我们提出一种无需基因改造（非转基因）的方法，通过重编程外周血细胞获得具有神经元表型的细胞。激活与一种新型人源GPI锚定蛋白相关的信号通路，揭示了一种高效、非转基因获取人多能干细胞的方法。
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摘要
摘要
许多人 神经系统疾病由脑内神经元和胶质细胞的退化引起。由于药理学及其他治疗策略存在局限性，目前尚无有效方法治愈受损或病变的脑组织。细胞替代疗法被认为是治疗神经退行性疾病的一种有前景的策略。迄今为止，神经干细胞（NSCs）已成功来源于胎儿组织、人类胚胎干细胞（ES）或诱导性多能干细胞（iPSC）。通过激活一种新型的人源糖基磷脂酰肌醇锚定糖蛋白（GPI-linked glycoprotein），可启动去分化过程，从而生成多能干细胞。这些来源于血液的多能干细胞（BD-PSCs）具有分化潜能 体外 通过明场和免疫荧光显微镜观察，细胞呈现神经表型。利用电子显微镜进行的超微结构分析进一步证实了这些细胞的原始结构以及类似神经元的形态和亚细胞特征。
引言
基础与临床前干细胞研究方法的发展推动了基于干细胞的疗法在神经系统疾病中的临床应用。这种潜在疗法的关键在于人类神经细胞的生成方法，以实现功能恢复1。
神经干细胞（NSCs）能够自我更新，并在整个生命过程中分化为新的神经元，这一过程称为成年神经发生。只有极少数脑区含有能够在成年期产生新生神经元的神经干细胞。这些神经干细胞可分化为成熟的神经元，参与学习和记忆功能，从而替代丢失或受损的神经元。然而，这些神经干细胞的数量非常有限，且这种有限的神经发生能力在幼年发育期间迅速下降2。因此，在细胞治疗的目标下，必须考虑其他神经细胞来源。
退行性神经系统疾病难以通过常规药理学方法治愈。针对许多难治性神经系统疾病的新型治疗策略，主要基于对病变和受损组织的细胞替代疗法。神经干细胞（NSC）移植可替代受损细胞并产生有益效果。其他用于神经细胞替代的来源包括人胚胎干细胞（ESC），其来源于哺乳动物囊胚的内细胞团3，以及诱导多能干细胞（iPSCs）4，后者具有与ESC相似的广泛自我更新能力，并可分化为多种细胞谱系。此外，NSCs还可通过直接重编程人成纤维细胞获得，从而避免进入多能状态5。
细胞替代疗法仍然是一个具有挑战性的问题。尽管胚胎干细胞（ESC）、胎儿细胞或诱导多能干细胞（iPS）可作为生成神经元细胞的来源，用于治疗多种无法治愈的神经系统疾病，但自体成体干细胞（SCs）对受损组织进行细胞替代是一种更优的选择，可避免免疫学、伦理学及安全性方面的担忧。
通过抗体交联激活人GPI锚定蛋白 通过 PLCγ/PI3K/Akt/mTOR/PTEN 的磷酸化启动了造血祖细胞的去分化过程，并产生血液来源的多能干细胞（BD-PSCs）6这些细胞分化 体外 通过明场、免疫荧光和透射电子显微镜（TEM）分析证实，向神经元细胞分化。
在本研究中，我们描述了无需基因修饰生成BD-PSCs的方法，并成功将其重新分化为具有神经元表型的细胞。
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方案
进行实验时已获得伦理批准。
1. 人外周血单个核细胞（PBMNCs）的分离
- 确保所有供血者在采血前均已签署知情同意书，并符合机构指南的要求。
- 由经过培训的医务人员根据标准操作规程从健康供血者采集 30 mL 血液。
- 采用密度梯度介质分离外周血单个核细胞（PBMNCs）。将 10 mL 介质与 25 mL 用磷酸盐缓冲液（PBS）按 1:1 稀释的血液混合，于 300 x g 离心 30 分钟。
- 用移液器吸取血浆层与密度梯度介质之间的中间层。用 5 mL 无菌 PBS 洗涤分离的细胞，并于 300 x g 离心 10 分钟。重复洗涤两次。
- 使用计数板通过标准方法对细胞数量进行计数。
2. 通过抗体交联激活外周血单个核细胞表面的人源GPI锚定糖蛋白
- 将6 × 106个单个核细胞（MNCs）置于15 mL离心管中，在37 °C条件下，用含1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS缓冲液重悬细胞，并加入针对人GPI锚定膜蛋白的特异性抗体（30 µg/mL），孵育30分钟以进行抗体交联。
- 弃去孵育液，更换为添加了10%胎牛血清（FBS）的Iscove改良Dulbecco培养基。
- 将细胞置于15 mL聚苯乙烯管中，在37 °C、5% CO2条件下培养8–10 天（无需摇动）。在第5天，向每管15 mL培养体系中额外添加1–2 mL含10% FBS的Iscove培养基。
3. 新生去分化细胞的分选
- 使用自动细胞计数器（18 µL 细胞悬液 + 2 µL 荧光染料）或血细胞计数板对细胞进行计数。
- 将培养的细胞悬液（5–7 × 106）在 300 × g 条件下离心 10 分钟，并用无菌巴斯德吸管吸除上清液。
- 用 90 µL 预冷的 PBS（pH 7.2）、含 0.5% BSA 和 2 mM EDTA）重悬细胞沉淀。
- 向细胞悬液中加入 CD45 阳性纳米级磁珠（80 µL），冰上孵育 15 分钟。
- 加入 2 mL PBS 缓冲液洗涤细胞，在 300 × g 条件下离心 10 分钟。
- 将细胞重悬于 500 µL PBS 缓冲液中。
- 用 500 µL 预冷的 PBS 缓冲液冲洗分离柱，并将其置于磁场中。
- 将细胞悬液上样至分离柱，用 500 µL PBS 缓冲液洗涤两次，收集穿柱液中的 CD45 阴性细胞，置于添加 1% BSA 的 Iscove 培养基中。
- 使用血细胞计数板对细胞进行计数。
4. 为新生成的干细胞进行神经元分化准备细胞培养皿
- 使用多聚-L-鸟氨酸和层粘连蛋白包被培养器皿，用于神经元细胞的培养。
- 将玻璃盖玻片放入4孔板中，并用1:5稀释的多聚-L-鸟氨酸（0.1 mg/mL，溶于ddH2O）在ddH2O中包被。将盖玻片置于37 °C培养箱中孵育1小时，然后用ddH2O洗涤。
- 缓慢解冻层粘连蛋白（0.5–2.0 mg/mL），并将其加入盖玻片表面。在37 °C孵育2小时。
- 配制神经诱导培养基N2，成分为49 mL D-MEM/F12、500 µL N2添加剂、400 µL非必需氨基酸（NEAA）、终浓度为20 ng/mL的基础成纤维细胞生长因子（bFGF）溶液（由100 µg/mL储备液稀释而成），以及终浓度为2 ng/mL的肝素。
- 用移液器吸除多余的层粘连蛋白，向培养皿中加入神经元培养基N2。
5. 神经元去分化血细胞的培养
- 将BD来源的CD45阴性细胞接种于涂有层粘连蛋白/鸟氨酸的玻璃盖玻片上，在37 °C、5% CO2的培养箱中使用N2培养基培养2天，以启动新生成BD细胞的神经元分化。
- 继续使用神经元分化培养基培养细胞，该培养基由48 mL Neurobasal培养基、500 µL L-谷氨酰胺、1 mL B27添加剂、500 µL NEAA、50 µL重组人胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）（溶于PBS/0.1% BSA，浓度为5 µg/250 µL）、50 µL重组人脑源性神经营养因子（BDNF）（溶于PBS/0.1% BSA，浓度为5 µg/200 µL）以及50 µL抗坏血酸溶液（2.9 g/50 mL，溶于PBS）组成。将培养板置于37 °C、5% CO2的培养箱中。
6. 血源性神经细胞的免疫荧光显微镜分析
- 按照上述方法培养细胞16天，然后移除培养基。
- 使用预热的固定液进行孵育，固定液成分为75 mL无菌水、4 g多聚甲醛。根据需要加入10 N NaOH，搅拌至溶液澄清。然后加入10 mL 10x PBS、0.5 mL MgCl2、2 mL 0.5 M EGTA 和 4 g蔗糖。用6 N HCl滴定至pH 7.4，再加无菌水定容至100 mL，作用15分钟，具体操作参照Marchenko等人的方法7。
- 弃去固定液，用PBS洗涤细胞3次，每次5分钟。立即加入新配制的0.3% Triton X溶液，透化细胞5分钟。再用PBS洗涤3次，加入由PBS和5% BSA配制的封闭液。
- 将细胞置于摇床上，室温封闭1小时。
- 将抗体用1% BSA/PBS溶液进行适当稀释，室温下在摇床上孵育细胞1.5小时。用PBS洗涤细胞3次，每次5分钟，然后孵育DAPI染液，用封片剂将盖玻片封片，以便在显微镜下观察。
注意：本实验中使用的直接标记抗体列于材料表中。
7. 新生细胞的透射电子显微镜分析
- 在8孔腔室载玻片中接种用于透射电子显微镜观察的细胞。
- 在37 °C下用3.5%戊二醛固定细胞1小时，随后用2% OsO₄进行后固定4 室温下继续孵育1小时，随后在4 °C避光条件下用2%醋酸铀染色2小时30分钟。
- 最后，用蒸馏水冲洗细胞，经乙醇脱水后，在环氧树脂中4℃过夜浸透包埋。次日将样品转移至70 °C烘箱中，加热72 h使树脂固化。
- 将嵌入式细胞培养物从培养腔室中分离，并粘附于Araldite块上。
- 使用切片机切割连续半薄切片（1.5 µm），贴附于载玻片上，并用1%甲苯胺蓝进行轻微染色。
- 将选定的半薄切片用胶粘贴至Araldite包埋块上，通过反复冷冻（液氮中）和解冻，使其从玻片上脱落。
- 使用机器制备超薄切片（0.06–0.08 µm），并用柠檬酸铅进一步对比染色。
- 使用配备数字相机的扫描电子显微镜获取显微图像。
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结果
实验结果表明，这种新型的非转基因方法能够在不直接作用于人类基因组的情况下，将血液前体细胞逆转至最原始的状态。
我们先前已证明，GPI锚定蛋白特异性抗体的交联可启动 通过 PLCγ/IP3K/Akt/mTOR/PTEN 上调进化上高度保守的发育相关基因（如 WNT、NOTCH 和 C-Kit），从而启动去分化过程，这是生成造血干细胞（HSCs）的第一步，也是最终生成BD-PSCs的第二步和最后一步6,8.
采用CD45微珠对活化的单个核细胞（MNC）培养物进行免疫磁珠分选。无法通过该方法重编程的成熟血细胞（例如CD45阳性细胞）被保留在柱上，而含有重编程细胞的阴性组分（CD45阴性细胞）则用于生成多种神经谱系细胞。
我们首先通过光学显微镜和透射电子显微镜（TEM）研究了外周BD去分化细胞的形态学特征。如
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讨论
本研究中描述的非转基因重编程人类细胞方法基于膜至核信号传导机制的激活，该机制由启动去分化过程的糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定的人类膜糖蛋白所介导，进而导致 离体 从未经处理的人类外周血中获取并扩增具有自我更新能力的多能干细胞。这些细胞在适当的培养基中培养时，能够再分化为属于不同胚层的细胞。6.
本研究展示的数据表明，无转基因方法生成的BD-PSCs细胞在神经元分化培养基中培养后，呈现出完全不同的表型，细胞形态伸长，细胞器发育更为充分，并且细胞间形成了更复杂的相互作用。此外，采用本文所述条件进行再分化，可诱导细胞向多种神经元谱系分化。
为了获得最佳数量和质量的重编程细胞用于再分化研究，使用新鲜的单个核细胞（MNC）制备物可能优于冷冻保存的MNC制备物。采用免疫磁珠分选方法将BD-PSCs与终末分化的细胞分离，而后者无法通过该方法进行重编程；但该分选过程可能不完全，需要重复操作，这会对细胞造成极大的应激，导致其过早死亡。
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披露
通讯作者声明，她拥有关于新型人GPI锚定蛋白的专利，并且共同创立了ACA CELL Biotech公司并在该公司工作。其他作者声明不存在任何利益冲突。
致谢
谨以此文纪念 Rainer Saffrich 博士。
作者特别感谢西班牙瓦伦西亚大学瓦伦西亚生物多样性和进化生物学卡瓦尼列斯研究所CIBERNED比较神经生物学实验室的José Manuel García-Verdugo和Vicente Herranz-Pérez，他们在该实验室完成了电镜实验与分析工作，该实验室获得了Prometeo优秀研究团队项目（PROMETEO/2019/075）的研究经费支持。本工作的其余部分由德国海德堡ACA CELL Biotech GmbH资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 白蛋白第五组分 | Roth | T8444.4 | |
| 抗GFAP-Cy3偶联抗体 | Merck Millipore | MAB3402C3 | |
| 抗MAP2-Alexa Fluor 555抗体 | Merck Millipore | MAB3418A5 | |
| 抗Nestin-Alexa Fluor 488抗体 | Merck Millipore | MAB5326A4 | |
| 抗Tuj1-Alexa Fluor 488抗体 | BD Pharmingen | 560381 | |
| AO/PI细胞活力检测试剂盒 | Biozym | 872045 | Biozym已停产。该产品由Logos Biosystems生产。 |
| 抗坏血酸-2-磷酸镁 | Sigma Aldrich | A8960-5G | |
| B27无血清培养基（50倍浓缩） | Fisher Scientific (Gibco) | 11530536 | |
| 碱性成纤维细胞生长因子溶液 | Fisher Scientific (Gibco) | 10647225 | |
| Biocoll | Merck Millipore | L6115-BC | 密度梯度介质 |
| BSA第五组分 7.5% | Gibco | 15260037 | |
| CD45微珠 | Miltenyi | 130-045-801 | 纳米级磁性微珠 |
| Luna细胞计数板 | Biozym | 872010 | Biozym已停产。该产品由Logos Biosystems生产。 |
| Lab-Tek腔室载玻片 | Fisher Scientific | 10234121 | |
| D-MEM/F12培养基 | Merck Millipore | FG4815-BC | |
| Durcupan | Sigma Aldrich | 44610 | 环氧树脂 |
| 胎牛血清 | Merck Millipore | S0115/1030B | 已停产。可替换产品编号：TMS-013-B |
| 重组人GDNF | Fisher Scientific (Gibco) | 10679963 | |
| GlutaMax（100倍浓缩） | Gibco | 35050038 | L-谷氨酰胺 |
| 戊二醛（分析级） | Sigma-Aldrich | G5882-50ML | |
| 肝素钠（细胞用） | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| 人源BDNF | Fisher Scientific (Gibco) | 11588836 | |
| Iscove培养基（IMDM） | Biochrom | FG0465 | |
| 小鼠层粘连蛋白 | Fisher Scientific (Gibco) | 10267092 | |
| 柠檬酸铅 | Sigma-Aldrich | 15326-25G | |
| Luna FL全自动细胞计数仪 | Biozym | 872040 | Biozym已停产。该产品由Logos Biosystems生产。 |
| MACS缓冲液 | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MEM非必需氨基酸（100倍浓缩） | Gibco | 11140035 | |
| MiniMACS分离柱 | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Morada数码相机 | Olympus | ||
| Nunclon四孔多孔板 | Fisher Scientific | 10507591 | |
| N2添加剂（100倍浓缩） | Fisher Scientific (Gibco) | 11520536 | |
| Neurobasal培养基 | Gibco | 10888022 | |
| 无菌PBS | Roth | 9143.2 | |
| 多聚-L-鸟氨酸 | Sigma-Aldrich | P4957-50ML | |
| Loctite 3秒胶 | Henkel | ||
| 透射电子显微镜 FEI Technai Gä22 Spirit | FEI Europe | ||
| 超薄切片机 Ultracut UC-6 | Leica | ||
| 醋酸铀酰 C | EMS | 22400 |
参考文献
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