^{17中重新暂停颗粒}。
8. 在8个井玻璃底室的种子细胞，细胞密度为75，000个细胞/井，培养3天。

2. 成人心肌细胞分离

1. 与¹⁸日报告，NMRI小鼠的成人心肌细胞的分离和培养进行了。
2. 种子细胞在8井玻璃室滑动和培养一天。

3. 新生儿心肌细胞的分离与培养

1. 从NMRI小鼠获得的新生儿心肌细胞的分离程序，^{如前所述。}
2. 种子隔离细胞在8井玻璃室滑动在细胞密度75，000细胞/井和培养3天在新生儿CM培养媒介^19。

4. α蛋白网络的免疫荧光标签

注:为了获得最佳效果，细胞在8个井玻璃底室中培养。标签应在成像前一天执行。

1. 37 °C 时的预热 4% PFA。
2. 通过将4%的甲状甲醛直接加入培养基（1:1稀释）并在37°C下孵育15分钟，修复 iPSC-CM。PFA的最终浓度为2%。
3. 在0.2%Triton-X中孵育固定细胞，在PBS中稀释，在室温下孵育5分钟。
4. 用 PBS 清洗细胞两次，每个 5 分钟。
5. 加入 1% BSA 溶液（在 PBS 中稀释），在室温下孵育 60 分钟。
6. 在 1% BSA 中稀释 α-actinin 抗体 1:100，含有 0.05% Triton-X，制备 150 μL 原抗体溶液。加入细胞，在室温下孵育60分钟。
7. 用 0.2% BSA 溶液清洗细胞两次，每个 5 分钟。
8. 通过稀释山羊抗小鼠Alexa647抗体1:100在1%BSA中，含有0.05%Triton-X，制备150μL的二级抗体溶液。加入细胞，在室温下孵育40分钟。
9. 用 0.2% BSA 溶液清洗细胞两次，每个 5 分钟。
10. 用 PBS 清洗细胞两次，每个 5 分钟。将标记的细胞保持在黑暗中 4 °C，直到 PALM 成像。

5. 准备PALM成像缓冲器

注意:为每个实验新鲜准备 PALM 成像缓冲区至关重要。

1. 在50 mL的蒸馏水中溶解25克葡萄糖，准备50%的葡萄糖溶液。
2. 准备含有50 mM Tris-HCl、10%葡萄糖和10mM氯化钠的基本缓冲液。
   1. 使用盐酸将 pH 电平调整为 ±8.0。
3. 在316μL的基本缓冲液中溶解0.6毫克火糖氧化酶，制备黄糖氧化酶溶液。
4. 在500μL的基本缓冲液中溶解7毫克的催化酶，制备催化酶溶液。在 10，000 x g 下彻底混合并离心 3 分钟。保留上一液，供进一步使用。加泰罗尼亚酶溶液可保持在4°C几天。
5. 通过混合316μL的黄酸氧化酶溶液、25μL的环酶溶液、100μL的50%葡萄糖溶液、50μL的环心胺、5微氧甲苯和3.5μL的β-甲基苯甲醇，制备500μL的PALM成像缓冲液。黄糖和乳糖酶的最终催化活性分别为7.5 U、35，00U。
   注:PALM 成像缓冲液为 3-5 小时提供最佳成像条件。如果荧光染料的闪烁能力降低，则准备新的缓冲液。

6. 掌上图像采集

1. 使用前至少打开显微镜 3 小时，并在成像前将样品置于室温，以便进行热平衡。如果显微镜配有孵化室，请将温度调节至30°C。
2. 使用适当的清洁溶剂清洁腔室滑轨的目标和底部。
3. 将 300 μL 的 PALM 成像缓冲液加入一个标记的电池井中，并将腔室幻灯片插入显微镜的台架。
4. 设置 PALM 图像采集参数。
   1. 选择 1.57 N.A. 100 倍油目标进行收购。
   2. 选择 PALM 模式并激活 TIRF 设置。
   3. 调整要获取的帧数。通常，5000-10，000 帧足以获得最佳结果。然而，获得的帧数量在很大程度上取决于荧光染料的标签效率和闪烁能力，并可由用户进行调整。
   4. 将紫外激光功率设置为 0.1%，将 647 激光功率设置为 0.2%。
   5. 将增益级别设置为 50-100。
   6. 打开激光照明并选择目标单元。如果信号强度较低（取决于荧光标记），增益电平可以增加。
   7. 关闭激光照明
5. PALM 图像采集
   1. 将增益减至 0，将激光功率（例如 647）提高至 100%。
   2. 漂白目标细胞 ±5 s。
   3. 将增益增加至 50 并开始 PALM 图像采集。
      注:需要调整增益以获得足够的信号强度，同时应避免过饱和像素。如果信号强度降低，请增加增益级别。
6. 可选地，稳步增强紫外激光功率（0.1%-10%）增加信号强度，促进荧光团的闪烁。

7. 棕榈数据的重建

1. 打开映像 J 软件并导入 PALM 数据。
2. 打开雷雨插件和 [运行分析]
   1. 在"相机设置"菜单中输入像素大小和EM增益。
      注:使用 100 倍目标和 1.6 倍放大镜头时，100 nm 像素大小合适。但是，由于像素大小取决于用于 PALM 成像的显微镜和相机的硬件功能，用户需要仔细检查和调整此参数。EM 增益值可以从元数据获取。
   2. 在"运行分析菜单"设置参数如下:B-样条顺序:3，B-样条比例:2.0，峰值强度阈值:stf（Wave.F1），拟合半径:3，初始西格玛:1.6，放大:5.0，更新频率:50，横向移位:2.通过点击"确定"按钮确认。
3. 重建的PALM图像的后期处理
   1. 在"绘图直方图"菜单中选择"西格玛"参数。
   2. 使用"矩形"工具选择 ROI，排除可能的人工制品，并应用 ROI 到过滤器。ROI 值将显示在筛选器命令框中。
   3. 在ROI 值中添加 "和不确定性 <25"。可能的筛选器命令将看起来像这样:"（西格玛 > 48.6821 & 西格玛 < 1117.40） & 不确定性 <25"。应用选定的西格玛值。
   4. 在"删除重复项"菜单中，输入"10 nm"的距离阈值并应用。
   5. 在"合并菜单"中，将最大距离设置为"20"，将每个分子的最大帧帧设置为"0"，将最大关闭帧设置为"1"。应用设置。
   6. 在"漂移校正菜单"中，选择交叉关联，将"箱数"设置为"5"，将"放大"设置为"5.0"。应用漂移校正设置。
   7. 根据需要保存最终的 PALM 图像并导出处理后的数据。

8. 沙康丝分析

1. 沙康长度分析
   1. 打开图像J软件并导入重建的PALM图像。
   2. 在垂直 z-disc 的选定 sarcomere 结构之间绘制一条线，以测量行为素丝之间的最短距离。
   3. 在"分析"菜单中选择"绘图配置文件"，并获取两个峰值之间的长度。由于沙康长度可能在一个细胞内变化，因此在目标细胞的不同区域中应测量至少20个沙彗线。
2. z-光盘厚度分析
   1. 打开图像J软件并导入重建的PALM图像。
   2. 将重建的 PALM 图像转换为 8 位模式图像。
   3. 打开山脊检测插件并输入以下参数:线宽:20，高对比度:230，低对比度:10，西格玛:0.79，低阈值:25.84，最小行长:20。
   4. 设置"估计宽度"，"延伸行"和"显示结果"。
   5. 单击 "确定"，并使用结果表中的 "平均线宽 " 进行进一步分析。

结果

为了估计CM、新生儿、完全成熟的成人和 iPSC CM 的结构成熟程度，最初用 α-actinin 抗体标记 CM 以可视化沙康网络。在PALM采集后，对图像进行了重建，并使用基于插件的图像处理软件测量了z-disc厚度，以自动检测单个细丝的宽度。通过测量两个相邻强度峰之间的距离（对应于相邻的长丝）计算了 Sarcomere 长度。 图 1 显示了 iPSC 派生 CM 中对 sarcomere 组织的评估。

如图 2A所示，iPSC-CM和新生儿细胞表现出与不规则、不α沙康结构相似的α-行为素模式。同样，定量评估表明，α-行为素丝的长度和厚度几乎完全相同，这表明 iPSC CM 的发育状态过早。更确切地说，平均沙康勒长度约为1.83μm（成人与iPSC CM与新生儿CM:1.91 ± 0.02 1.83 ± 0.049 μm对1.82±0.03 μm， n=20细胞），而 z-Disc 厚度约为 74 nm（成人与 iPSC CM 与新生儿 CM:71.30 ±...

讨论

体外功能 iPSC 衍生 CM 的生成对于再生疗法、疾病建模和药物筛选平台的发展非常重要。然而，这些CM的成熟度不足是心血管研究^{20的主要障碍}。在这方面，需要高分辨率成像技术，以便监测 iPSC 衍生 CM 的结构成熟状态。同时，超分辨率显微镜可以是一个有价值的工具，可以精确分析特定蛋白质的功能，需要适当的沙康，最近证明的滴定和肌^{蛋白10，21，22。,21,22}

在目前的协议中，我们提出了一种基于PALM的方法，通过分析一种基于PALP的方法来定量评估α-actininscomre网络的结构成熟度。

与传统光显微镜相比，PALM能够可视化分辨率为+20-50 nm^{23的细胞结构}。因此，它允许检测甚至微小的变化的心脏沙康网络，几乎或甚至无法检测到的经典光显微镜方法。应用PA...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
人 iPSC 细胞系	Takara	Y00325
µ-Slide 8 孔玻璃底	ibidi	80827
0.5ml eppendorf 管	Eppendorf	30121023
牛血清白蛋白	Sigma Aldrich	A906
心肌细胞解离试剂盒	干细胞技术	05025
过氧化氢酶	Sigma Aldrich	C40-1G
环辛四烯	Sigma Aldrich	138924-1G
半胱胺	Sigma Aldrich	30070-10g
不含 Ca2+ 和 Mg2+Thermo Fisher 14190169的 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水		F
（ab'）2-山羊抗小鼠 IgG Alexa Fluor 647	Thermo Fisher	A-21237
斐济图像处理软件（图 J）
葡萄糖	Carl Roth	X997.2
盐酸	Sigma Aldrich	H1758
LSM 780 ELYRA PS.1 系统	蔡司
多聚甲醛	默克	8187150100
吡喃糖氧化酶	Sigma Aldrich	P4234-250UN
肉节 &α;-肌动蛋白抗体 [EA-53]	Abcam	ab9465
氯化钠	Sigma Aldrich	S7653
无菌水	Carl Roth	3255.1
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100
Trizma 碱	Sigma Aldrich	T1503
β-巯基乙醇	Sigma Aldrich	63689