本文报道了一种可在自由活动的秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中进行钙成像的系统，该系统能够实现良好控制且非局域化的振动刺激。该系统使研究人员能够以纳米级位移精确控制非局域化振动的特性，并量化秀丽隐杆线虫（C. elegans）对振动刺激响应过程中的钙离子流。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
方法文章
自由活动状态下的钙成像 秀丽隐杆线虫 具有良好控制的非局域振动
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
非局域性机械力（如振动和声波）会影响从发育到稳态维持的多种生物过程。动物通过改变行为来应对这些刺激。要理解此类行为改变背后的机制，需要在目标行为发生期间对神经活动进行量化。本文报道了一种在自由活动的秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中进行钙成像的方法，同时施加特定频率、位移和持续时间的非局域性振动。该方法利用声学换能器产生精确可控的非局域性振动，并可在单细胞分辨率下量化诱发的钙信号反应。作为原理验证，本文展示了秀丽隐杆线虫（C. elegans）在对振动产生逃避反应期间，单个中间神经元 AVA 的钙反应。该系统将有助于深入理解动物对机械刺激产生行为反应背后的神经机制。
引言
动物常常会接触到非局部的机械刺激，例如振动或声波1,2。由于这些刺激会影响稳态、发育和繁殖，动物必须调整自身行为以应对这些刺激3,4,5。然而，介导此类行为调整的神经回路和机制仍不清楚。
线虫秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的机械感知行为是一种简单的行为范式，当线虫接触到非局部振动时，通常会从向前运动转变为向后逃避反应6。介导该行为的神经回路主要由五种感觉神经元、四对中间神经元以及多种运动神经元组成7,8。此外，线虫在经历重复刺激的间隔训练后，会对这类机械刺激产生习惯化9,10,11。因此，这种简单的行为反应构成了研究非局部振动诱发行为及其记忆神经机制的理想系统。本文展示了一种在非局....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 培养线虫直至进行钙成像
- 在进行钙成像实验前四天，使用细胞涂布器将两头成年ST12线虫转移至一个新的线虫生长培养基（NGM）平板上（材料表），该平板上已用Escherichia coli OP50菌液以约4 mm × 4 mm的方形模式划线接种，以便线虫在钙成像过程中大部分时间停留在细菌区域内12。
- 将该NGM平板置于20 °C培养箱（材料表）中培养4天。
2. 硬件设置
- 准备一台配备压电装置用于刺激的显微镜13，一个2倍物镜、一个高速sCMOS相机、图像分光光学元件、一个x-y轴电动载物台、一个用于激发的LED光源，以及一台计算机（图1）。sCMOS相机的关键参数包括2560 x 2160有效像素，像素尺寸为6.5 µm，接口选项配备10-tap Camera Link。X-Y电动载物台的主要参数包括110 mm x 75 mm行程范围，最大速度250 mm/s，加速度2,000 mm/s²。2 最大加速度，以及0.25 µm的单向重复定位精度。
- 打开计算机和x-y轴电动载物台控制器。
- 打开....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
此处以在AVA中间神经元特异性启动子调控下同时表达GCaMP和TagRFP的线虫为例，展示自由活动状态下钙成像的应用 秀丽隐杆线虫GCaMP 和 TagRFP 通道数据以一系列图像形式获取，其中部分图像如图所示 图6 以及作为一部影片（补充视频 1). 我们的非局域振动系统引起的培养皿位移（图7位移也可通过在振动控制软件中设置振幅值来控制。图3B）以及 体积 放大器中的调节器（图4），而频率则通过在软件中设置频率值来调节（图4）。在成功的实验中，当以频率为630 Hz、位移约为 4.5 µm 1 秒，表明在蠕虫对非定位刺激产生向后反应期间，AVA 神经元被激活（图6GCaMP 和 TagRFP 信号.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
通常，神经活动的定量分析需要引入探针和/或限制动物的身体运动。然而，在机械感觉行为的研究中，探针的侵入性引入以及对动物的束缚本身就会构成机械刺激。C. elegans 为解决这些问题提供了一个理想系统，因其具有透明的身体特征，并且其神经系统结构简单紧凑，仅包含302个神经元。结合这些优势与先前开发的诱导纳米级位移的非局域化振动的方法13，本文所展示的是一种对自由活动的 C. elegans 在受控振动刺激下进行非侵入性钙成像的方法。
机械刺激的特性由多个参数定义，例如频率、位移和持续时间。近年来，生物振动学（biotremology）作为一个新兴研究领域逐渐兴起1。此类研究的主要目的是理解生物体产生、传播和接收机械振动的机制，以及这些振动对行为的影响。许多动物（包括人类）利用振动和声波来监测周围环境。例如，蝎子通过介质传播的振动来探测猎物14。因此，振动是与周围环境进行交流的一种工具。本文所述方法可用于控.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
感谢Caenorhabditis遗传中心提供本研究所用的菌株。本出版物得到了日本学术振兴会（JSPS）科学研究费补助金（B）（课题编号 JP18H02483）、创新领域“"软体机器人科学"”项目（课题编号 JP18H05474）、日本医疗研究开发机构（AMED）PRIME项目（课题编号 19gm6110022h001）以及岛津基金会的资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 数据分析软件 | |||
| DualViewImaging.nb | 作者 | 用于获取数据的分析 | |
| Mathematica12 | Wolfram | 用于运行数据分析软件 DualViewImaging | |
| 大肠杆菌 和 秀丽隐杆线虫 品系 | |||
| 大肠杆菌 OP50 | 秀丽隐杆线虫遗传学中心 | OP50 | 食物用于 秀丽隐杆线虫 尿嘧啶营养缺陷型 大肠杆菌 B. |
| lite-1(ce314) 品系 | 秀丽隐杆线虫遗传学中心 | KG1180 | 对光不敏感的突变体 |
| lite-1(ce314) 表达由 AVA 特异性启动子调控的 NLS-GCaMP-NLS 和 TagRFP 的品系 | 作者 | ST12 | lite-1(ce314) 携带在NLS（核定位信号）调控下表达NLS-GCaMP5G-NLS和TagRFP基因的突变体 flp-18 启动子作为染色体外阵列 |
| 激光多普勒测振仪 | |||
| 激光多普勒测振仪 | Polytec Japan | IVS-500 | 用于量化 由声学换能器产生的频率和位移 |
| 小鼠宏观系统 | |||
| 检测方法.txt | 作者 | Windows 系统中用于时间与空间上控制鼠标光标的脚本 | |
| HiMacroEx | 向量 | https://www.vector.co.jp/download/file/winnt/util/fh667310.html | 基于脚本控制鼠标光标的免费下载软件 |
| 线虫生长培养基平板 | |||
| 经琼脂纯化的粉末 | 中野铁工 | 01162-15 | NGM 平板的制备 |
| 胰蛋白胨 | Becton Dickinson | 211677 | NGM 平板的制备 |
| 氯化钙 | 和光 | 036-00485 | NGM 平板的制备 |
| 胆固醇 | 和光 | 034-03002 | NGM 平板的制备 |
| 二磷酸氢钾 | 中野电气计器 | 28727-95 | NGM 平板的制备 |
| LB肉汤，Lennox | 中野铁工 | 20066-95 | 用于培养 大肠杆菌 OP50 |
| 无水硫酸镁 | TGI | M1890 | NGM 平板的制备 |
| 磷酸二氢钾 | 中野铁工 | 28720-65 | NGM 平板的制备 |
| 氯化钠 | 中野铁工 | 31320-05 | NGM 平板的制备 |
| 培养皿（60 mm） | Nunc | 150270 | NGM 平板的制备 |
| 非局域振动装置 | |||
| 放大器 | LEPY | LP-A7USB | 用于可控振动刺激 |
| 声学换能器 | MinebeaMitsumi | LVC25 | 用于可控振动刺激 |
| WaveGene 版本 1.5 | 茁壮成长 | http://efu.jp.net/soft/wg/down_wg.html | 免费下载用于控制振动特性的软件 |
| 非侵入性钙成像 | |||
| 2通道台式三相无刷直流伺服控制器 | Thorlabs | BBD202 | MLS203-1 位移台的兼容控制器 |
| 479/585 nm BrightLine 双通带通滤光片 | Semrock | FF01-479/585-25 | 用于双通道图像（GCaMP 和 TagRFP）的采集 |
| 505/606 nm BrightLine 双边标准落射荧光二向色镜分光器 | Semrock | FF505/606-Di01-25x36 | 用于双通道图像（GCaMP 和 TagRFP）的采集 |
| 512/25 nm BrightLine 单通带滤光片 | Semrock | FF01-512/25-25 | 用于双通道图像（GCaMP 和 TagRFP）的采集 |
| 630/92 nm BrightLine 单通带滤光片 | Semrock | FF01-630/92-25 | 用于双通道图像（GCaMP 和 TagRFP）的采集 |
| 计算机 | Dell | Precision T7600 | Windows7，配备 Intel Xeon CPU ES-2630 和 8 GB 内存 |
| 高速x-y电动载物台 | Thorlabs | MLS203-1 | 快速XY扫描台 |
| 图像分束光学系统 | 滨松光子学 | A12801-01 | 使用 W-VIEW GEMINI 图像分光光学系统获取双通道图像（GCaMP 和 TagRFP） |
| LED 光源 | CoolLED | pE-4000 | 用于产生470 nm和560 nm激发光 |
| 显微镜 | 奥林巴斯 | MVX10 | |
| sCMOS相机 | Andor | Zyla | |
| ×2 物镜 | 奥林巴斯 | MVPLAPO2XC | 工作距离 20 mm，数值孔径 0.5 |
| 质粒 | |||
| pKDK66 质粒 | 作者 | pKDK66 | 共注射标记物 |
| pTAK83 质粒 | 作者 | pTAK83 | 在控制下表达TagRFP的质粒 的 flp-18 启动子 |
| pTAK144 质粒 | 作者 | pTAK144 | 在控制下表达 NLS-GCaMP5G-NLS 的质粒 的 flp-18 启动子 |
| 追踪软件 | |||
| homingback.vi | 作者 | 通过sCMOS相机和x-y电动载物台的反馈控制追踪线虫荧光斑点的SubVi文件 | |
| LabVIEW | 国家仪器 | 用于运行追踪软件 | |
| Zyla Control 版本 2.6CI.vi | 作者 | 通过sCMOS相机和x-y电动载物台的反馈控制追踪线虫的荧光斑点 |
参考文献
- Hill, P. S. M., Wessel, A. Biotremology. Current Biology. 26 (5), 187-191 (2016).
- Fettiplace, R., Hackney, C. M. The sensory and motor roles of auditory hair cells. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 19-29 (2006).
- Vogel, V., Sheetz, M.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
