用于X射线相位对比成像的体外培养牛关节软骨组织活性成熟制备方法

Caroline Bissardon; Yadan Zhang; Hélène Rougé Labriet; Sébastien Berujon; Laurent Charlet; Ilyas M. Khan; Emmanuel Brun; Sylvain Bohic

doi:10.3791/61607

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方法文章

用于X射线相位对比成像的体外培养牛关节软骨组织活性成熟制备方法

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DOI：

10.3791/61607

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2022年1月31日

Caroline Bissardon¹^,²^,³ , Yadan Zhang² , Hélène Rougé Labriet¹^,⁴ , Sébastien Berujon⁵ , Laurent Charlet³ , Ilyas M. Khan² , Emmanuel Brun¹ , Sylvain Bohic¹

¹Inserm UA07, Rayonnement Synchrotron pour la Recherche Biomédicale (STROBE), ²Centre of Nanohealth, Swansea University Medical School, ³ISTerre, Université Grenoble Alpes, CS, Grenoble Cedex 9, ⁴Novitom, R&D Grenoble, ⁵ESRF, European Synchrotron Radiation Facility, CS, Grenoble Cedex 9

本文内容

摘要

本方案描述了制备体外用于高分辨率X射线成像的牛关节软骨。这些外植体在体外持续经历出生后的成熟过程。本文描述了从活检取样到三维X射线相位对比成像数据分析的必要步骤，包括外植体培养、组织固定及同步辐射样品制备。

摘要

理解介导出生后关节软骨成熟的机制，对于设计下一代组织工程策略以及潜在修复病变或受损软骨至关重要。通常情况下，关节软骨的出生后成熟是一个伴随机体生长而发生的组织胶原结构与功能的整体性转变过程，其时间尺度可达数月乃至数年。相反，软骨结构组织在长时间尺度上发生解体，则是组织退变的典型特征。随着发现生长因子可诱导软骨出现早熟性改变，我们对这些生物学过程进行深入研究的能力已得到显著提升。体外未成熟关节软骨的成熟过程。关节中发生的发育及疾病相关变化涉及骨骼与软骨，若能实现对这些组织的联合成像，将显著增进我们对其相互作用机制的理解。

目前，对于用于关节疾病随访的常规临床前成像技术而言，同时可视化软组织、软骨和骨组织的变化仍是一项亟待克服的挑战。三维X射线相位衬度成像技术（PCI）因其在低密度物体成像方面的高性能以及相较于传统X射线成像能够提供额外信息的能力，二十年来一直处于持续发展之中。

在本实验方案中，我们详细描述了从软骨活检、软骨细胞分离到体外扩增的全部操作步骤。体外成熟软骨的X射线相位对比成像数据采集与分析

引言

未成熟的关节软骨足以支持形态学、结构和生物分子层面的改变启动¹ 为了获得成年关节的特定功能，主要变化是胶原原纤维的重组：在未成熟软骨中，胶原原纤维相对于表面呈平行排列；而在成熟软骨中，深层组织中的胶原原纤维则呈垂直排列。成年软骨的假分层结构通过软骨细胞沿胶原原纤维排列方向的重新组织而显现，表层细胞呈盘状且平行于表面，而深层区域的细胞则逐渐变大并排列成柱状。出生后的成熟过程已知持续数月，并在青春期结束时基本完成，由于这一过程时间跨度较长，过去认为在详细程度上对这一重要发育转变进行研究极为困难，甚至在技术上难以实现。²。通过研究发现，成纤维细胞生长因子-2与转化生长因子-β1联合使用可诱导产生重要的生理和形态学改变，从而模拟关节软骨的成熟过程，这一发现为解决该问题取得了一定进展。²^,³ (图1生长因子诱导的体外成熟过程在三周内发生，且不需要任何生物力学刺激。培养后，II型胶原表达显著降低，成熟三价胶原交联与未成熟二价胶原交联的比率增加，这与成熟软骨中的变化一致。此外，细胞外基质和胶原原纤维的排列结构更接近于成熟软骨，尽管这一转变过程尚未完全完成。从生物化学角度看，经生长因子处理的软骨在组成上模拟了成人关节软骨。³.

文章中使用的模型基于一个体外从7日龄雄性牛犊的掌指关节内侧髁外侧部分，在无菌条件下切取直径为4或6 mm的组织块进行培养，每个组织块的基底部保留一层薄的钙化软骨和软骨下骨。关节软骨在经典的无血清培养基中培养，该培养基为高糖（4.5 g/L）的DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基），并添加胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS）、10 mM HEPES缓冲液（pH 7.4）、抗坏血酸和50 µg/mL庆大霉素。培养基中还补充100 ng/mL成纤维细胞生长因子2（FGF-2）和10 ng/mL转化生长因子β1（TGF-β1），每三天随换液重新添加一次²通过联合使用生长因子可诱导软骨快速成熟，这些变化在21天内发生。生长因子刺激还可诱导软骨基底侧的细胞凋亡与吸收，以及表层软骨细胞的增殖。³培养基的成分如以下所述。表1参照 Khan 等人 2011 年建立的模型²，关节软骨外植体在含有10 ng/µL TGF-β1和100 ng/µL FGF2的培养条件下进行培养（储存浓度分别为10 μg/mL和100 μg/mL，溶于磷酸盐缓冲液/0.1% BSA中）。每1 mL培养基中加入各1 µL的生长因子。DMEM-F12（含L-谷氨酰胺和高糖）是一种人工培养基，添加胰岛素、转铁蛋白和硒（ITS）、抗坏血酸、庆大霉素及HEPES后，可为不同细胞系及外植体培养提供满足其特定生理生长需求的完全培养补充成分。DMEM-F12由多种不同的无机盐组成（如NaCl、KCl、CaCl₂）₂，MgCl₂，NaH₂PO₄）、葡萄糖、氨基酸（氮源）、维生素、辅因子和水。这些盐类提供了充足的能源，以维持细胞在培养条件下的存活和正常生长。矿物离子有助于保持接近天然生理环境的渗透压。采用较高浓度的葡萄糖（4.5 g/L），因为软骨细胞主要通过糖酵解进行呼吸。添加F12培养基是为了提供多种硫酸根来源以及CuSO₄₄，FeSO₄，ZnSO₄₄ 和 MgSO₄₄ 用于硫酸化糖胺聚糖的合成。通过显色指示剂（此处为酚红）和CO₂/HCO^-₃ 缓冲液与磷酸盐结合后，pH值可稳定维持在接近7.4的水平。软骨细胞主要通过糖酵解进行呼吸代谢，其终产物为乳酸，会导致局部pH下降；因此，在缺乏生物力学作用以清除局部产生的乳酸的情况下，HEPES有助于维持生理过程所需的缓冲环境。庆大霉素是一种氨基糖苷类抗生素，可通过抑制细菌生长来控制外部污染。抗坏血酸因其抗氧化作用而被用作培养基的补充成分⁴抗坏血酸是脯氨酰羟化酶的辅因子，该酶可催化胶原蛋白中脯氨酸残基的羟基化，从而稳定其三螺旋结构。转铁蛋白通常作为细胞外抗氧化剂，具有降低毒性及活性氧水平的作用。⁵^,⁶它还被添加到培养基中，因其能够提供并促进细胞培养中细胞外铁的储存与转运。在生理条件下，转铁蛋白与铁结合非常紧密，几乎不存在游离铁来催化自由基的生成。⁷胰岛素激素与其受体结合后启动的信号通路可促进多种物质的吸收，如葡萄糖和氨基酸。该信号通路还参与多种细胞内过程，包括胞内转运、脂质生成以及蛋白质和核酸的合成。胰岛素具有促进生长的作用。复合溶液“胰岛素-转铁蛋白-硒”中还含有硒，以亚硒酸钠形式存在。在细胞培养中，硒主要作为（含硒）蛋白（如谷胱甘肽过氧化物酶，GPX）的辅助因子，发挥补充性抗氧化剂的作用。在体外关节软骨细胞中，ITS似乎通过抑制与细胞去分化和肥大分化相关的基因表达，促进细胞增殖并维持细胞表型⁸添加成纤维细胞生长因子-2和转化生长因子-β1等生长因子至培养基中，用于诱导并调控细胞分化、生长、修复及发育。²^,³FGF-2 与 TGF-β1 联合使用亦可强烈促进培养细胞和组织中的细胞增殖⁹.

这体外关节软骨成熟模型在三个方面具有重要价值。首先，该模型中的加速发育阶段转变使我们能够研究在数月时间内发生的细微变化，而这些变化在常规情况下难以察觉。体内例如在成熟过程中赖氨酰氧化酶-L1 表达升高¹⁰其次，关节软骨的组织工程面临一个难题：所生成的软骨具有各向同性的形态与结构，移植至关节内以修复局灶性缺损时功能不足。理解如何诱导软骨的成熟性变化，将加速开发出功能完备的可植入装置。第三，与本研究密切相关的是，某些退行性关节疾病（如儿童期发生的克山病），会导致成年期出现严重的关节畸形。该疾病明显与特定地理区域（中国）相关，这些地区普遍存在硒和碘的 endemic 缺乏，可能影响数千万居民。¹¹^,¹²^,¹³. 对大骨节病骨骼缺陷的检查显示，该病发生在青春期前后，提示其与骨骼成熟过程的紊乱有关。因此，为了进一步理解硒在关节软骨（AC）中的作用，需要一个可靠的软骨生长与发育模型。体外生长因子诱导的成熟模型为研究软骨在成熟过程中有无硒离子存在下的生长与代谢提供了一个有用的起点¹⁴^,¹⁵^,¹⁶我们对硒（Se）缺乏在复杂且相互关联的生物学过程中所产生影响的认识仍然十分有限。主要问题在于，硒作为一种研究对象元素，其作用范围具有局限性（所需浓度介于40至400 µg/kg之间）。¹⁷）以及极低的浓度。利用未成熟牛软骨的加速成熟模型，能够前所未有地观察发育重要阶段发生的生物学变化。生物体内硒（Se）浓度受到严格调控，该模型为开发可在成熟过程中精确定位硒的成像技术提供了起点。这些技术随后可能成为研究防止软骨退变策略的有力工具，并有望为基于再生医学的新型疗法奠定基础。

在传统的临床前成像方式中，同时可视化软组织、软骨和骨组织的变化是一个重大挑战，而这对于关节疾病的随访观察具有重要意义¹⁸^,¹⁹。例如，传统的X射线显微计算机断层扫描（µCT）对软组织的成像效果较差，因此仅限于显示骨缺损、骨赘以及对软骨的间接观察。另一方面，磁共振成像（MRI）通常用于软组织成像，但在疾病早期阶段，其对骨组织变化（如微小钙化）的精确呈现能力较差。能够灵敏地检测骨和软骨，并区分软骨中的构成细胞——软骨细胞，具有极其重要的意义。相位对比成像（PCI）基于X射线在材料中的折射率可比轻元素的吸收率高出上千倍的特性，从而相较于仅依赖吸收的传统方法，显著提高了软组织的对比度。因此，PCI能够对构成关节的所有组织进行成像，同时清晰呈现高吸收性组织（如骨）和低吸收性组织（如纤维软骨、韧带、肌腱、半月板以及相关软组织（滑膜和肌肉））¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹。

如参考文献²⁰所示，X射线相位衬度成像（PCI）在软骨的临床前成像中优于其他成像方式。本实验方案的目的是详细描述操作步骤并展示一些代表性结果。生长因子对未成熟软骨外植体作用的示意图见图1。

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方案

本文所述所有方法均经斯旺西大学伦理研究委员会批准，活检材料系在英国环境、食品与农村事务部许可下获取 & 英国环境、食品与乡村事务部（DEFRA）。本方案遵循本机构的动物护理指南。

1. 外植体培养

从牛腿头皮制备外植体
1. 准备吸收性保护垫和手术刀，标准外科手术刀配 #10 刀片。
2. 用70%乙醇溶液喷洒所有材料。
3. 用清水浸泡牛腿（屠宰场提供的7日龄雄性小牛，经兽医批准获取），以去除所有血液和污垢。
4. 用肥皂清洁腿部，并用刷子擦洗。
5. 当充分清洁后，用70%乙醇喷洒腿部。
6. 将其放在吸水纸上。
7. 用手术刀在脚部周围进行切割。
8. 沿着腿部长度方向描绘一条精细的线条。
9. 在关节区域需格外小心。
10. 沿纵向手术刀划线小心地剥离腿部皮肤。
11. 将废弃物（皮肤、使用过的组织、纸巾和手套）放入医疗废物袋中。
12. 用肥皂清洁/刷洗腿部，并在皮肤去除后再次用乙醇消毒。
13. 不要损伤靠近关节腔的区域。如果关节腔被打开或受损并有血液渗入，则不再无菌，该腿样本不可使用。
14. 将腿部置于已用70%乙醇喷洒过的铝箔中。
15. 在腿部末端套上尺寸合适的乳胶手套，以防止血液从近端流出或蹄部可能的污染。
16. 按照机构规定妥善处理废弃物。
组织块提取与培养
注意：组织块必须取自关节内部区域（图2，两个初始阶段）。为了保证条件一致，必须从相同区域打取四个（或六个）外植体，以便在形状和特性几乎相同的样本上施加四种（或六种）不同的处理。
1. 使用前25分钟打开超净工作台，用70%酒精清洁。
2. 将培养基放入水浴中预热。
3. 在24孔板的每个孔中加入1.5 mL基础培养基DMEM-F12（洗涤液）。
4. 另取一个培养板，加入1.5 mL完全培养基，置于37 °C培养箱中保存备用
5. 在架子上准备好材料：一个装有70%乙醇的通用管和另一个装有洗涤液的通用管。
6. 准备一把手术刀和一个4或6毫米的皮肤活检打孔器（置于酒精通用管中）。
7. 将试管和材料放入通风橱内。
8. 在通风橱内放置一张用70%乙醇喷洒过的吸水保护垫。
9. 准备一些用70%乙醇喷洒的组织。
10. 取一个解剖板，用铝箔覆盖。
11. 将之前准备好的相同鸡爪从冰箱（4 °C）中取出，并用70%乙醇喷洒。
12. 将危险废物和临床废物袋放置在通风橱附近，以便后续进行高压灭菌处理。
13. 用70%乙醇喷洒足部。
14. 在通风橱内操作，移动关节以确定应做切口的关节中线位置。
15. 取无菌手术刀。
16. 沿关节边缘的轮廓小心地沿中线切割。避免接触掌指关节内侧髁软骨。
17. 关节打开后，小心地切开韧带。
18. 将脚部下段丢弃至高压灭菌袋中。
19. 去除所有其他组织，以充分暴露关节的全部软骨图2).
  注意：切勿用脚触碰任何物品。
20. 将手术刀和皮肤活检打孔器放入酒精中，然后置于洗涤液中。
21. 用此打孔器在骨内侧面用力打出若干圆孔（每面4-5个）。
22. 使用完毕后，将生物打孔器置于酒精中清洗。
23. 使用手术刀在每两个圆圈之间划线，并沿骨的中线切割。
24. 从圆形活检样本的一侧边缘垂直切取软骨组织块，然后在软骨下骨处小心地进行水平切割。
25. 沿软骨下骨和钙化软骨水平切开穿孔线以下部位，以取出软骨组织块，组织块将自行弹出。
  注意：外植体应尽可能具有均匀的厚度。
26. 将外植体置于含有1.5 mL洗涤培养基的孔板中。
  注意：实验中应始终对来自关节同一部位的外植体进行对照和处理。
27. 检查外植体是否方向正确。外植体的表面应朝上，软骨下骨部分应朝向孔板底部。
28. 每次活检之间保持培养板封闭。
29. 移除洗涤液。
30. 用洗涤液再次清洗，然后继续置于洗涤液中 2–3 小时，使骨组织残留物和血液有足够时间从组织中流出。
31. 将组织块转移至含有完全培养基的新培养板中。注意：移液时切勿触碰任何物体。
32. 检查外植体是否仍处于正确位置（骨组织面向孔板底部）。
33. 清洁所有物品，并将医疗废物丢弃至指定地点。
34. 一旦将外植体置于37 ˚C、5% CO₂的培养箱中进行培养₂每两天更换一次温暖的新鲜培养基，以满足细胞/组织的多样化需求。检查外植体是否仍处于正确位置（骨组织面向培养板孔的底部）。
样本固定（可选）
注意：此步骤仅在细胞培养结束时进行，即培养3周后。此时，外植体已达到成熟阶段。
1. 在超净工作台中，用移液管以DMEM-F12培养基冲洗组织块。
2. 在超净工作台中，用移液管以 PBS 清洗外植体两次。
3. 在4 °C条件下用10% NBFS（中性缓冲福尔马林盐水）浸泡过夜固定。
4. 将固定的外植体置于含有 PBS 的微量离心管中
5. 将外植体储存于 4 °C。固定后的外植体在此条件下可保存长达 6 个月。

2. 成像实验的样品制备

根据样本和相机视野，使用适当尺寸的锥形塑料吸头（通常为 1 mL 吸头）。
用火焰加热锥形吸头末端将其密封，以获得防水的样本容器。
用 PBS 填充吸头。用镊子夹住样本并将其插入管中，通过缓慢晃动去除气泡。
将管固定在断层扫描台上，并通过拍摄简单的放射图像进行对齐。

3. X射线相位对比成像实验

将探测器放置在距离样品 2.5 m 的位置
使用双硅晶体系统在布拉格-布拉格几何结构下将X射线光子能量设定为 17 keV。
成像探测器由一个科学级CMOS相机²²与光学系统组合而成，在三维图像中实现各向同性的体素尺寸为 3.5 µm。
使用厚度为 60 µm 的硫氧化钆闪烁屏将X射线转换为可见光
数据采集：在样品旋转 360˚ 的过程中采集 2000 个投影，每个投影的曝光时间为 2 s。
采用相位恢复算法提取相位信号，具体方法如参考文献²³所述。该算法利用了样品内复折射率分布的先验知识。其主要假设（本研究未验证）是仅需重建一种材料。在此特定情况下，折射指数与吸收指数的比值设为 1,200，该值经实验观察为骨和软骨可视化效果的最佳折中值。
使用开源的、基于图形处理器（GPU）实现的 PyHST2 代码²⁴，采用标准的滤波反投影CT重建算法。

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结果

采用了一种基于传播的简单成像装置²⁵，如图3所示。在同步辐射传播相位成像中，一束相干X射线照射样品，引起空间变化的相位偏移¹⁹。当X射线束在穿过样品后继续传播时，畸变的波前会产生特征性图案。通过使用专用算法分析这些特征图案²³，可数值重建出样品引起的相位偏移。

使用所述方法获得的代表性相差成像切片如图4和图5所示。

培养3周后，按照先前所述方法对组织块进行固定。固定后的组织块可在4 °C下保存长达6个月。本实验在其固定后约30天进行。图4为样本软骨部分的3.5 µm厚轴向切面。其中可清晰观察到软骨细胞（细小的黑色圆形结构）、部分正在转化为骨细胞的特异...

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讨论

我们展示了一项从样本制备到图像可视化，包括数据采集方案的完整研究，用于体外快速成熟的关节软骨。同步辐射成像实验的结果显示了该模型的优良性能。

在本研究所提出的模型中，必须指出一些观察结果和局限性。这种“加速成熟”过程发生在培养的21天内。对于更长的培养周期，外植体组织块会开始退化，细胞代谢以及软骨细胞外基质（ECM）成分（如胶原蛋白和蛋白聚糖）的含量也会发生变化，具体详见参考文献²⁷。然而，在本模型中，在21天的时间范围内，组织仍保持稳定²^,³。该模型的复杂重塑动态可以被评估。尽管成熟后的软骨在生化和生物力学特性方面模拟了成年软骨，但本模型并未展现出与成熟软骨类似的胶原取向的完全重排。我们认为，这可能是由于赖氨酰氧化酶-L1（LOXL1）亚型的过表达，诱导了组织内的交联，从而抑制了胶原的进一步重排¹⁰。软骨生长的力学机制已通过连续混合模型进行建模

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致谢

作者感谢欧洲同步辐射装置（ESRF）提供站内机时。作者感谢Eric Ziegler在科学讨论方面提供的帮助。所描述的PCI实验在法国格勒诺布尔欧洲同步辐射装置（ESRF）的BM05光束线上完成。CB感谢奥弗涅-罗讷-阿尔卑斯大区Explora’doc项目以及斯旺西大学和格勒诺布尔-阿尔卑斯大学提供的奖学金对本研究部分经费的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号	评论
<强>材料：生物制品
DMEM/F-12 (1:1) (1X) + GlutaMAX 杜尔贝科改良伊格尔培养基 F-12 营养混合物（Ham）500 mL	Gibco（隶属于 Life Technologies）	31331-028
庆大霉素试剂溶液，50 mg/mL	Gibco（隶属于 Life Technologies）	15750-060
HEPES，特殊制备，1 M，pH 7.5，过滤	Sigma	H-3375
胰岛素-转铁蛋白-硒（Insulin-Transferrin-Selenium，ITS）	Gibco（隶属于 Life Technologies）	51500-057
L-抗坏血酸-2-磷酸，三水合半镁盐，95%	Sigma	A8960-5G
中性缓冲福尔马林（NBF）	Sigma Aldrich	HT501128
磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4	Gibco（隶属于 Life Technologies）	10010023

<强>培养设备：
吸水保护垫，Benchkote	WhatmanTM	货号 2300731，	聚苯乙烯背衬，460 厘米 × 50 米
Accurpette VWR
可高压灭菌处理袋			用于处理受污染的塑料实验器皿时，应保持瓶口敞开，以允许蒸汽进入，危险废物，STERILIN（白色袋）
活检打孔器	MILTEX 由 KAI 生产	参考文献 33-36	4 && 6 mm 直径
用于替代处理的中等负荷医疗废物			（联合国批准重量5kg，UN封口方式，UN-SH4/Y5/S/II/GB/4/06（橙色袋）
Eppendorf管			0.5 mL 和 1.5 mL
Falcon 管			15 mL 和 50 mL
无可见的RNase、DNase、DNA污染&内毒素 1000µl 斜面刻度滤芯吸头	Starlab，TipOne（无菌）	S1122-1830
无可见的RNase、DNase和DNA污染&和热原 20µ斜切带刻度滤芯吸头	Starlab，TipOne（无菌）	S1120-1810
无可见 RNase、DNase 和 DNA 污染&Pyrogens 200µl 斜面刻度滤芯吸头	Starlab，TipOne（无菌）	S1110-1810
培养箱			37℃培养箱°5% CO2 的加湿环境
光学显微镜
移液器助吸器			25 mL、10 mL 和 5 mL 无菌塑料移液管
移液管（25-10-5 ml）	CellStar，Greiner Bio-one
塑料镊子	Oxford Instrument	AGT 5230
手术刀
提示			P1000、P200 和 P10 移液器，配 P1000、P200 和 P10 吸头（无菌）
组织培养罩
真空泵
37 ℃水浴°C
孔板			12 &和 24 孔板
<强>防护设备：
面罩
手套
实验服
护目镜

<强>数据采集设备：
Fiji 软件			开源软件
PyHST 重建工具包			开源软件

参考文献

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用于X射线相位对比成像的体外培养牛关节软骨组织活性成熟制备方法

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