本实验方案描述了通过荧光激活细胞分选或免疫磁珠分离技术，从小鼠腹腔内白色脂肪组织（WAT）储存部位中分离脂肪生成性及纤维炎症性基质细胞亚群的技术方法。
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方法文章
从小鼠腹腔内脂肪组织库中分离脂肪生成性与纤维-炎症性基质细胞亚群
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
白色脂肪组织（WAT）的基质血管组分（SVF）具有显著的异质性，包含多种在成年期WAT的扩展与重塑过程中发挥功能作用的细胞类型。研究这种细胞异质性所带来影响的一个巨大障碍，是难以从WAT的SVF中有效分离出功能上不同的细胞亚群，用于体外和体内分析。单细胞测序技术最近在成年小鼠腹腔内WAT脂肪库中鉴定出功能不同的成纤维-炎症性细胞和脂肪生成性PDGFRβ+血管周围细胞亚群。成纤维-炎症性前体细胞（称为“FIPs”）是一类非脂肪生成性的胶原产生细胞，可表现出促炎表型。PDGFRβ+脂肪细胞前体细胞（APCs）在体外和体内细胞移植后均具有高度脂肪生成能力。本文中，我们描述了从鼠类腹腔内WAT脂肪库中分离这些基质细胞亚群的多种方法。FIPs和APCs可通过荧光激活细胞分选（FACS）或利用生物素化抗体介导的免疫磁珠技术进行分离。分离得到的细胞可用于分子和功能分析。对基质细胞亚群进行独立的功能特性研究，将从细胞水平上拓展我们对生理或病理条件下脂肪组织重塑机制的现有认知。
引言
白色脂肪组织（WAT）是哺乳动物能量储存的主要场所。在该组织中，脂肪细胞（又称“脂肪细胞”）以甘油三酯的形式将多余的热量储存于大型单房性脂滴中。此外，脂肪细胞还分泌多种调节能量稳态各个方面的因子1,2,3。脂肪细胞构成了WAT体积的大部分；然而，脂肪细胞仅占WAT中总细胞数的不到50%4,5。WAT中的非脂肪细胞组分，即基质-血管组分（SVF），具有高度异质性，包含血管内皮细胞、组织驻留免疫细胞、成纤维细胞以及脂肪细胞前体细胞（APC）群体。
在能量储存需求增加时，白色脂肪组织（WAT）具有显著的体积扩张能力，这一点十分独特。维持这种组织可塑性至关重要，因为将脂质充分储存于WAT中可防止脂质异位沉积到非脂肪组织中，从而避免有害后果6。在热量过剩的情况下，各个WAT脂肪库扩张的方式是决定肥胖状态下胰岛素敏感性的关键因素7。在患有代谢综合征的肥胖个体中所观察到的病理性WAT扩张，其特征是内脏WAT脂肪库优先扩张，而代谢上更有利的皮下脂肪组织则相对减少。此外，肥胖相关的胰岛素抵抗与WAT....
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方案
所有动物实验方案和操作均已获得德克萨斯大学西南医学中心机构动物使用与护理委员会的批准。
1. 从性腺白色脂肪组织中分离基质血管组分（SVF）
- 从6至8周龄小鼠中分离性腺白色脂肪组织，并将脂肪团块置于1× PBS溶液中。
- 合并最多4个脂肪组织（建议来自1至2只小鼠的2至4个脂肪团块），在含有200 µL消化缓冲液（1× HBSS、1.5% BSA和1 mg/mL胶原酶D）的10 mL烧杯中剪碎组织。
- 将剪碎的组织转移至含有10 mL消化缓冲液的50 mL离心管中。
- 在37 °C水浴中振荡孵育1小时。
- 通过100 µm细胞滤网过滤消化后的组织，以去除未消化的组织。
- 用含2% FBS的PBS将滤液稀释至30 mL，于4 °C以600 x g离心5分钟。吸除含有成熟脂肪细胞的上清液。
- 立即进行后续首选的细胞分离方法。
2. 使用流式细胞术分离APC和FIP
- 轻轻摇动离心管，将沉淀溶解于1 mL 1×红细胞裂解缓冲液中。
- 在室温下孵育1–2分钟。
- 加入10 mL含2% FBS的PBS溶液，并通过40 µm细胞滤网转移至干净的50 mL离心管中。
- 在4 °C下以600 ....
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结果
本方案描述了两种可从成年小鼠腹腔内白色脂肪组织（WAT） depot 中分离出不同基质细胞群体的策略。可通过流式细胞荧光分选（FACS）分离获得 APCs 与 FIPs图1）或使用生物素化抗体进行免疫磁珠分离（图2）。两种方法均使用市售的试剂和抗体。免疫磁珠分离法可将gWAT基质血管组分（SVF）中的成脂性细胞与非成脂性细胞分离。流式细胞术分析显示，成脂性组分中75%的细胞为LY6C阳性。- CD9- APCs。 >非脂肪生成部分中有75%为FIPs（LY6C）+ 细胞）
图1：PDGFR的分离 β 通过FACS从性腺WAT中分离基质细.......
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讨论
C57BL/6 小鼠品系是饮食诱导肥胖研究中最常用的小鼠品系。当给予高脂饮食（HFD）时，C57BL/6 小鼠会迅速增重，并出现与肥胖相关的代谢综合征的一些显著特征（如胰岛素抵抗和高脂血症）。值得注意的是，伴随高脂饮食（HFD）喂养所发生的白色脂肪组织（WAT）扩张呈现出特定脂肪库的差异性19,20,21,22,23。皮下腹股沟白色脂肪库（iWAT）的扩张几乎完全通过脂肪细胞肥大实现，而性腺白色脂肪库（gWAT）的扩张则通过脂肪细胞肥大和增生两种机制共同完成。肥胖小鼠的 gWAT 脂肪库也是代谢性炎症的显著发生部位。因此，饮食诱导肥胖小鼠的 gWAT 脂肪库为研究与肥胖相关的多种脂肪组织重塑特征提供了一个理想的模型。
近年来，最常用的前瞻性分离脂肪组织中脂肪前.......
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披露
T.A.P. 是诺和诺德公司（Novo Nordisk A/S）的员工和股东
致谢
作者感谢 Lisa Hansen 和 Kirsten Vestergaard 提供出色的技术支持，感谢 P. Scherer、N. Joffin 和 C. Crewe 对手稿的审阅。作者感谢德克萨斯大学西南医学中心（UTSW）流式细胞术核心实验室在建立本文所述实验方案过程中提供的卓越指导和帮助。R.K.G. 的研究工作得到美国国立卫生研究院（NIH）下属国家糖尿病、消化及肾脏疾病研究所（NIDDK）R01 DK104789、NIDDK RC2 DK118620 和 NIDDK R01 DK119163 项目的资助。J.P. 受丹麦创新基金博士前奖项资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 机械组织制备与基质血管组分（SVF）分离 | |||
| 40 和 100 µm 细胞筛 | Fisher Scientific | 352340/352360 | |
| 1× 磷酸盐缓冲液（PBS） | Fisher Scientific | 21040CV | |
| 5 ml 聚丙烯管 | Fisher Scientific | 352053 | |
| 消化缓冲液（配制 10 mL） | |||
| 10 ml HBSS | Sigma | H8264 | |
| 10 mg 胶原酶 D（终浓度 1 mg/ml） | Roche | 11088882001 | |
| 0.15 g BSA（终浓度 1.5%） | Fisher Scientific | BP1605-100 | |
| 抗原呈递细胞与非抗原呈递细胞的免疫磁珠分选 | |||
| 5× MojoSort 缓冲液（MS 缓冲液） | BioLegend | 480017 | |
| 5 ml MojoSort 磁力架（MS 磁架） | BioLegend | 480019 | |
| 100 µL MojoSort 链霉亲和素纳米磁珠 | BioLegend | 480015 | |
| 纯度检测与流式细胞分析（FACS） | |||
| 10× 红细胞裂解缓冲液 | eBioscience | 00-4300-54 | |
| Fc 封闭剂（小鼠 CD16/CD32） | eBioscience | 553141 | |
| 抗体 | |||
| 生物素标记 CD45 | BioLegend | 103103 | 浓度：≤ 每 10^6 个细胞 0.25 µg 物种：小鼠 克隆号：30-F11 |
| 生物素标记 CD31 | BioLegend | 102503 | 浓度：≤ 每 10^6 个细胞 0.25 µg 物种：小鼠 克隆号：MEC13.3 |
| 生物素标记 CD9 | BioLegend | 124803 | 浓度：≤ 每 10^6 个细胞 0.25 µg 物种：小鼠 克隆号：MZ3 |
| 生物素标记 LY6C | BioLegend | 128003 | 浓度：≤ 每 10^6 个细胞 0.25 µg 物种：小鼠 克隆号：HK1.4 |
| CD31-PerCP/Cy5.5 | BioLegend | 102419 | 浓度：稀释比 1:400 物种：小鼠 克隆号：390 |
| CD45-PerCP/Cy5.5 | BioLegend | 103131 | 浓度：稀释比 1:400 物种：小鼠 克隆号：30-F11 |
| CD140b PDGFRβ-PE | BioLegend | 136006 | 浓度：稀释比 1:50 物种：小鼠 克隆号：APB5 |
| LY6C-APC | BioLegend | 128016 | 浓度：稀释比 1:400 物种：小鼠 克隆号：HK1.4 |
| CD9-FITC | BioLegend | 124808 | 浓度：稀释比 1:400 物种：小鼠 克隆号：MZ3 |
| 细胞培养与分化 | |||
| 性腺来源 APC 培养基（配制 500 mL） | |||
| 288 mL 含 1 g/L 葡萄糖的 DMEM 培养基 | Corning | 10-014-CV | |
| 192 mL MCDB201 培养基 | Sigma | M6770 | |
| 10 mL 胎牛血清（FBS）** 批号#14E024 | Sigma | 12303C | |
| 5 mL 100% ITS 预混液 | BD Bioscience | 354352 | |
| 5 mL 10 mM L-抗坏血酸-2-磷酸 | Sigma | A8960-5G | |
| 50 µL 100 g/ml 基础 FGF | R&D systems | 3139-FB-025/CF | |
| 5 mL 青霉素-链霉素溶液（Pen/Strep） | Corning | 30-001-CI | |
| 500 µL 庆大霉素 | Gibco | 15750-060 | |
| **注意：原代 APC 的成脂能力可能因不同批次的商用胎牛血清（FBS）而异。建议测试多个批次或来源的 FBS。 |
参考文献
- Ouchi, N., Parker, J. L., Lugus, J. J., Walsh, K. Adipokines in inflammation and metabolic disease. Nature Reviews Immunology. 11 (2), 85-97 (2011).
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Funcke, J. B., Scherer, P. E.....
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