从小鼠腹内脂肪库分离成脂肪和纤维炎症基质细胞亚群

白色脂肪组织（WAT）是哺乳动物储存能量的主要场所。在这种组织中，脂肪细胞或"脂肪细胞"以甘油三酯的形式储存多余的卡路里，这些卡路里被包装成大的单房脂滴。此外，脂肪细胞分泌多种因子来调节能量稳态的各个方面 ^1,2,3。脂肪细胞占WAT体积的大部分;然而，脂肪细胞仅占 WAT ^4,5 中发现的总细胞的不到 50%。WAT 的非脂肪细胞区室或基质血管部分 （SVF） 具有相当异质性，包含血管内皮细胞、组织驻留免疫细胞、成纤维细胞和脂肪细胞前体细胞 （APC） 群体。

随着对储能需求的增加，WAT具有出色的扩展能力。保持这种组织可塑性至关重要，因为在 WAT 中充分储存脂质可以防止有害的异位脂质沉积到非脂肪组织中⁶.在肥胖的情况下，各个 WAT 仓库因热量过剩而进行这种扩张的方式是胰岛素敏感性的关键决定因素⁷.在患有代谢综合征的肥胖个体中观察到的病理性 WAT 扩张，其特征是内脏 WAT 库优先扩张，而牺牲代谢有利的皮下脂肪组织。此外，肥胖症中的胰岛素抵抗与 WAT 的病理重塑有关。其特征是现有脂肪细胞的肥大生长（尺寸增加），血管生成不足，慢性代谢炎症，细胞外基质成分（纤维化）的积累和组织缺氧^8,9。这些肥胖的 WAT 表型与肝脂肪变性和胰岛素抵抗有关，类似于在脂肪营养不良（缺乏功能性 WAT）条件下观察到的情况。相比之下，在代谢健康的肥胖人群中观察到健康的 WAT 扩张，其特征是保护性皮下 WAT 的优先扩张和通过脂肪细胞增生的仓库扩张¹⁰。新脂肪细胞的募集是通过从脂肪细胞前体细胞 （APC） 中新头分化脂肪细胞介导的（称为"脂肪生成"）。脂肪细胞增生与相对较低程度的 WAT 纤维化和代谢炎症相吻合 ^6,11。WAT 微环境中的多种细胞类型直接影响 WAT 在肥胖中的健康和可扩展性¹².因此，定义WAT中存在的各种细胞类型的功能仍然是该领域的重中之重。

在过去的十年中，已经采用了几种策略来定义和分离来自人和小鼠 WAT SVF¹³ 的天然 APC。这些策略使用基于抗体的细胞分离技术，根据常见间充质干细胞/祖细胞标志物的细胞表面表达分离 APC。这些方法包括使用荧光团标记抗体的荧光激活细胞分选 （FACS） 或免疫磁珠分离（即化学修饰的抗体）。靶向分离 APC 的细胞表面蛋白包括 PDGFRα、PDGFRβ、CD34 和 SCA-1。这些方法有助于丰富APC;然而，基于这些标记物分离的细胞群具有相当大的异质性。最近的单细胞 RNA 测序 （scRNA-seq） 研究强调了小鼠 WAT 14,15,16,17 分离的基质-血管部分 （SVF） 内基质细胞的分子和功能异质性。根据我们自己的 scRNA-seq 和功能分析，我们已经鉴定并表征了成年小鼠腹内 WAT 基质区室中功能不同的免疫调节和成脂 PDGFRβ+ 血管周围细胞亚群¹⁵。纤维炎症前体 （FIP） 是 PDGFRβ+ 细胞的重要亚群，可以根据 LY6C 表达（LY6C+ PDGFRβ+ 细胞）¹⁵ 进行分离。FIPs缺乏成脂能力，对各种刺激产生强烈的促炎反应，产生胶原蛋白，并分泌抗脂肪生成因子¹⁵。这些细胞的促炎和纤维化活性与小鼠肥胖有关而增加，表明这些细胞是WAT重塑的调节因子。LY6C-CD9-PDGFRβ+ 亚群代表脂肪细胞前体细胞 （APC）。这些 APC 富含 Pparg 和其他促脂肪基因的表达，并且在体外和体内很容易分化成成熟的脂肪细胞¹⁵。在这里，我们提供了一个详细的方案，用于使用FACS从成年小鼠的腹内WAT库中分离这些不同的细胞群，并使用生物素化抗体进行免疫磁珠分离。该协议可用于从成年雄性和雌性小鼠的多个腹内WAT库中分离功能不同的脂肪祖细胞亚群¹⁵。单独研究这些功能不同的细胞群可能极大地有助于我们目前对健康和疾病中调节脂肪生成和腹内脂肪组织重塑的分子机制的理解。

以下方案详细介绍了从小鼠附睾WAT中分离脂肪祖细胞的方法;然而，相同的程序可用于从雄性和雌性小鼠的肠系膜和腹膜后 WAT 库中分离相应的细胞¹⁵。关于如何在小鼠中识别和分离这些仓库的详细方案可以在Bagchi等人¹⁸中找到。该协议已针对6-8周龄的小鼠的使用进行了优化。APCs的频率和分化能力可能随着年龄的增长而下降。

所有动物协议和程序均已获得德克萨斯大学西南医学中心机构动物使用和护理委员会的批准。

1. 从性腺白色脂肪组织中分离基质血管分数 （SVF）

1. 解剖来自6-8周龄小鼠的性腺白色脂肪组织，并将脂肪垫置于1x PBS溶液中。
2. 结合多达 4 个脂肪库（推荐 1-2 只小鼠的 2-4 个脂肪库），并在含有 200 μL 消化缓冲液（1x HBSS，1.5% BSA 和 1 mg/mL 胶原酶 D）的 10 mL 烧杯中切碎组织。
3. 将切碎的组织转移到含有 10 mL 消化缓冲液的 50 mL 离心管中。
4. 在37°C的水浴中孵育混合物1小时，同时摇动。
5. 通过100μm细胞过滤器过滤消化组织以去除未消化的组织。
6. 用含有2%FBS的PBS将过滤样品稀释至30mL，并在4°C下以600 ×g 离心5分钟。 吸出含有成熟脂肪细胞的上清液。
7. 立即进行首选的细胞分离方法。

2. 使用FACS分离APC和FIP

1. 轻轻摇动试管，将沉淀溶解在 1 mL 1x RBC 裂解缓冲液中。
2. 在室温下孵育 1-2 分钟。
3. 加入 10 mL 2% FBS/PBS，并通过 40 μm 细胞过滤器进入干净的 50 mL 离心管中。
4. 在4°C下以600 ×g 离心5分钟。
5. 吸出培养基并将沉淀重悬于含有 Fc 块 （1:200） 的 400-800 μL 2% FBS/PBS 中。
6. 在4°C孵育10分钟。
7. 将 400 μL-800 μL 含有 ≤10⁶ 个细胞/mL 的细胞悬液转移到 1.5 mL 试管中，并加入抗体。抗体浓度列在 "材料表 "部分。
   1. 为 1） 未染色的细胞、2） 单色对照和 3） FMO（荧光减一）对照准备单独的对照管。
   2. 用PDGFRβ，CD45，CD31，CD9，LY6C抗体对样品进行染色。
8. 在4°C下避光孵育15分钟。
9. 在4°C下以600 ×g 离心5分钟。
10. 吸出培养基并将细胞重悬于 400 μL 2% FBS/PBS 中。
11. 在4°C下以600 ×g 离心5分钟。
12. 吸出培养基并将细胞重悬于 400-800 μL 2% FBS/PBS 中。然后将 40 μm 滤帽放入 5 mL 聚苯乙烯圆底管中用于 FACS。
13. 按照以下步骤进行门控。
    1. 使用无染色和单色对照进行补偿。
    2. 使用 FMO 控件设置实验门。
    3. 使用图 1 中所示的门控策略获取 APC 和 FIP。门 APC 为 CD45-CD31-PDGFRβ⁺ LY6C-CD9^- 和 FIPs 为 CD45-CD31-PDGFRβ⁺ LY6C⁺ 细胞。
14. 将分选的细胞收集在含有 500 μL 100% 血清的试管中，并将细胞保持在冰上。
15. 在4°C下以600 ×g 离心细胞5分钟。 加入2%FBS / PBS通过在4°C下再次以600 ×g 离心5分钟来洗涤细胞。 丢弃上清液，使用沉淀的细胞。
16. 将沉淀的细胞重悬于适当体积的性腺APC培养基（用于细胞培养）或适当的缓冲液中，以便进行后续分析。

3. 成脂和非成脂部分的免疫磁性分离

1. 按照步骤 1.1-1.7 从性腺白色脂肪组织中分离 SVF。
2. 吸出上清液并将 SVF 沉淀重悬于 10 mL 1x 市售 MS 缓冲液中。
3. 通过 40 μm 细胞过滤器过滤细胞悬浮液。
4. 在4°C下以600 ×g 离心5分钟。
5. 吸出上清液并将沉淀的细胞重悬于 100 μL 的 1x MS 缓冲液中。
6. 如下所述进行CD31 ⁺ 和CD45 ⁺ 细胞耗竭（图2A， 步骤1）。这样做是为了去除内皮细胞和造血谱系细胞。
   1. 使用细胞计数器计数细胞，并将浓度调节至 ≤ 1 x 10⁸ 个细胞/mL。
   2. 将生物素偶联的 CD31 和 CD45 抗体加入细胞悬液中，每个抗体的浓度为每 10⁶ 个细胞 ≤ 0.25 μg，并在冰上孵育 15 分钟。
   3. 通过加入 4 mL 1x MS 缓冲液洗涤细胞。
   4. 在4°C下以600 ×g 离心5分钟。
   5. 吸出上清液并用 100 μL 1x MS 缓冲液重悬沉淀。
   6. 加入 10 μL 链霉亲和素纳米珠，将细胞在冰上孵育 15 分钟。
   7. 通过加入 4 mL 1x MS 缓冲液洗涤细胞。
   8. 在4°C下以600 ×g 离心5分钟，然后吸出上清液。
   9. 将细胞重悬于 2.5 mL 1x MS 缓冲液中，并转移到 5 mL 聚丙烯管中。
   10. 将管子放入磁铁架中 5 分钟。
   11. 通过将细胞悬浮液倒入干净的 15 mL 离心管中来收集未标记的细胞。
       注意:避免摇晃或吸干悬挂的液滴，因为这会导致不需要的细胞部分污染。
   12. 从磁铁上取下管子并重复步骤 3.6.9。到 3.6.11。再洗两次，共洗 3 次。
7. 脂肪生成和非脂肪生成部分的分离（图2A， 步骤2）
   1. 继续处理未标记的馏分（即CD45-CD31^-馏分）。
   2. 将含有未标记细胞的15mL管在4°C下以600 ×g 离心5分钟。
   3. 吸出上清液并将沉淀重悬于 100 μL 1x MS 缓冲液中。
   4. 加入生物素偶联的LY6C和CD9抗体，浓度分别为每10⁶ 个细胞≤0.25μg，并在冰上孵育15分钟。
   5. 按照步骤 3.6.3 操作。到 3.6.12。完成第二次分离。
   6. 收集未结合的分数。未标记的细胞（LY6C-CD9^-）代表含有APC的脂肪生成部分（图2A，步骤3）。
   7. 从磁体中取出试管，重悬并在 1x MS 缓冲液中洗脱结合的细胞。洗脱液或标记的馏分（LY6C ⁺ CD9 ⁺）代表含有FIPs的非成脂级分（图2A， 步骤3）。
   8. 将标记和未标记的馏分以600 ×g 离心5分钟，以在4°C下沉淀细胞。
8. 立即进行细胞培养（第 6 步）或使用未分化的前体进行首选分析（第 4 步和/或第 5 步）。

4. 通过流式细胞术评估成脂和非成脂部分的纯度

1. 将珠子分离的细胞级分重悬于 200-400 μL 含有 Fc 块 （1:200） 的 2% FBS/PBS 中。
2. 在4°C孵育10分钟。
3. 将细胞悬液转移到 1.5 mL 试管中并添加抗体。抗体浓度列在 材料表中。
   1. 为 1） 未染色细胞、2） 单色对照和 3） FMO 对照准备单独的对照管。
   2. 向样品中加入 CD45、CD31、CD9 和 LY6C 抗体。
4. 在4°C下避光孵育15分钟。
5. 在4°C下以600 ×g 离心5分钟。
6. 吸出上清液并将细胞重悬于 400 μL 2% FBS/PBS 中。
7. 将悬浮液在4°C下以600 ×g 离心5分钟。
8. 吸出上清液并将细胞重悬于 400-800 μL 2% FBS/PBS 中。通过 40 μm 滤帽过滤到 5 mL 聚苯乙烯圆底管中，通过流式细胞术进行分析。
9. 流式细胞术分析以评估纯度
   1. 使用无染色和单色对照进行补偿。
   2. 使用 FMO 控件设置实验门。
   3. 对活细胞和单细胞使用门控策略， 如图2B所示。
   4. 如图 2B 所示对 CD45、CD31、LY6C 和 CD9 执行门控。
   5. 使用流式细胞术软件评估分离组分中 CD45-CD31-LY6C-CD9^- 细胞 （APC） 和 CD45-CD31-LY6C⁺ 细胞 （FIP） 的频率。

5. 使用定量 PCR 进行基因表达分析，以评估 FIP 和 APC 的纯度

1. 按照制造商的说明，使用市售的提取试剂盒（参见 材料表）从磁性或 FACS 分离的细胞中提取 mRNA。
2. 按照制造商的说明，使用 1 μg RNA 使用 cDNA 逆转录酶试剂盒（参见 材料表）合成 cDNA。
3. 使用SYBR绿色PCR预混液通过定量PCR确定APC和FIPs选择性基因的相对mRNA水平（表1）。
   1. 设置用于PCR的样品反应如下:5μL的2x SYBR绿色染料，1μL的cDNA（~50ng/μL），0.5μL的每种正向和反向引物（10μM）和3μL的水。
   2. 使用以下标准PCR条件进行定量PCR运行:保持阶段:50°C2分钟，95°C10分钟;PCR阶段（40个周期）:95°C15秒，60°C1分钟。
4. 通过计算 ΔΔ-Ct 将值归一化为管家基因 （Rps18） 水平。
5. 要评估统计显著性，请执行未配对的学生 t 检验。

6. 细胞培养和分化

1. 在4°C下以600 ×g 离心磁性或FACS-分离的细胞5分钟。
2. 将沉淀重悬于 500 μL 性腺 APC 培养基中，并在 48 孔培养板中将每个级分的 40K 个细胞/孔铺板。
3. 每 1-2 天更换一次培养基。当 APC 接近汇合时，它们将开始分化为脂肪细胞。在相同培养基中维持的 FIP 对脂肪生成具有抵抗力。

该协议描述了两种策略，允许从成年小鼠的腹内WAT仓库中分离不同的基质细胞群。APC和FIP可以通过FACS（图1）或使用生物素化抗体（图2）分离免疫磁珠来分离。这两种方法都利用了市售的试剂和抗体。免疫磁珠分离可从 gWAT SVF 中分离出成脂细胞和非成脂细胞。流式细胞术分析显示，成脂部分内75%的细胞代表LY6C-CD9-APCs。>75% 的非成脂部分代表 FIP（LY6C+ 细胞）。

图 1:通过 FACS 从性腺 WAT 中分离 PDGFR β + 基质细胞亚群。 （A） 程序示意图概述:通过酶促组织消化和离心从成熟脂肪细胞中分离基质血管部分（非脂肪细胞）。然后使用荧光激活细胞分选 （FACS） 去除内皮 （CD31+） 和造血 （CD45+） 谱系细胞，并分离 LY6C+ PDGFRβ+ 细胞 （FIPs） 和 LY6C-CD9- PDGFRβ+ 细胞 （APCs）。（B） 具有代表性的FACS收集闸口。面板A经许可转载自参考文献11。请点击这里查看此图的较大版本.

图 2:通过免疫磁珠分离分离成脂和非成脂基质细胞。 （A） 程序示意图概述:第 1 步:CD31+ 和 CD45+ 细胞与磁铁结合。这既去除了内皮细胞又造血谱系细胞。收集含有CD31-和CD45-细胞的洗脱液，然后分别与识别LY6C和CD9的抗体一起孵育。第 2 步:CD9+ 和 LY6C+ 细胞与磁铁结合。步骤3:收集含有CD9-和LY6C-细胞的上清液（未结合部分），因为这代表脂肪生成部分（APCs）。与纳米球结合的非成脂 CD9+ 和 LY6C+ 细胞被洗脱为含有 FIP 的非 APC 部分。（B） 流式细胞术分析，分别评估成脂和非成脂部分中 APC （LY6C-CD9-） 和 FIP （LY6C+） 的频率。请点击这里查看此图的较大版本.

光学显微镜和基因表达分析表明，通过FACs或通过磁珠从gWAT中分离的APCs在6-8周龄小鼠的gWAT中首次接种细胞后7-10天内高度分化为含脂质的脂肪细胞在性腺APC培养基中（图3）。相比之下，非成脂肪前体（如纤维炎症前体或FIP）保持成纤维细胞样，当维持在同一培养基（性腺APC培养基）中时，不会 变成脂肪细胞（图3）。应该注意的是，非APCs培养物中很少有细胞显示出一些脂质积累（图3D）。这些可能是由细胞分离过程中的 APC 污染引起的。额外的洗涤可能会提高该馏分的纯度。

图 3:从成年小鼠的 gWAT 中分离的 PDGFR β + 基质细胞群的体外分化。 （A-D）通过免疫磁珠分离 （AB） 或 FACS （C-D） 从 6-8 周龄小鼠 gWAT SVF 中分离的分化基质细胞亚群的代表性明场图像。图像是在将细胞接种到性腺 APC 培养基中 7 天后拍摄的。在电镀后 7-10 天内，APC 发生自发脂肪细胞分化。放大倍率 10 倍。规模 = 250 μM。 （EF） A-D 中分化培养物中脂肪细胞选择性基因的 mRNA 水平。条形图代表平均值 + SEM。 请点击这里查看此图的较大版本.

表 1:用于验证 FIP 和 APC 分离的 qPCR 引物序列

T.A.P. 是 Novo Nordisk A/S 的员工和股东