利用基于CRISPR/Cas9的技术在CD40激动型抗体诱导的结肠炎模型中研究靶基因功能

摘要

本文介绍了利用成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关核酸酶（Cas9）技术在免疫系统中敲除目标基因的方法，并在分化簇40（CD40）激动性抗体诱导的结肠炎模型中对这些小鼠进行评估。

摘要

免疫系统的作用是保护人类免受细菌和病毒等外来入侵者的侵害。然而，免疫系统的失调可能导致自身免疫、炎症性疾病和癌症。炎症性肠病（IBD）——包括克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC）——是一类以反复发作的肠道炎症为特征的慢性疾病。尽管IBD在西方国家最为常见（每1,000人中约有1例），但其发病率在全球范围内呈上升趋势。通过关联性研究，研究人员已将数百个基因与IBD的病理过程联系起来。然而，IBD复杂的病理机制以及大量潜在致病基因的存在，为寻找最佳治疗靶点带来了重大挑战。此外，对每个基因关联进行功能表征所需的技术工具引入了许多限制性因素，例如为每个基因构建基因修饰小鼠。为了研究靶基因的治疗潜力，研究人员开发了一种模型系统，该系统基于成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关核酸酶（Cas9）技术，并结合分化簇40（CD40）激动型抗体。本研究表明，利用CRISPR/Cas9介导的免疫系统编辑可在体内研究基因的功能影响。该方法局限于造血系统，能够可靠地编辑重建后的免疫系统。与传统基因修饰小鼠相比，CRISPR/Cas9编辑小鼠的制备速度更快，成本显著降低。此外，相较于构建和繁育基因修饰小鼠，CRISPR/Cas9小鼠编辑具有显著的科学优势，例如能够评估在胚胎期致死的靶基因。本研究以CD40激动型抗体诱导的结肠炎模型中的CD40为示范靶点，验证了该方法的可行性。

引言

自身免疫性疾病是指患者的免疫系统攻击自身细胞和器官，导致慢性炎症和组织损伤的一类疾病。迄今为止，已有近100种不同类型的自身免疫性疾病被报道，影响着全球约3%-5%的人口¹。许多自身免疫性疾病（包括系统性红斑狼疮和炎症性肠病）缺乏有效的治疗方法，存在重大的未满足的医疗需求。仅在美国，目前就有约150万人受到炎症性肠病（IBD）的影响。该病是一种破坏性疾病，其特征是进行性、持续性和复发性的肠道炎症，目前尚无治愈手段。为了向IBD患者提供所需的新型治疗和预防策略，亟需深入解析其潜在的发病机制和病理生理过程^2,3。

通过全基因组关联分析（GWAS），已鉴定出超过230个不同的炎症性肠病（IBD）相关位点⁴。尽管这些关联研究揭示了一些可能在IBD关键机制和通路中发挥重要作用的新基因，但来自这些位点的基因中仅有少数被深入研究。部分基因已被证实参与特定的生物学通路。例如，微生物感知通路与核苷酸结合寡聚化结构域含蛋白2（NOD2）相关；自噬通路与自噬相关16样蛋白1（ATG16L1）、免疫相关GTP酶家族M成员（IRGM）以及胱天蛋白酶募集结构域家族成员9（CARD9）相关；而促炎通路则与白细胞介素（IL）-23驱动的T细胞反应相关⁴。已有多种体内小鼠模型被用于对GWAS鉴定出的基因进行功能表征^5,6。

用于研究炎症性肠病（IBD）发病机制的关键模型之一是结肠炎的CD40模型^7,8，该模型通过向免疫缺陷（T细胞和B细胞）小鼠体内注射CD40激动型抗体，诱导产生固有免疫介导的肠道炎症。该模型主要用于探究固有免疫（尤其是巨噬细胞和树突状细胞）在IBD发生发展中的作用⁹，但尚不清楚该疾病是否可在免疫功能完全正常的野生型（WT）小鼠中被诱导。除了动物模型外，对基因进行功能表征还需要基因特异性的研究工具，包括化学化合物和生物制剂。更重要的是，基因修饰动物对于揭示特定基因的功能至关重要。然而，通常用于制备基因修饰小鼠的策略——胚胎显微注射和繁育——往往耗时超过一年，并产生显著的经济成本。这一限速过程为阐明全基因组关联研究（GWAS）所鉴定出的IBD相关基因功能带来了重大挑战。

本文所述方案为培育基因编辑小鼠提供了一种可行的替代方法。首先，如图1示意图所示，从携带特定等位基因（CD45.2）的Cas9基因敲入（KI）小鼠骨髓中分离出谱系阴性、干细胞抗原1阳性、受体酪氨酸激酶Kit阳性（lineage-Sca1+c-Kit+ 或 LSK）的细胞，以便追踪供体免疫细胞。接着，将这些细胞暴露于携带不同向导RNA（gRNA）和荧光标记——紫光激发的绿色荧光蛋白（VexGFP）的慢病毒中，以实现对转导细胞的追踪。两天后，分选VexGFP+细胞，并将其注射到经致死剂量照射的Ly5.1 Pep Boy受体小鼠体内，这些小鼠为携带CD45.1等位基因的C57Bl/6小鼠，可用于追踪受体来源的免疫细胞。12周后，小鼠免疫系统完全重建，即可将其用于体内模型研究。

与转基因动物的制备和繁育相比，该方法不仅具有成本更低、生成时间更短的优势，而且特别适用于那些在胚胎期致死的靶基因研究，因为它能够特异性地靶向造血系统。此外，对于目前缺乏可用工具（例如特异性抗体）的靶点，该系统也提供了一种可行的研究途径。综上所述，为应对上述挑战，已开发出一种基于体内CRISPR/Cas9的基因组编辑平台，可快速构建基因修饰动物模型^{10,11,12,13,14}。本研究证明，可通过CD40激动型抗体在野生型C57Bl/6小鼠中诱导肠道炎症。CD40是该模型中疾病进展的关键调控因子，因此被选为模型靶点，用于验证基于CRISPR/Cas9的基因敲除及其功能缺失效应。

方案

根据本方案进行的所有动物实验必须获得相应机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。本文所述所有操作程序均已获得艾伯维公司IACUC的批准。

1. 所需慢病毒的制备及供体与受体动物的获取

注意：材料表 包含本实验方案中使用的所有动物、仪器和试剂的来源及订货编号信息。

1. 使用经修饰为 VexGFP 或 mCherry 的 lentiGuide-puro 载体构建质粒。
   1. 将随机非靶向 gRNA（SgNone）或靶向 CD40 的 gRNA 克隆至修饰后的载体中。
      ​注意：本研究中各 gRNA 的序列如下：SgNone，CTATGATTGCAACTGTGCAG；SgCD40.1，AGCGAATCTCCCTGTTCCAC；SgCD40.2，GACAAACAGTACCTCCACGA；SgCD40.3，ACGTAACACACTGCCCTAGA。
   2. 按照先前描述的方法¹⁵制备慢病毒颗粒。
      1. 将编码 gRNA 的质粒与 VSV-G 和 pLEX 包装质粒共同转染至 293T 细胞中。
      2. 转染后 18 小时更换培养基，并在换液后 24–48 小时收集含有病毒的上清液。
      3. 为评估 CD40 gRNA 的效率，通过转染编码 CD40 的 pcDNA3.1 质粒，构建稳定的 CD40 表达 293T 细胞系。
   3. 使用所述慢病毒转导细胞，并在两周后通过荧光激活细胞分选（FACS）进行评估。
      注意：Cas9 基因敲入（KI）小鼠用作供体小鼠。当使用表达 CD45.1 等位基因的 C57Bl/6-Ly5.1 Pep Boy 小鼠作为受体时，应确保 Cas9 KI 小鼠具有 C57Bl/6 背景并表达 CD45.2 等位基因，以避免移植物抗宿主病（GvHD），并便于追踪供体与受体细胞。
2. 设计实验。对于基因敲除（KO），每个基因使用 3–6 条 gRNA。针对每条 gRNA，额外准备 20% 的受体小鼠，以弥补移植过程中及移植后可能发生的动物损耗。
   ​注意：CD40 激动型抗体诱导的结肠炎模型每组至少需要 8 只小鼠以满足统计学效能要求。因此，本研究中每条 gRNA 准备了 10 只小鼠。其他体内模型所需小鼠数量将根据所用模型的不同而有所变化。
3. 使用性别相同、年龄为 8–12 周的供体和受体小鼠。
   注意：小鼠在 IACUC 批准的指南下实施安乐死，使用不低于 5% 的异氟烷 进行麻醉，并以颈椎脱位作为二次确认方法。

2. 骨髓采集及细胞分选前处理

1. 使用镊子和剪刀从每只供体小鼠（股骨、胫骨、肱骨和尺骨）中取出骨骼，尽可能仔细地去除肌肉/组织。
2. 用23 G针头在0.6 mL微量离心管底部穿孔，并将该管放入1.5 mL离心管中。每只动物制备两套。
3. 切开骨骼的一端，将4-8根骨骼放入微量离心管中，使开口端朝向23 G针孔。
   注意：每管骨骼数量取决于骨骼类型，例如，8根胫骨、肱骨和尺骨或4根股骨可放入一管。
4. 将装有骨骼的0.6 mL微量离心管置于1.5 mL离心管内，于室温（RT）下以300 × g 离心2分钟。
5. 弃去含有无骨髓骨骼的0.6 mL微量离心管，保留已充满骨髓的1.5 mL离心管。向每个离心管中加入1 mL红细胞裂解缓冲液（含氯化铵），通过移液重悬细胞沉淀。室温孵育1分钟。如有需要，重复裂解步骤。
6. 将细胞悬液转移至50 mL锥形管中，加入不含钙和镁的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）（体积至少为细胞悬液的两倍），以中和裂解缓冲液。在300 × g 条件下离心5分钟，收集细胞。彻底吸除上清液。
7. 在50 mL锥形管上放置70 µm滤膜，将细胞悬液过滤，并用DPBS冲洗管和滤膜。弃去滤膜，计数细胞。
   ​注意：使用30只供体小鼠（12周龄）平均可获得2亿至3亿个细胞（200-300 × 10⁶ 个细胞）。

3. 细胞分选以分离LSK细胞用于转导

1. 将步骤 2.7 中计数的细胞重悬于磁性细胞分选（MACS）缓冲液（DPBS、2 mM 乙二胺四乙酸、0.5% 牛血清白蛋白、10 µg/mL 青霉素-链霉素）中，体积按所需量加入（每 10⁷ 个细胞 90 µL）⁷ 细胞）
2. 每10个CD117+磁珠加入10 µL⁷ 细胞。充分混匀，避光，4 °C 孵育 15 分钟。
3. 将MACS LS柱置于磁场中，并用MACS缓冲液冲洗，以进行准备。
4. 用适量的MACS缓冲液（至少为原体积的两倍）洗涤3.2步骤中的细胞，并在300 × g 10 分钟。
5. 吸弃上清液。重悬沉淀，使最终浓度为10⁸ 500 µL MACS缓冲液中的细胞
6. 将细胞悬液加入LS柱中，用缓冲液洗涤3次 3 mL MACS缓冲液
   注意：一个LS柱最多可容纳10个⁸ 标记的细胞和 2 × 10⁹ 总细胞数
7. 从磁力分选架上取下色谱柱，放入合适的收集管中。加入5 mL MACS缓冲液，并立即通过用力推动柱塞将磁标记细胞从柱中快速冲洗出来。
8. 300 × g 离心收集细胞 g 10 分钟。完全吸除上清液。
9. 将细胞重悬于每 10⁷ 个细胞 100 µL MACS 缓冲液中⁷ 细胞，并加入用于谱系标记（CD3、B220、Ter119、Gr-1、CD11b）和Sca-1的染色抗体。
   注意：使用30只供体小鼠（12周龄）可获得100–180 × 10⁶ 平均细胞数。
10. 充分混匀，避光，4 °C 孵育 20 分钟。
11. 加入 5–10 mL MACS 缓冲液重悬细胞，300 × g 离心 g 10 分钟。完全吸除上清液。
12. 重悬至多10⁸ 500 µL MACS缓冲液中的细胞
13. 使用70 µm细胞滤网过滤细胞，并对谱系-Sca1+细胞群进行FACS分选。
    ​注意：约有1.8-2.6%的人群应为谱系-Sca1+。
14. 将细胞收集于LSK培养基中（每10,000个细胞100 µL）：无血清扩增培养基，含100 ng/mL血小板生成素、小鼠干细胞因子、Fms相关酪氨酸激酶3配体和IL-7，以及100 µg/mL青霉素-链霉素。
15. 300 × 离心收集细胞 g 10 分钟。完全吸除上清液。

4. LSK 转导与培养以生成对照和基因敲除细胞

1. 用LSK培养基重悬细胞。
2. 在96孔平底组织培养（TC）板中，每孔接种10,000个细胞，使用LSK培养基。
3. 在37 °C、5% CO₂和95%湿度条件下，于无菌环境中过夜培养。
4. 用DPBS配制50 µg/mL的retronectin溶液，每孔加入300 µL至未经TC处理的24孔聚苯乙烯板中，4 °C过夜孵育。
5. 次日，弃去retronectin溶液，用300 µL DPBS冲洗包被后的孔板，重复一次。
6. 将50,000个LSK细胞（来自步骤4.2中96孔板的5个孔）溶于500 µL培养基中，转移至步骤4.4中已包被retronectin的24孔聚苯乙烯板的每个孔中。每5个孔额外使用100 µL LSK培养基冲洗并收集96孔板中残留的细胞。确保此步骤后24孔板每孔总体积为600 µL（来自96孔板的5 × 100 µL + 用于冲洗这5个孔的100 µL）。
   注意：转移后，在显微镜下检查已空的24孔板，确认所有细胞均已收集。使用LSK培养基收集未转移的细胞，以尽量减少这一小群细胞的损失。
7. 每孔加入300 µL病毒上清液，以500的转速振荡5分钟。在37 °C、600 × g条件下离心20分钟。每毫升至少使用5 × 10⁶个病毒颗粒。
   注意：本研究中使用的载体由pLentiPuro改造而来，其中嘌呤霉素抗性元件被替换为VexGFP。病毒感染复数为50–100。
8. 孵育1小时，然后每孔加入500 µL预热的LSK培养基。
9. 在37 °C、5% CO₂和95%湿度条件下，于无菌环境中继续培养2天。

5. 动物照射以准备供体干细胞植入

1. 孵育2天后，以475 cGy剂量对受体动物进行两次照射，间隔4小时。第二次照射后，将动物置于高压灭菌的笼具中，并按免疫缺陷动物处理，持续12周。 小鼠接受环境丰富化、水凝胶及笼边监测，以提供必要的支持性护理和干预措施。根据需要，小鼠可在支持性护理和干预措施基础上额外给予抗生素食物或饮水。
   ​注意：不同辐照仪的照射剂量可能有所差异。应对辐照仪进行剂量滴定，以确定最佳剂量。文献报道中，对C57Bl/6小鼠使用700至1300 cGy的剂量范围均显示有效。¹⁷在该范围内选择3-4个剂量，每剂量组使用5只小鼠，评估存活率和移植效果。若移植失败或辐射剂量过高，小鼠在移植后3周内无法存活。移植后4周，采集存活小鼠的血液，通过流式细胞术（FACS）评估移植情况。 我们进行眶后（RO）采血 每只小鼠采集约50–100 µL血液用于评估移植情况。采集过程中小鼠处于麻醉状态（2–3%异氟烷），采集后给予眼用润滑剂及1.0 mL皮下生理盐水作为支持性护理。

6. 细胞制备及向辐照受体动物的注射

1. 从第4.9步的每个孔中吸取细胞，由于细胞已转导不同的gRNA，需保持各组分离，并在300 × g 条件下离心10分钟以收集细胞沉淀。
2. 将细胞重悬于MACS缓冲液中，使用70 µm细胞筛过滤，分选VexGFP+细胞群体。
   注意：约有10–15%的细胞应为VexGFP+。
3. 在300 × g 条件下离心10分钟收集细胞，随后重悬于Hank's平衡盐溶液中：每只小鼠注射200 µL，含5,000个或更多细胞。
   注意：HBSS为非药用级试剂。也可考虑使用药用级无菌生理盐水进行注射。
4. 在最后一次照射后3小时，将细胞通过静脉注射注入小鼠体内。
   注意：十二周后，小鼠将建立完全嵌合的免疫系统，可用于体内模型实验。

7. 野生型小鼠中由 CD40 激动性抗体诱导的结肠炎模型

注意：每天称重并评估动物状况。根据需要提供支持性护理：当体重减轻达到10%或动物出现脱水时，皮下注射1.0 mL 0.9%氯化钠溶液。该模型的阳性对照为在第-1天开始每周两次腹腔注射抗p40，剂量为25 mg/kg。

注意：本研究中的实验分组包括幼稚对照组、载体（阴性）对照组和抗p40（阳性）对照组。这些对照组共同用于控制CD40激动型抗体诱导的结肠炎模型中的正常行为。载体、SgNone和SgRNA组：载体用于控制共同的慢病毒载体，SgNone为非靶向的随机引导RNA对照，SgRNA组为 "治疗" 靶向gRNA表达降低的组别

1. 第0天：除空白对照组外，所有动物均在DPBS中通过腹腔注射给予CD40激动型抗体，剂量为10 mg/kg。
2. 第3天和第6天：进行视频内窥镜检查以评估疾病进展，方法如前所述¹⁶。
   1. 使用2-3%异氟烷对小鼠进行麻醉。 在恢复期间通过麻醉机内置温控系统和/或外部加热垫提供保温支持。
   2. 小鼠进入麻醉状态后，给予无钙镁DPBS灌肠，以准备结肠内窥镜检查。
      ​注意：进行灌肠约需1-2 mL液体。
   3. 灌肠后，在麻醉状态下将小鼠转移至麻醉机的鼻罩。
   4. 轻柔地将内窥镜插入结肠，缓慢推进至近端结肠，同时保持摄像头居中，并使用配套的空气泵或连接导管/注射器手动注入空气以维持结肠膨胀，然后缓慢撤出内窥镜 ，并在距离肛门3 cm、2 cm和1 cm处采集视频和图像。
      注意：为减少对结肠的刺激，可在内窥镜前端涂抹无菌润滑剂。
   5. 根据表1所述的血管模式和黏膜增厚情况，对每张图像单独评分。将每只小鼠的3张图像得分相加，得出每只动物的总评分。
3. 第7天：通过过量异氟烷或CO₂安乐死所有小鼠，并通过心脏穿刺尽可能采集血液用于血清分离。称量脾脏以评估脾肿大，并采集脾脏用于 流式细胞术分析；同时采集结肠组织用于组织病理学检查。
   注意：小鼠结肠组织经福尔马林固定、石蜡包埋后切片，用于免疫组织化学（IHC）检测，方法参照Wang等人的描述¹⁹。

结果

按照上述步骤，生成了表达靶向CD40的gRNA的小鼠。到第2周时，B细胞、CD11b+巨噬细胞和CD11c+树突状细胞（DCs）均已成功植入（图2）。而T细胞的完全植入则耗时较长，这与既往文献报道一致¹⁸，需在植入后12周才能达到约90%（图2）。免疫器官（如脾脏和淋巴结）中供体来源的细胞群体最为显著；然而，在肝脏、肺和肠道等其他器官中也检测到了供体细胞的存在（图3）。仅在表达靶向CD40的gRNA的小鼠中观察到CD40表达的显著降低（图4）。

与免疫缺陷小鼠类似，在注射CD40激动型抗体后，野生型C57Bl/6J小鼠也表现出体重下降、血管减少以及结肠镜下观察到的黏膜增...

讨论

本文展示的结果介绍了一种基于CRISPR/Cas9的新型基因组编辑平台，可用于研究该CD40激动型抗体诱导的结肠炎模型中的基因功能。通过细胞分选富集了基因修饰的LSK细胞群体，仅用4个月时间即在重建小鼠体内实现了CD40表达水平超过90%的降低。此外，在CD40激动型抗体诱导的结肠炎模型中，免疫系统内CD40表达的降低产生了显著影响，明显减轻了疾病终点指标。基于这些结果，我们建立了一种体内CRISPR/Cas9技术平台，为研究人员提供了一个强大的工具，用于研究基因在免疫系统中的功能。这一技术进步将加速新靶点生物学功能的验证过程，并最终有助于为炎症性肠病（IBD）和自身免疫病患者开发变革性疗法。

本文介绍的基于CRISPR/Cas9的平台可在中国野生型C57Bl/6小鼠中实现高效且有效的基因调控。由于该平台需使用致死性照射和骨髓移植，预计在完全植入前会有部分动物死亡。因此，每组额外增加20%的小鼠数量将有助于弥补这些损失。由于经5-氟尿嘧啶处理后分离得到的LSK细胞c-kit表达降低，建议通过细胞分选来分离LSK细胞。此外，病毒经超速离心浓缩后应使用高滴度病毒。然而，尽管病毒滴度较高...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6孔组织培养板	Corning/Costar	#3506
TransIT-LT1	Mirus Bio	MIR 2300/5/6
MACS缓冲液（autoMACS运行缓冲液）	Miltenyi Biotec	130-091-221
0.45 µm滤器单元	Millipore	#SLHV013SL
0.6 mL微量离心管	Axygen	MCT-060-C-S
1.5 mL Eppendorf管	Axygen	MCT-150-C-S
15 mL锥形管	VWR	21008-918
23 G针头	VWR	#305145
24孔非组织培养板	Falcon	#351147
24孔组织培养板	Falcon	#353047
50 mL锥形管	VWR	21008-951
5 mL注射器	BD Biosciences	#309647
70 µm滤器	Miltenyi	#130-098-462
96孔平底板	Corning	#3599
96孔U型底板	Corning/Costar	#3365
麻醉机	VetEquip - COMPAC5	#901812
抗CD40激动型单克隆抗体	BioXcell	BE-0016
抗p40单克隆抗体	BioXcell	BE-0051
B220 PE抗体	BioLegend	#103208
牛血清白蛋白	Sigma Aldrich	A7906-100G
Cas9基因敲入小鼠	Jackson Labs	#026179	C57Bl/6背景
CD117+磁珠	Miltenyi	#130-091-224
CD11b PE抗体	BioLegend	#101208
CD3 PE抗体	BD Biosciences	#553240
离心机	Beckman Coulter	Allegra 6KR Centrifuge
台式离心机	Eppendorf	Centrifuge 5424
DPBS	ThermoFisher	#14190136
Dulbecco’s改良Eagle培养基	Mediatech	#10-013-CV
乙二胺四乙酸（EDTA）	Invitrogen	AM9260G
内窥镜	Karl Storz	N/A	定制Coloview塔系统
流式细胞仪	BD Biosciences	FACS Aria II
Fms相关酪氨酸激酶3配体（Flt-3L）	PeproTech	#250-31L
Gr-1 PE抗体	BD Biosciences	#553128
Hank's平衡盐溶液（HBSS）	ThermoFisher	#14170120
热灭活胎牛血清	HyClone	#SH30071.03
IL-7	PeproTech	#217-17
培养箱	Binder	#9040-0116
异氟烷	HenrySchein	#6679401710
LS柱	Miltenyi	#130-042-041
Ly5.1 Pepboy小鼠	Jackson Labs	#002014	C57Bl/6背景
小鼠干细胞因子（mSCF）	PeproTech	#250-03
氯化钠（NaCl）	Hospira	#00409488850
OPTI-MEM无血清培养基	Invitrogen	#31985-070
青霉素-链霉素（PenStrep）	ThermoFisher	#15140-122
板式振荡器	ThermoFisher	#88880023
pLentiPuro	Addgene	#52963
Polybrene（10 µg/µL）	Sigma Aldrich	#TR-1003-G
红细胞裂解缓冲液	eBioscience	#00-4333
Retronectin	Takarbio	#T100B
Sca-1 APC抗体	BioLegend	#108112
StemSpan	StemCell Technologies	#09600
Ter119 PE抗体	eBioscience	#12-5921
血小板生成素（TPO）	PeproTech	#315-14
X射线辐照仪	Precision X-Ray	X-Rad 320