用于X射线相位对比成像的体外培养牛关节软骨组织活性成熟制备方法

摘要

本方案描述了制备 体外 用于高分辨率X射线成像的牛关节软骨。这些外植体在体外持续经历出生后的成熟过程。本文描述了从活检取样到三维X射线相位对比成像数据分析的必要步骤，包括外植体培养、组织固定及同步辐射样品制备。

摘要

理解介导出生后关节软骨成熟的机制，对于设计下一代组织工程策略以及潜在修复病变或受损软骨至关重要。通常情况下，关节软骨的出生后成熟是一个伴随机体生长而发生的组织胶原结构与功能的整体性转变过程，其时间尺度可达数月乃至数年。相反，软骨结构组织在长时间尺度上发生解体，则是组织退变的典型特征。随着发现生长因子可诱导软骨出现早熟性改变，我们对这些生物学过程进行深入研究的能力已得到显著提升。 体外 未成熟关节软骨的成熟过程。关节中发生的发育及疾病相关变化涉及骨骼与软骨，若能实现对这些组织的联合成像，将显著增进我们对其相互作用机制的理解。

目前，对于用于关节疾病随访的常规临床前成像技术而言，同时可视化软组织、软骨和骨组织的变化仍是一项亟待克服的挑战。三维X射线相位衬度成像技术（PCI）因其在低密度物体成像方面的高性能以及相较于传统X射线成像能够提供额外信息的能力，二十年来一直处于持续发展之中。

在本实验方案中，我们详细描述了从软骨活检、软骨细胞分离到体外扩增的全部操作步骤。 体外 成熟软骨的X射线相位对比成像数据采集与分析

引言

未成熟的关节软骨足以支持形态学、结构和生物分子层面的改变启动¹ 为了获得成年关节的特定功能，主要变化是胶原原纤维的重组：在未成熟软骨中，胶原原纤维相对于表面呈平行排列；而在成熟软骨中，深层组织中的胶原原纤维则呈垂直排列。成年软骨的假分层结构通过软骨细胞沿胶原原纤维排列方向的重新组织而显现，表层细胞呈盘状且平行于表面，而深层区域的细胞则逐渐变大并排列成柱状。出生后的成熟过程已知持续数月，并在青春期结束时基本完成，由于这一过程时间跨度较长，过去认为在详细程度上对这一重要发育转变进行研究极为困难，甚至在技术上难以实现。²。通过研究发现，成纤维细胞生长因子-2与转化生长因子-β1联合使用可诱导产生重要的生理和形态学改变，从而模拟关节软骨的成熟过程，这一发现为解决该问题取得了一定进展。^2,3 (图1生长因子诱导的 体外 成熟过程在三周内发生，且不需要任何生物力学刺激。培养后，II型胶原表达显著降低，成熟三价胶原交联与未成熟二价胶原交联的比率增加，这与成熟软骨中的变化一致。此外，细胞外基质和胶原原纤维的排列结构更接近于成熟软骨，尽管这一转变过程尚未完全完成。从生物化学角度看，经生长因子处理的软骨在组成上模拟了成人关节软骨。

方案

本文所述所有方法均经斯旺西大学伦理研究委员会批准，活检材料系在英国环境、食品与农村事务部许可下获取 & 英国环境、食品与乡村事务部（DEFRA）。本方案遵循本机构的动物护理指南。

1. 外植体培养

1. 从牛腿头皮制备外植体
   1. 准备吸收性保护垫和手术刀，标准外科手术刀配 #10 刀片。
   2. 用70%乙醇溶液喷洒所有材料。
   3. 用清水浸泡牛腿（屠宰场提供的7日龄雄性小牛，经兽医批准获取），以去除所有血液和污垢。
   4. 用肥皂清洁腿部，并用刷子擦洗。
   5. 当充分清洁后，用70%乙醇喷洒腿部。
   6. 将其放在吸水纸上。
   7. 用手术刀在脚部周围进行切割。
   8. 沿着腿部长度方向描绘一条精细的线条。
   9. 在关节区域需格外小心。
   10. 沿纵向手术刀划线小心地剥离腿部皮肤。
   11. 将废弃物（皮肤、使用过的组织、纸巾和手套）放入医疗废物袋中。
   12. 用肥皂清洁/刷洗腿部，并在皮肤去除后再次用乙醇消毒。
   13. 不要损伤靠近关节腔的区域。如果关节腔被打开或受损并有血液渗入，则不再无菌，该腿样本不可使用。
   14. 将腿部置于已用70%乙醇喷洒过的铝箔中。
   15. 在腿部末端套上尺寸合适的乳胶手套，以防止血液从近端流出或蹄部可....

结果

采用了一种基于传播的简单成像装置²⁵，如图3所示。在同步辐射传播相位成像中，一束相干X射线照射样品，引起空间变化的相位偏移¹⁹。当X射线束在穿过样品后继续传播时，畸变的波前会产生特征性图案。通过使用专用算法分析这些特征图案²³，可数值重建出样品引起的相位偏移。

使用所述方法获得的代表性相差成像切片如图4和图5所示。

培养3周后，按照先前所述方法对组织块进行固定。固定后的组织块可在4 °C下保存长达6个月。本实验在其固定后约30天进行。图4为样本软骨部分的3.5 µm厚轴向切面。其中可清晰观察到软骨细胞（细小的黑色圆形结构）、部分正在转化为骨细胞的特异.......

讨论

我们展示了一项从样本制备到图像可视化，包括数据采集方案的完整研究，用于 体外 快速成熟的关节软骨。同步辐射成像实验的结果显示了该模型的优良性能。

在本研究所提出的模型中，必须指出一些观察结果和局限性。这种“加速成熟”过程发生在培养的21天内。对于更长的培养周期，外植体组织块会开始退化，细胞代谢以及软骨细胞外基质（ECM）成分（如胶原蛋白和蛋白聚糖）的含量也会发生变化，具体详见参考文献²⁷。然而，在本模型中，在21天的时间范围内，组织仍保持稳定^2,3。该模型的复杂重塑动态可以被评估。尽管成熟后的软骨在生化和生物力学特性方面模拟了成年软骨，但本模型并未展现出与成熟软骨类似的胶原取向的完全重排。我们认为，这可能是由于赖氨酰氧化酶-L1（LOXL1）亚型的过表达，诱导了组织内的交联，从而抑制了胶原的进一步重排¹⁰。软骨生长的力学机制已通过连续混合模型进行建模

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>材料：生物制品
DMEM/F-12 (1:1) (1X) + GlutaMAX 杜尔贝科改良伊格尔培养基 F-12 营养混合物（Ham）500 mL	Gibco（隶属于 Life Technologies）	31331-028
庆大霉素试剂溶液，50 mg/mL	Gibco（隶属于 Life Technologies）	15750-060
HEPES，特殊制备，1 M，pH 7.5，过滤	Sigma	H-3375
胰岛素-转铁蛋白-硒（Insulin-Transferrin-Selenium，ITS）	Gibco（隶属于 Life Technologies）	51500-057
L-抗坏血酸-2-磷酸，三水合半镁盐，95%	Sigma	A8960-5G
中性缓冲福尔马林（NBF）	Sigma Aldrich	HT501128
磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4	Gibco（隶属于 Life Technologies）	10010023
<强>培养设备：
吸水保护垫，Benchkote	WhatmanTM	货号 2300731，	聚苯乙烯背衬，460 厘米 × 50 米
Accurpette VWR
可高压灭菌处理袋			用于处理受污染的塑料实验器皿时，应保持瓶口敞开，以允许蒸汽进入，危险废物，STERILIN（白色袋）
活检打孔器	MILTEX 由 KAI 生产	参考文献 33-36	4 && 6 mm 直径
用于替代处理的中等负荷医疗废物			（联合国批准重量5kg，UN封口方式，UN-SH4/Y5/S/II/GB/4/06（橙色袋）
Eppendorf管			0.5 mL 和 1.5 mL
Falcon 管			15 mL 和 50 mL
无可见的RNase、DNase、DNA污染&内毒素 1000µl 斜面刻度滤芯吸头	Starlab，TipOne（无菌）	S1122-1830
无可见的RNase、DNase和DNA污染&和热原 20µ斜切带刻度滤芯吸头	Starlab，TipOne（无菌）	S1120-1810
无可见 RNase、DNase 和 DNA 污染&Pyrogens 200µl 斜面刻度滤芯吸头	Starlab，TipOne（无菌）	S1110-1810
培养箱			37℃培养箱°5% CO2 的加湿环境
光学显微镜
移液器助吸器			25 mL、10 mL 和 5 mL 无菌塑料移液管
移液管（25-10-5 ml）	CellStar，Greiner Bio-one
塑料镊子	Oxford Instrument	AGT 5230
手术刀
提示			P1000、P200 和 P10 移液器，配 P1000、P200 和 P10 吸头（无菌）
组织培养罩
真空泵
37 ℃水浴°C
孔板			12 &和 24 孔板
<强>防护设备：
面罩
手套
实验服
护目镜
<强>数据采集设备：
Fiji 软件			开源软件
PyHST 重建工具包			开源软件