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方法文章

大鼠腓肠肌内侧头单个运动单元的功能性分离

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DOI：

10.3791/61614

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2020年12月26日

 , 
1Department of Neurobiology, Poznań University of Physical Education, 2Department of Biochemistry, Poznań University of Physical Education

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

该方法可用于记录大鼠腓肠肌内三种运动单位的单收缩和强直收缩力以及动作电位。通过电刺激轴突可实现单个运动单位的功能性分离。

摘要

本研究概述了运动单位（MUs）的功能性分离方法，这是一种标准的电生理学技术，用于测定实验大鼠后肢肌肉（如内侧腓肠肌、比目鱼肌或跖肌）中运动单位的特性。该方法的关键步骤是对从腹根分离出的运动轴突施加电刺激。刺激可采用恒定或可变的脉冲间隔进行。该方法适用于不同发育阶段（幼年、成年或老年）动物的实验。此外，本方案可用于研究多种干预手段所诱发的运动单位变异性与可塑性的相关实验。这些实验的结果不仅可增进对肌肉生理学的基础认知，还可转化为实际应用。本操作流程重点介绍记录和刺激运动单位所需的手术准备工作，强调实现制备稳定性与结果可重复性的关键步骤。

引言

运动单位（MUs）是骨骼肌的最小功能单位。因此，了解其功能、可塑性及收缩特性，以及其力量调控机制，对于肌肉生理学的发展至关重要。许多肌肉（主要是实验动物的后肢肌肉）的运动单位基本收缩特性及其生理类型的比例已有详细记录。然而，运动单位特性的可塑性及其力量调控机制仍未被完全阐明。

该方法的原理是，除目标研究的肌肉外，广泛去除后肢肌肉的神经支配，并在腰椎处进行椎板切除，以制备细小的腹根分支，每个分支包含一条单一的"功能性"运动轴突，通过电刺激记录运动单位（MU）的收缩力和动作电位。采用本文所述技术，在一次成功的实验中可分离出内侧腓肠肌超过一半的运动单位。大鼠内侧腓肠肌平均包含52个运动单位（雌性）或57个运动单位（雄性），分为三种生理类型：S型（慢速）、FR型（快速抗疲劳）和FF型（快速易疲劳）1,2，其收缩特性具有多样性3。在比较对照组与实验组运动单位平均值的实验中，每组需分离并记录10–30个运动单位。关键的是，单个运动单位可被持续刺激超过一小时。此外，由于该技术可同时记录运动单位的收缩力和动作电位，因此适用于研究与力量产生相关的现象、评估疲劳效应，以及观察收缩力与动作电位之间的关系。

既往研究已证实，运动单位（MU）的收缩特性具有可塑性，并可受多种干预措施的调节。采用本文所述技术进行的实验已在大鼠腓肠肌内侧头4或其他大鼠后肢肌肉5,6，以及猫的肌肉7上开展，均使用了类似的单个运动单位分离方法。另一系列实验通过在可变脉冲间隔下施加刺激串，获得了有关运动控制过程的观察结果，总体结果提示刺激的历史具有重要意义，其中即使单个刺激在时间尺度上的微小偏移，也对力量产生具有关键影响8,9。

运动单位（MUs）也可通过其他方法进行研究。第一种方法是对运动神经元进行直接刺激。Burke 使用玻璃微电极对猫的内侧腓肠肌和比目鱼肌中的运动神经元进行细胞内刺激，同时采用平行记录方法，以确定这些神经元的电生理特性1,10。此外，已有其他方法被提出用于研究人体肌肉中的运动单位，这些方法所需的干预程度显著较低。所有这些方法均需将刺激和记录电极插入肌肉或神经中，并从手指或足部记录产生的力。第一种方法曾用于研究第一背侧骨间肌中的运动单位。对于该肌肉，在以低强度收缩时，通过插入肌肉内的针电极记录到的肌电图中，仅能识别出一个活跃运动单位的动作电位。随后，将与每个动作电位相对应的肌肉力信号片段进行平均（即触发式平均法）。该方法可从肌肉整体的力记录中提取出单个运动单位的力输出11。然而，该方法的局限性在于，所平均的并非单次收缩力，而是强直收缩过程中的片段。人体运动单位也可通过第二种方法——即向肌肉内插入电极进行肌内电微刺激——加以研究12，该方法刺激轴突树的一个局部区域，从而激活单个运动单位。第三种方法是将电极插入神经内进行微刺激。当电极仅激活神经中的一条运动轴突时，仅有单个运动单位发生收缩13。后两种方法存在一些局限性，包括记录的稳定性与质量、伦理限制以及实验材料的可获取性。该类实验方案在20世纪70至80年代曾广泛应用于猫的实验研究中14。

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方案

所有操作均需获得当地伦理委员会的批准，并遵守欧盟关于动物护理的指南以及国家有关动物保护的法律。

注意：参与本实验操作的每位研究人员都必须接受过基本外科手术操作培训，并须获得进行动物实验的有效许可证。

1. 麻醉

  1. 通过腹腔注射戊巴比妥钠（初始剂量为 60 mg·kg-1）对大鼠进行麻醉。
  2. 约 5 分钟后，用钝头镊子夹捏大鼠的耳朵或前肢，检查麻醉深度。只有在未观察到反射反应时，方可进行后续操作步骤。
  3. 手术过程中，每 10–15 分钟检查一次动物是否有反射反应；若动物对夹捏产生运动反应，则需补充麻醉（通常为腹腔注射戊巴比妥钠 10 mg·kg-1·h-1）。

2. 手术

  1. 为手术操作做准备，剃除左侧后肢从足跟到髋部的毛发（第一部分：肌肉和神经分离）、右侧后肢从足跟到髋部的毛发（第二部分：接地电极）以及背部从尾部到胸段的毛发（第三部分：椎板切除术）。由于实验为急性实验，无需进行消毒。
    1. 将大鼠俯卧位放置于加热垫上（37 °C ± 1 °C）。
  2. 椎板切除术
    1. 使用尖头-钝头剪刀，沿脊柱方向从骶骨向上剪开至胸椎区域的皮肤。
    2. 将皮肤与下方肌肉组织分离。
    3. 使用钝头剪刀，在骶骨和腰椎棘突两侧切除最长肌。
    4. 确定S1椎体为最低节段。使用尖头-钝头剪刀，切除L6至L2椎体的棘突。接着，使用精细咬骨钳，去除L6-L2的横突，并在L6–L2节段进行椎板切除术（先去除横突，再去除椎板，从L6椎体节段开始），以暴露由硬脑膜覆盖的腰段脊髓。注意避免切割骶骨和L1棘突，因其将作为动物固定时的锚定点。
    5. 使用尖头剪刀，在L2椎体节段水平（即椎板切除术上缘）切断脊髓（其尾侧部分）以及背根和腹根。放置小块干燥明胶海绵以止血。随后，在暴露的脊髓节段上覆盖一层浸有生理盐水的薄棉球。
  3. 内侧腓肠肌及其神经的分离
    1. 使用尖头-钝头剪刀，在左侧后肢后侧从跟腱至髋部做一纵向切口。
    2. 用镊子夹住皮肤，沿切口两侧将皮肤与下方肌肉组织分离。
    3. 定位膝关节后方的腘窝，该区域被股二头肌覆盖。使用剪刀，在该肌肉的前部与后部之间做一切口。
    4. 向上分离，将股二头肌的两个头完全剪开至髋部，以暴露坐骨神经。
    5. 使用钝头镊子和剪刀，分离腓肠肌的外侧头与内侧头，并切断内侧腓肠肌的远端止点（跟腱）。尽可能保留较长的跟腱残段，以便连接至力传感器。
    6. 识别内侧腓肠肌（MG）神经。使用镊子和剪刀，切断坐骨神经的所有残留侧支，包括至股二头肌后部和半腱肌的分支。保留供应内侧腓肠肌的血管不受损伤。
    7. 将一根非弹性结扎线穿过跟腱，并打三个结。
    8. 在暴露的神经和肌肉下方放置一块浸有生理盐水的棉球。
    9. 使用有齿镊子，将手术区域的皮肤闭合覆盖。
    10. 使用尖头-钝头剪刀，在左侧后肢前侧的皮肤及皮下结缔组织上做一条长约2 cm的切口，用于通过金属夹具进行固定（3.1.6.）。

3. 记录与刺激的准备工作

  1. 脊柱和后肢固定及肌肉布置
    1. 使用钢夹将左侧后肢固定，将夹子夹在胫骨上。
    2. 将大鼠置于定制的可调节框架（由隔离铜线制成，直径1 mm）中，用四根缝合线提起椎板切除术周围的皮瓣，并将皮肤缝合固定于框架上，以在暴露的脊髓上方形成一个石蜡油池（大小约为50 mm × 50 mm）。
    3. 使用Dumont #55镊子在脊髓交界处轻轻提起硬脊膜，沿尾侧方向剪开至骶骨，并将其牵开。
    4. 使用钝头玻璃棒逐级分离左侧和右侧的背根与腹根，注意避免损伤神经根。
    5. 用温热（37 °C）的石蜡油填充脊髓上方的油池，覆盖暴露的腹根和背根。
    6. 将大鼠放置于定制的铝板（长260 mm，宽120 mm，高80 mm）上，铝板设有用于后肢的腔室（长135 mm，宽100 mm，深45 mm），并与闭环加热系统相连。该铝板用于固定动物并进行实验操作。
    7. 使用金属杆将夹在左侧后肢上的夹子进一步固定，以完全限制后肢活动。
    8. 在骶骨和L1椎体处使用钢夹固定脊柱，以稳定动物身体，消除因呼吸运动引起的力记录伪迹。
    9. 通过跟腱将左侧内侧腓肠肌用非弹性结扎线连接至力传感器（柔顺性为50 μm/250 mN，测量范围为0–1000 mN）。
    10. 用温热（37 °C）的石蜡油填充后肢腔室，使油面覆盖内侧腓肠肌，并通过温度探头和自动控制系统将油温维持在37 °C ± 1 °C。
  2. 动作电位记录与刺激电极的放置
    1. 将一根双极银丝电极垂直于内侧腓肠肌长轴方向插入肌肉中段，两个电极沿肌肉长轴方向相距约5 mm。这些电极用于记录运动单位动作电位（MUAPs）。将电极连接至低噪声放大器。
    2. 通过力传感器控制，将手术侧肌肉拉伸至100 mN的被动张力。在此拉伸状态下，大鼠内侧腓肠肌的三类运动单位可产生最大的抽搐力15。
    3. 使用尖-钝剪刀在右侧后肢皮肤上做一长约2 cm的切口，并插入一根银丝电极作为参考电极。
    4. 将一块定制的绝缘金属板（尺寸为30 mm × 13 mm）放置并固定于暴露的脊神经根上方，将左侧的腹根和背根（L4、L5和L6）置于该金属板上。
    5. 向由皮肤围绕椎板切除区域形成的油池中加入生理盐水，液面应低于绝缘金属板。
    6. 将一根银丝刺激电极（两根银丝，直径0.5 mm，长度50 mm）放置于暴露的脊神经根上方，正极置于油中、位于金属板上方3 mm处，负极置于生理盐水中（加入油池内，位于金属板下方），并将电极连接至刺激器。

4. 运动单位记录

  1. 使用电刺激矩形脉冲（持续时间 0.1 ms，幅度最高达 0.5 V），选择腹根（L4、L5 和 L6）；刺激腹根可引起肌肉收缩，而背根则无此效应。从培养皿中去除背根。对于内侧腓肠肌，大多数轴突位于 L5 腹根中。
  2. 使用一对 Dumont #55 镊子和放大镜，将 L5 或 L4 腹根分离成非常细的轴突束（用两把镊子夹住腹根分支的切断端，将其剥离分开）；将其中一束放置在银丝电极上并进行刺激（0.1 ms 矩形脉冲，幅度最高达 0.5 V），以获得单个运动单位（MU）的活动。使用金属棒作为稳固支撑，对操作细小的轴突束非常有帮助，可作为使用镊子时的手部支撑。还需注意，额外的光源是必要的。
  3. 通过逐步增加刺激强度，根据诱发的“全或无”性质的抽搐收缩和动作电位来识别单个运动单位。在接近阈值的刺激强度下仔细检测诱发的活动。
    1. 当被研究的肌肉中有多个运动单位同时收缩，并且可观察到力的逐步增强，以及动作电位的幅度增加或波形改变时，返回步骤 4.2，再次分离轴突束。需注意，大鼠内侧腓肠肌中最强的运动单位的抽搐力约为最弱者的 70 倍，当强运动单位收缩时，较弱的运动单位可能不易察觉。还需注意，某些运动单位的肌纤维位于记录电极区域之外，在肌电图中不可见；在这种情况下，刺激强度的变化可能影响肌肉力，但不会影响动作电位。
  4. 根据实验目的，采用必要的刺激方案刺激运动单位。为计算所有基本的运动单位收缩特性和动作电位特性，应包括以下基本刺激方案。
    1. 包括 5 次 1 Hz 的刺激（记录并平均 5 次单次抽搐；平均处理可消除噪声，对最弱的运动单位尤为重要）。
    2. 包括一系列频率为 10、20、30、40、50、60、75、100 和 150 Hz 的刺激，持续时间为 500 ms（这些记录可用于计算力-频率关系、150 Hz 时的最大强直收缩力，以及 20–40 Hz 刺激时的衰减现象）。
    3. 包括疲劳测试（以每秒重复一次、每次 14 次刺激、频率为 40 Hz 的刺激串诱发强直收缩，持续 4 分钟）。
    4. 上述各刺激程序之间至少间隔 10 秒。
    5. 对后续分离的各个运动单位重复该过程。
  5. 实验结束后，通过腹腔注射致死剂量的戊巴比妥钠（180 mg·kg-1）处死动物。

5. 电子设备

注意：该定制计算机程序控制刺激器，可生成包括步骤 4.4 中所述在内的多种刺激模式。该程序与模数转换器协同工作（MUAP 和力量记录的采样率至少为 10 kHz）。

  1. 通过模数转换器将交流放大器连接到计算机，同时并联至示波器。
  2. 通过模数转换器将力传感器连接到计算机，同时并联至示波器。使用力传感器在实验过程中控制肌肉的被动张力。注意实验过程中被动张力可能会下降；因此，有必要增加肌肉长度以维持被动肌肉张力恒定。

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结果

在确保记录条件稳定的前提下，可基于记录结果计算运动单元收缩和动作电位的参数。图1展示了一个快速运动单元单次抽搐的代表性记录。上部曲线显示了运动单元的动作电位。刺激施加与运动单元动作电位起始之间的延迟是由于冲动从腹根传导至肌肉所需的时间所致。图2展示了一个快速运动单元未完全强直收缩力的代表性记录以及一串运动单元动作电位。

运动单位动作电位与抽搐力图；刺激反应分析；电生理学数据。
图1：快速运动单位单次抽搐的代表性记录。在力信号轨迹上方显示的是运动单位动作电位。

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讨论

如果由经验丰富的科研人员正确操作，本方案所述的手术部分应在大约两小时内完成。手术过程中应特别注意维持动物生理状态的稳定，尤其是体温和麻醉深度，应通过评估耳廓和缩足反射来系统监控。手术完成后，应能够维持至少六小时的稳定记录状态。

关键的实验步骤始于将腹根分离成非常细的纤维，从而分离出通往目标肌肉的单根运动轴突。实际上，腹根的细纤维包含支配后肢不同肌肉的轴突群；然而，由于除目标肌肉外的所有其他肌肉均已去神经支配，当刺激的轴突束中仅包含一根通往目标内侧腓肠肌的轴突时，便只能在该目标肌肉中诱发单个运动单位（MU）的收缩。在成功确认所诱发的活动为单个运动单位收缩后，即可记录一系列张力数据（单次抽搐、不完全强直收缩、疲劳测试），这些数据对于将运动单位归类为三种生理类型之一至关重要。该技术的优势在于，一次实验中最多可记录30个运动单位；此外，可根据是否存在“下垂”（sag）现象立即准确地将运动单位区分为快型或慢型1,3。进一步地，基于不完全强直收缩张力记录的波形特征，可极为精确地...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了波兰国家研究中心资助项目 2018/31/B/NZ7/01028 的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
力传感器定制
镊子Fine Science ToolsNo. 11255-20Dumont #55，带超轻精细柄
镊子Fine Science ToolsNo. 11150-10超细 Greafe 镊子
镊子Fine Science ToolsNo. 11026-15特殊杯状设计，夹持性能优异
镊子Fine Science ToolsNo. 11023-10细长型，1×2 齿
镊子Fine Science ToolsNo. 11251-20Dumont #5
止血钳Fine Science ToolsNo. 13003-10Hartman 型
隔离装置Grass InstrumentsS1U5A
低噪声生物放大器World Precision Instruments订货号 74030
持针器Fine Science ToolsNo. 12503-15带碳化钨钳口
咬骨钳Fine Science ToolsNo. 16021-14Friedman-Pearson 型
剪刀Fine Science ToolsNo. 14101-14直型，锐/钝头，大指环
剪刀Fine Science ToolsNo. 14075-11弯型，钝/钝头
剪刀Fine Science ToolsNo. 14084-08超细 bonn 型
剪刀Fine Science ToolsNo. 15000-00直型，适用于神经切断
刺激器Grass InstrumentsS88双输出方波脉冲刺激器

参考文献

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