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基于组织切片的游离漂浮染色技术

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DOI：

10.3791/61622

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2020年8月25日

 ,  , 
1George & Anne Ryan Institute for Neuroscience, College of Pharmacy, Department of Biomedical and Pharmaceutical Sciences, University of Rhode Island, 2Department of Neuroscience, Biomedicum, Karolinska Institutet

本文内容

摘要

游离漂浮法可使研究人员对固定组织切片进行基于组织学的染色，包括免疫组织化学染色，以观察生物结构、细胞类型以及蛋白质的表达与定位。这是一种高效且可靠的组织化学技术，可用于研究多种组织，如脑、心脏和肝脏。

摘要

免疫组织化学是一种广泛使用的技术，用于可视化特定的组织结构以及蛋白质的表达和定位。在染色过程中处理组织切片时，通常采用两种替代方法：一种是将切片直接贴附在载玻片上进行操作，另一种称为游离漂浮法，即让固定的组织切片悬浮于溶液中进行维持和染色。尽管贴片法和游离漂浮法可能获得相似的结果，但游离漂浮技术有利于抗体更好地渗透，因此在使用较厚切片进行组织三维重建时应作为首选方法，例如当实验重点在于获取脑区树突和轴突投射信息时。此外，由于切片始终保存在溶液中，单个分装样品可轻松容纳30至40张切片，操作更为简便，尤其适用于大规模的生物医学研究。本文将展示如何应用游离漂浮法进行荧光免疫组织化学染色，重点聚焦于脑组织切片。我们还将讨论如何根据研究人员的具体需求对游离漂浮技术进行灵活调整，并将其适用于其他组织以及其他基于组织化学的染色方法，如苏木精-伊红染色（H&E）和焦油紫染色（cresyl violet），前提是组织样本已使用多聚甲醛或福尔马林等试剂进行了适当固定。

引言

免疫染色是一种流行的研究技术，始于130年前，其起源可追溯至1890年贝林（Von Behring）发现血清抗体1. 在20世纪早期th 世纪，染料被连接至抗原，随后又被连接至抗体，用以定量和可视化反应1，1941年，Albert Coons 开发了首个荧光抗体标记物，这一发现彻底改变了光学显微镜技术2,3“免疫染色”一词涵盖了许多基于这一原理发展而来的技术，包括蛋白质印迹（Western blot）、流式细胞术、酶联免疫吸附测定（ELISA）、免疫细胞化学和免疫组织化学3,4Western blot 可从组织或细胞提取物中检测特定蛋白质的存在5蛋白质通过凝胶电泳按大小分离，随后转移至膜上，并使用抗体进行检测。该技术可指示目标蛋白的存在及其表达量，但无法提供蛋白在细胞或组织内定位的信息。另一种方法——免疫细胞化学（ICC），用于标记细胞内的蛋白质，通常针对体外培养的细胞。ICC 可同时显示蛋白质的表达及其在细胞亚结构中的定位。6为了在组织水平上检测并可视化特定蛋白质，可采用免疫组织化学（IHC）技术。

免疫组织化学（IHC）是一种研究人员用于在组织内靶向特定抗原的方法，其原理是利用免疫系统的化学特性7,8。通过制备与酶或荧光染料偶联的特异性一抗和二抗，可在大多数组织中标记并显示目标抗原（详见Mepham和Britten的综述）9。术语“免疫组织化学"本身并未指明用于显示目标抗原的标记方法；因此，该术语常与检测技术结合使用，以明确标记方式：当二抗与过氧化物酶等酶偶联时，称为显色免疫组织化学（CIH）；当二抗与异硫氰酸荧光素（FITC）或四甲基罗丹明（TRITC）等荧光染料偶联时，则称为荧光免疫组织化学（IHC）。IHC的选择性使临床医生和研究人员能够可视化观察健康和疾病状态下蛋白质在组织中的表达与分布情况10。在临床领域，IHC常用于癌症的诊断，并可区分不同类型癌症之间的差异。IHC还被用于确认体内多种微生物感染，例如乙型或丙型肝炎病毒感染11。在生物医学研究中，IHC常用于绘制组织中蛋白质的表达图谱，在识别疾病状态下异常蛋白质方面具有重要意义。例如，神经退行性疾病通常伴随脑内异常蛋白质的积聚，如阿尔茨海默病中的Αβ斑块和神经原纤维缠结。随后常会建立动物模型以模拟这些病理状态，而IHC是研究人员用于定位和定量目标蛋白质的方法之一10,12,13。由此，我们能够更深入地了解这些疾病的病因及其引发的并发症。

进行免疫组织化学（IHC）涉及多个步骤。首先，获取目标组织并进行染色前处理。大多数研究人员通常使用固定后的组织样本，其中通过循环系统灌注固定液的方法最为理想，因其能较好地保存组织形态14,15。组织样本也可采用后固定方式，但可能获得不够理想的结果16。交联型固定剂（如甲醛）通过在组织蛋白之间形成化学键来发挥作用17。固定后的组织随后使用切片机切成极薄的切片，许多研究人员更倾向于使用恒冷箱切片机获取冷冻切片。随后，组织可直接贴附于载玻片上（载玻片贴附法），或悬浮于溶液中（游离漂浮法），例如磷酸盐缓冲盐水（PBS）18。所采用的组织收集方法需根据研究人员的具体需求预先确定，上述两种方法各有优缺点。

载玻片贴附法迄今为止是最常用的方法，其重要优势在于可以制备非常薄的切片（10–14 μm），这对于研究蛋白质-蛋白质相互作用等应用尤为重要。此外，该方法对样本的操作极少，从而降低了组织结构完整性受损的风险19。研究人员通常将该技术用于新鲜冷冻组织（即使用干冰、异戊烷等立即冷冻的组织），这类组织相较于固定组织更为脆弱，因此必须格外注意防止样本解冻。使用载玻片贴附切片的另一个优点是通常不需要大量染色溶液4，因此研究人员可以使用较少量的昂贵抗体或其他试剂完成染色。此外，还可以将来自多个不同实验组的切片置于同一张载玻片上，这在图像采集过程中尤其具有优势。然而，载玻片贴附切片也存在一些缺点，最显著的是组织切片被固定在载玻片上，导致抗体只能从切片的一侧渗透，从而限制了切片厚度以及组织的三维呈现。此外，在洗涤过程中，组织边缘甚至整个切片可能从载玻片上脱落，导致整个实验失败。而且，采用载玻片贴附法进行免疫组化（IHC）通常必须在较短时间内完成，以避免抗原表位降解20,21；未处理的载玻片通常需储存在 -20 或 -80 °C 环境中，常加盖盖玻片并水平放置或存于载玻片盒内，占用较大的储存空间。最后，当研究人员需要处理大量组织切片时，载玻片贴附法也可能非常耗时。

由于使用载玻片贴片法存在上述一些挑战，一种称为游离漂浮法的改良技术已成为一种流行的替代方法。该技术在20世纪60至70年代首次见于文献22,23,24，并在20世纪80年代逐渐普及25,26,27,28,29，现已成为一种成熟的方法，其特点是将收集的组织切片悬浮于溶液中进行染色，而非将其贴附于载玻片上12,30,31。当组织切片厚度小于20 μm时，不推荐使用游离漂浮法；然而，根据我们的经验，当需要对较厚（40–50 μm）的切片进行染色时，该方法是首选。该方法的一个显著优势在于，抗体可以从各个方向穿透游离漂浮的切片，并因洗涤更充分而减少背景染色，最终在成像时获得更强的信号。此外，切片在完成处理后再贴附到载玻片上，从而避免了组织脱落的风险，同时减少了占用恒冷切片机的时间。游离漂浮法还可显著降低劳动强度，尤其适用于大规模的生物医学研究。例如，可将来自同一样本的多个（18–40个）切片置于同一孔中同时染色，从而节省洗涤和抗体孵育步骤所需的时间。而且，由于采用该方法每张载玻片可贴附更多数量（12–16个）的切片，研究人员观察和成像切片通常更为方便快捷。值得注意的是，在将组织切片贴附到载玻片的过程中，切片可反复粘附与分离，直至获得理想的排列方向。研究人员在使用游离漂浮法时也常采用略低浓度的抗体，且由于孵育过程在微量离心管中进行，抗体可轻松回收并用叠氮化钠保存以供重复使用（见步骤5.1）。另一优势在于，切片可直接与抗冻保护液一同储存在小型微量离心管中，并置于-80 °C保存32，从而最大限度地节省存储空间并延长样本的保存期限33。该技术的一个缺点是切片需频繁操作，因而容易受损。然而，通过采用较低的振荡和旋转速度，并对研究人员进行正确转移样本及贴附切片的操作培训，可有效减轻这一问题。

综上所述，免疫组织化学（IHC）是临床和生物医学研究领域中用于可视化和定位蛋白质表达的一种成熟且必不可少的工具。游离漂浮式IHC是一种高效、灵活且经济的方法，尤其适用于大规模组织学研究。本文向科学界提供了一种可靠的游离漂浮式荧光免疫组织化学实验方案，该方案可根据需要调整用于显色IHC以及其他染色方法，如苏木精-伊红染色或焦油紫染色。

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方案

1. 冷冻切片的组织制备

  1. 使用合适的包埋模具（参见材料表），将固定组织包埋于适当的包埋介质中（参见材料表），并在干冰上冷冻以制备组织块。将组织块储存于 -80 °C，待切片时使用。
    注意：固定组织通常通过灌流成年（约 2.5 – 30 月龄）雄性或雌性啮齿类动物（小鼠或大鼠）制备34，操作需符合现行伦理许可要求。灌流使用适当的固定剂（如 10% 甲醛），随后将组织在相同固定剂中于 4 °C 继续固定 12 小时，再用 1x PBS 洗涤组织三次，最后将组织依次置于含 15% 和 30% 蔗糖的 1x PBS 溶液中，浸泡过夜或直至组织沉底35。研究人员可尝试将此通用方案调整适用于不同发育阶段的组织。

2. 冷冻切片

  1. 准备切片时，将样本在冷冻切片机中平衡至少1-2小时后再进行切片，以防止组织碎裂。
  2. 使用冷冻切片机将组织切成20-50 μm的切片，并收集到盛有1× PBS溶液的6孔或12孔插板中（参见材料表）。
    注意：根据切片厚度、需收集的组织量以及所用孔插板的数量，每个孔中的切片数量会有所不同，大约每孔可收集10至40片。例如，若将整个脑组织以40 μm厚度切片，使用12孔插板时，每个孔中将收集约18-24个切片。此外，20 μm的切片较难操作，因此对于大批量染色建议采用40 μm切片（见讨论部分）。

3. 切片的保存

  1. 收集后，用新鲜配制的1×PBS清洗切片，每次5分钟，重复3次。
  2. 将切片转移至含有1–1.5 mL保存液的2 mL微量离心管中（配制250 mL保存液：加入70 g蔗糖、75 mL乙二醇，用0.1 M磷酸缓冲液定容）。
  3. 置于-80 °C保存，直至进行染色。

4. 染色第一天

  1. 从冷冻箱中取出样品，在室温（RT）下平衡 10 - 20 分钟。
  2. 将切片倒入 6 孔板中的小室插件内，以分离保存液与切片。
  3. 将小室插件转移至另一含有约 6 mL 1x TBS 的孔中，在室温下以低速置于摇床上，用 1x TBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
  4. 在切片洗涤的同时，为每个样品配制 7 mL 封闭-通透溶液，该溶液由含 0.3% Triton X-100 和 3% 正常血清（例如正常马血清）的 1x TBS 组成。将切片置于摇床上，以低速在室温下封闭 30 分钟。
    注意：使用血清封闭可防止抗体与组织发生非特异性结合或与非特异性 Fc 受体结合——建议使用与二抗来源物种 相匹配的血清，若无法获得，则可使用任何与一抗宿主动物不同物种的正常血清。去垢剂 Triton X-100 可通过通透组织促进抗体更好地渗透。
  5. 为每个样品配制 1 mL 一抗溶液，其中包含适当稀释的一抗，并溶于含 0.3% Triton X-100 和 1% 正常血清的 1x TBS 中（参见步骤 4.4 的注释）。将切片从小室插件转移至含有该一抗溶液的 2 mL 微离心管中，以结合目标抗原。
    注意：可同时使用多种一抗（需来自不同宿主物种）。
  6. 将装有切片的 2 mL 微离心管置于旋转混合仪上，以低速（例如 7 rpm）旋转，在 4 °C 下孵育过夜 12-16 小时。

5. 染色第二天

  1. 次日，将切片倒入6孔板中的小室插件内，以分离切片与一抗溶液。
    注意：一抗溶液可收集并重复使用；加入0.02%（w/v）叠氮化钠以抑制微生物生长。
  2. 在室温下用1×TBS缓冲液清洗切片3次（前两次每次30秒，最后一次10分钟）。
  3. 为每个样本配制1 mL二抗溶液，其中包含适当稀释的二抗、1×TBS、0.3% Triton X-100和1%正常血清（避免光照）。
    注意：使用偶联二抗进行间接标记可放大信号，从而实现对目标蛋白的比色或荧光检测。
  4. 将切片转移至含有二抗溶液的2 mL微量离心管中，在室温下置于摇床上低速孵育2小时（避免光照）。
  5. 将切片倒入6孔板中的小室插件内，以分离切片与二抗溶液。
  6. 继续避光操作，用1×TBS在室温下清洗2次，每次30秒；随后用1×TBS清洗15分钟，如需染核可加入DAPI（1–0.1 μg/mL）。

6. 封片

  1. 将切片放入一个玻璃制的矩形组织学染色缸中，缸内盛有四分之三体积的1×TBS缓冲液。
  2. 将一张载玻片浸入1×TBS缓冲液中，使用细毛刷轻轻引导切片向载玻片移动。
  3. 轻敲切片使其贴附于载玻片上，确保切片无皱褶或折叠。
  4. 重复上述操作，直至所有切片均被贴附到载玻片上。
    注意：例如，当整个脑组织以40 μm厚度切片，并收集于12孔板中，每孔含有18–24个切片时，通常将这些切片贴附在1–2张载玻片上；但具体每张载玻片上贴附的切片数量也可根据研究者的偏好适当减少。

7. 盖片

  1. 将切片干燥至载玻片上后，室温放置约10-15分钟，或直至切片呈现不透明状（注意避光），然后滴加适量的水溶性封片剂（硬化型或非硬化型）。若使用荧光标记的二抗，建议选用具有抗荧光淬灭作用的封片剂。
    注意：使用硬化型封片剂时，荧光信号质量可能稍低，但切片可保存更长时间。
  2. 用镊子将盖玻片盖在封片剂上，覆盖滤纸后轻轻按压，以去除多余的封片剂。
    注意：若使用非硬化型封片剂，需用透明指甲油涂抹盖玻片边缘，以密封封片。
  3. 使用合适的显微镜观察切片，并将切片存放在暗盒中，于4 °C保存。
    注意：可根据研究需求，选用不同类型的显微镜进行成像，如激光扫描共聚焦显微镜、倒置或正置宽场荧光显微镜，并选择适当的放大倍数（例如10x、20x、40x）。

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结果

使用游离漂浮法进行荧光免疫组织化学染色的整体流程如图1所示。在小鼠脑组织中应用游离漂浮法进行荧光免疫组织化学染色的代表性示例见图2，该图展示了低倍和高倍镜下的染色结果，以说明染色的整体质量。该方法同样适用于检测低表达水平的蛋白，图3展示了来自GFP低表达转基因小鼠脑组织的一个实例。游离漂浮法也可用于其他组织化学染色方案，例如焦油紫（cresyl violet）染色，如图4所示，操作时可按照本方案的步骤1至4.3进行，然后按步骤6所述将切片贴附于载玻片上。此后，可对贴片后的切片采用任何需要载玻片固定的染色方法进行处理。若将本方案用于显色免疫组织化学（chromogenic IHC），请遵循步骤1至5.6（最后洗涤步骤中不添加DAPI），如使用信号放大步骤（例如亲和素-生物素复合物法），则需相应调整。将缓冲液替换为显色剂/底物试剂，孵育5–20分钟，直至组织呈现所需颜色。可通过低倍显微镜定期观察组织以监测...

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讨论

免疫组织化学（IHC）是一种多功能技术，已成为鉴定组织切片中蛋白质表达与定位的关键方法。该检测方法在科学界广泛应用，有助于进一步理解组织在正常功能及疾病状态各阶段的特征。IHC 被应用于多个领域，从癌症等疾病的临床诊断到临床前研究的初步发现10,36。

进行免疫组化（IHC）最常用的技术是载玻片贴片法，即切片后立即将组织切片贴附于载玻片上。该方法的优点在于，研究人员可以操作非常薄的切片，适用于蛋白质共定位研究，并且每张载玻片染色所需的溶液用量较少。抗体通常价格昂贵，因此如果仅需处理少量切片，该方法是一种经济的选择。对于使用新鲜冷冻标本的研究人员而言，这也是首选方法，因为组织操作步骤最少，从而可保护组织的结构完整性。如果仅需收集少量切片并立即染色（如临床病理学中的情况），采用载玻片贴片法同样合适。然而，该方法也存在一些缺点：染色过程中仅能接触到组织的一侧，因此由于抗体渗透性差以及洗涤效果不佳，切片厚度受到限制。另一个缺点是，一旦组织被切片并收集到载玻片上，通常必须尽快...

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披露

无任何利益冲突需要披露

致谢

我们感谢美国国家老龄化研究所（JMR 获 K99/R00 AG055683 项目资助）、乔治与安妮·瑞安神经科学研究所（EP、GC、JMR）、罗德岛大学药学院（EP、GC、JMR）以及瑞典国王古斯塔夫五世与王后维多利亚自由石匠基金会（JMR）提供的支持。我们感谢哈佛医学院遗传学系苏珊·戴梅基教授实验室的博士生丽贝卡·森夫特，她向我们介绍了游离漂浮法。图1中部分图片来自 "可免费使用、分享或修改，甚至用于商业用途。来源：小鼠和微量离心管（Pixabay），小鼠脑组织（Jonas Töle，Wikimedia Commons），冷冻切片机和小鼠脑切片（生命科学数据库中心，Wikimedia Commons），玻璃容器（OpenClipart，FreeSvg.org），显微镜（Theresa Knott，Open Clip Art Library）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
12孔板Corning3513
6孔板Corning3516
透明指甲油用户自选N/A
DAPISigma-AldrichD9542
包埋模具Thermo Scientific1841
乙二醇用户自选N/A
福尔马林溶液Fisher ScientificSF98-4
马血清，热灭活Gibco26050088
显微镜载玻片盒Electron Microscopy Services71370
PBS用户自选N/A
一抗用户自选N/A
矩形盖玻片VWR48393-08124 × 50 mm
矩形染色皿Electron Microscopy Services70312
2号圆形画笔Princeton Select Series3750R品牌不重要
二抗用户自选N/A
包埋用标本基质OCT Tissue-Tek, Sakura4583
染色架 – 载玻片染色系统Electron Microscopy Services71396-B使用深色盖子
蔗糖用户自选N/A
Superfrost Plus 显微载玻片VWR48311-703
TBS用户自选N/A
Triton X-100Sigma-AldrichX100
Vectashield 抗荧光淬灭封片剂Vector LaboratoriesH-1000非硬化型
12孔板用小室插件Corning Netwells3477
6孔板用小室插件Corning Netwells3479
Whatman 滤纸Millapore-SigmaWHA1440042

参考文献

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