本方案详细描述了一种改进的方法，用于诱导人诱导性多能干细胞分化，从而获取、扩增并冻存脑微血管内皮细胞，并用于研究血脑屏障特性的体外模型 离体 模型
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摘要
摘要
人诱导多能干细胞（iPSCs）可分化为脑微血管内皮细胞（BMECs），用于建立 离体 用于研究血脑屏障（BBB）功能的细胞模型。该改进方案提供了从人诱导性多能干细胞（iPSCs）中诱导、扩增和冻存脑微血管内皮细胞（BMECs）的详细步骤，所使用的供体和试剂与先前报道的方案不同。iPSCs首先在Essential 6培养基中培养4天，随后在添加碱性成纤维细胞生长因子、视黄酸和B27补充剂的人内皮无血清培养基中继续培养2天。第6天时，将细胞传代至胶原蛋白/纤连蛋白基质上培养2天。第8天进行免疫细胞化学染色，利用CLDN5、OCLN、TJP1、PECAM1和SLC2A1检测BMEC标志物的表达。通过Western blot验证BMEC标志物的表达以及内胚层标志物SOX17的缺失。通过出芽实验评估细胞的血管生成潜能。从第7天开始，使用筷子状电极和伏欧姆计测量跨内皮电阻（TEER）。第8天利用多孔板读数仪检测ATP结合盒亚家族B成员1和ATP结合盒亚家族C成员1外排转运体的活性。BMECs成功诱导的判定标准包括：相关细胞标志物的表达、SOX17表达水平低、具备血管生成潜能、具有转运体活性，且TEER值约为2000 Ω × cm。2BMECs 扩增至第10天后，可传代至新包被的胶原蛋白/纤连蛋白培养板或进行冻存。本方案表明，由iPSC衍生的BMECs至少可扩增并传代一次。然而，冻存后BMECs的TEER值降低，且BMEC标志物的定位能力变差。BMECs可用于与其他细胞类型（神经元、胶质细胞、周细胞）的共培养实验。, 在三维脑模型（器官芯片和水凝胶）中用于脑类器官的血管化，以及研究神经精神疾病中的血脑屏障功能障碍。
引言
血脑屏障功能
血脑屏障（BBB）形成了一道边界，限制物质从血液进入大脑。BBB由脑微血管内皮细胞（BMECs）构成，这些细胞形成单层结构，衬于血管内壁。BMECs与星形胶质细胞、神经元、周细胞、小胶质细胞以及细胞外基质共同组成神经血管单元。BMECs具有高度调控的细胞旁结构，使BBB能够维持较高的跨内皮电阻（TEER），从而限制被动扩散，并作为屏障完整性的指标1,2。BMECs还表达多种蛋白，协助物质通过胞吞作用、转胞吞作用和跨细胞迁移等方式进行跨细胞运输，也在免疫反应过程中介导白细胞的渗出3。BMECs依赖于摄入和外排转运蛋白来获取营养并清除代谢废物，以维持大脑内的稳态平衡3。例如，溶质载体家族2成员1（SLC2A1）是一种摄入转运蛋白，负责葡萄糖通过BBB的转运4，而外排转运蛋白如ATP结合盒亚家族B成员1（ABCB1）和ATP结合盒亚家族C成员1（ABCC1）则负责将底物重新转运回血液中3,5,6,
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方案
人类诱导性多能干细胞（iPSCs）系通过经麻省总医院和麦克莱恩医院机构审查委员会批准的方案，由健康供体的成纤维细胞重编程获得，并如先前研究所述进行表征44,45,46。
注：简而言之，成纤维细胞通过基于 mRNA 的基因重编程技术被重编程为诱导多能干细胞（iPSC）47。iPSC 在干细胞培养基（SCM）（参见材料列表）中维持培养，并以约 1.2 × 102 个细胞/mL 的密度储存，每管加入 1 mL SCM、10 μM 的 Rho 相关蛋白激酶抑制剂（ROCKi）Y-27632 以及 10%（v/v）二甲基亚砜（DMSO），置于液氮中 -160 °C 冷冻保存。以下所有操作均在生物安全柜中进行，除非另有说明。
1. 基底膜基质稀释与培养板包被
- 用不含酚红的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）将从Engelbreth-Holm-Swarm肿瘤中纯化的生长因子减少型基底膜基质稀释（1:50）。
- 用适量稀释后的基底膜基质包被细胞培养板（例如，6孔板=1 mL，12孔板=0.5 mL），并在37 °C孵育至少1小时。
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结果
BMEC 分化
本方案中有几个关键步骤必须严格遵循（图1）。第1天使用E6培养基非常重要，因为该培养基常用于在较短时间内从iPSC诱导生成神经外胚层谱系，并在多种细胞系中获得可重复的结果36。另一个关键步骤是在分化的第4天，将E6培养基更换为含稀释（1:200）B27、20 ng/mL bFGF和10 μM RA的hESFM，以扩增iPSC来源的BMEC。添加B27补充剂可作为牛血清的替代物，支持无血清细胞培养1；bFGF的加入有助于促进iPSC来源BMEC的生长6；而RA则用于促进血脑屏障（BBB）表型的发育35。最后一个关键步骤是纯化阶段，即将第6天的iPSC来源BMEC传代至COL4/FN包被的培养板上，以筛选iPSC来源的BMEC1,6.......
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讨论
修改与故障排除
在本实验方案中，我们在诱导多能干细胞（iPSC）培养以分化为脑微血管内皮细胞（BMEC）的过程中，对常用的细胞外基质和细胞培养基进行了若干修改（图1）。这些修改并未影响从人iPSC分化获得BMEC的能力，结果仍符合Lippmann实验方案所述1。为验证该改良方案的普适性，本研究采用来自另一健康供体的iPSC细胞系，证明其结果与其他细胞系在既往研究中获得的结果具有可比性1。在细胞冻存过程中，使用B27添加剂替代1%血小板贫浆来源血清（PDS）40，但该替代会影响后续培养中BMEC的特性维持。关于问题排查，跨内皮电阻（TEER）值在稳定前可能出现快速波动，这种波动可能是由于将培养板从37 °C转移至室温时温度变化所致37。为克服此问题，应快速、高效且一致地完成测量。如有必要，可采用Blum.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了美国国家心理健康研究所生物行为研究创新新科学家奖（BRAINS奖）R01MH113858（授予R.K.）、美国国立卫生研究院奖KL2 TR002542（授予P.L.）、美国国家心理健康研究所临床科学家发展奖K08MH086846（授予R.K.）、悉尼·R·贝尔 Jr 基金会资助（授予P.L.）、多丽丝·杜克慈善基金会临床科学家发展奖（授予R.K.）、Ryan Licht Sang双相障碍基金会（授予R.K.）、Phyllis & Jerome Lyle Rappaport基金会（授予R.K.）、哈佛干细胞研究所（授予R.K.）以及Steve Willis和Elissa Freud（授予R.K.）的支持。我们感谢Annie Kathuria博士对本文稿的仔细审阅和宝贵意见。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯 | Sigma Aldrich | D6883-50MG | |
| Accutase | Sigma Aldrich | A6964-100mL | |
| Alexa Fluor 488 驴抗小鼠 IgG | Life Technologies | A-21202 | |
| Alexa Fluor 555 驴抗兔 IgG | Life Technologies | A-31572 | |
| B27 添加剂 | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| CD31 (PECAM-1) (89C2) 小鼠单克隆抗体 | Cell Signaling | 3528S | |
| CLDN5 (Claudin-5) | Thermo Fisher Scientific | 35-2500 | |
| 人胎盘来源的 IV 型胶原蛋白 | Sigma Aldrich | C5533-5mg | |
| Corning 2 mL 内螺纹聚丙烯冷冻管 | Corning | 8670 | |
| Corning Costar 平底细胞培养板（6 孔） | Corning | 353046 | |
| Corning Falcon 平底细胞培养板（24 孔） | Corning | 353047 | |
| Corning Transwell 多孔板，带可渗透聚酯膜插件（12 孔） | Corning | 3460 | |
| Countess 载玻片 | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| DMEM/F12（不含酚红） | Thermo Fisher Scientific | A1413202 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2438-50mL | |
| 驴血清 | Sigma Aldrich | D9663-10ML | |
| DPBS (+/+) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 14040-117 | |
| 上皮细胞伏特/欧姆（TEER）测量仪（EVOM2）STX2 | World Precision Instruments | N/A | |
| Essential 6 培养基（Thermo Fisher） | Thermo Fisher Scientific | A1516401 | |
| 胎牛血清（FBS） | Sigma Aldrich | F2442 | |
| 纤连蛋白 | Sigma Aldrich | F2006-2mg | |
| Geltrex LDEV-无、生长因子减少型基底膜基质 | Thermo Fisher Scientific | A1413202 | |
| 含钙和镁的 Hank's 平衡盐溶液 | Thermo Fisher Scientific | 24020-117 | |
| Hoechst 33342，三盐酸盐，三水合物 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| 人内皮细胞无血清培养基 | Thermo Fisher Scientific | 11111044 | |
| InCell Analyzer 6000 | General Electric | N/A | |
| Invitrogen Countess 自动细胞计数仪 | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| MK-571 | Sigma Aldrich | M7571-5MG | |
| NutriStem | Stemgent | 01-0005 | |
| Occludin | Thermo Fisher Scientific | 33-1500 | |
| 16% 甲醛 | Electron Microscopy Services | 15710 | |
| Perkin Elmer Envision 2103 多孔板读数仪 | Perkin Elmer | N/A | |
| 重组人 VEGF 165 | Peprotech | 100-20 | |
| 重组人碱性 FGF（154 个氨基酸） | Peprotech | 100-18B | |
| 视黄酸 | Sigma Aldrich | R2625-100MG | |
| 罗丹明 123 | Sigma Aldrich | 83702-10MG | |
| SLC2A1 (GLUT-1) | ThermoFisher | PA1-21041 | |
| SOX17 | Cell Signaling | 81778S | |
| TJP-1 (ZO-1) | ThermoFisher | PA5-28869 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-50ML | |
| 台盼蓝染色液（0.4%），用于 Countess 自动细胞计数仪 | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Valspodar (Sigma) (环孢素 A) | Sigma Aldrich | SML0572-5MG | |
| Versene 溶液 | Thermo Fisher Scientific | 15040066 | |
| Y-27632 二盐酸盐（ROCK 抑制剂） | Tocris/Thermo Fisher Scientific | 1254 |
参考文献
- Neal, E. H., et al. A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs. Stem Cell Reportsorts. 12, 1380-1388 (2019).
- Smith, Q. R., Rapoport, S. I.
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