使用高分辨率熔解分析检测 CALR 基因中的遗传变异

摘要

高分辨率熔解分析（HRM）是遗传变异检测的灵敏快速解决方案。这取决于导致异质双链体改变熔化曲线形状的序列差异。通过梳理HRM和琼脂糖凝胶电泳，可以鉴定不同类型的遗传变异，如indels。

摘要

高分辨率熔解分析（HRM）是基因分型和遗传变异扫描的强大方法。大多数HRM应用依赖于检测序列差异的饱和DNA染料，以及改变熔化曲线形状的异质双链体。需要出色的仪器分辨率和特殊的数据分析软件来识别识别变异或基因型的微小熔化曲线差异。在针对特定疾病（尤其是癌症）患者的特异性基因中，以及在费城染色体阴性骨髓增殖性肿瘤患者的 CALR 基因中，可以观察到具有不同频率的不同类型的遗传变异。目标基因中的单核苷酸变化，插入和/或缺失（indels）可以通过HRM分析检测到。不同类型遗传变异的鉴定主要基于qPCR HRM测定中使用的对照。然而，随着产物长度的增加，野生型和杂合子曲线之间的差异变小，遗传变异的类型更难确定。因此，当indels是目标基因中预期的流行遗传变异时，可以使用琼脂糖凝胶电泳等其他方法来澄清HRM结果。在某些情况下，不确定的结果必须通过标准 Sanger 测序重新检查/重新诊断。在这项回顾性研究中，我们将该方法应用于患有MPN的 JAK2 V617F阴性患者。

引言

钙质素基因（CALR）的体细胞遗传变异在2013年在骨髓增殖性肿瘤（MPN）患者中得到认可，如原发性血小板增多症和原发性骨髓纤维化^1，2。从那时起，在CALR基因中发现了50多个遗传变异，诱导了+1（−1 + 2）帧移^位3。两个最常见的CALR遗传变异是52 bp缺失（NM_004343.3（CALR）:c.1099_1150del52，p.（Leu367Thrfs*46）），也称为1型突变，以及5 bp插入（NM_004343.3（CALR）:c.1154_1155insTTGTC，p.（Lys385Asnfs*47）），也称为2型突变。这两个遗传变异代表了所有CALR遗传变异的80%。其他的已被归类为1型或2型相似，使用基于保存接近野生型CALR⁴的α螺旋的算法。在这里，我们介绍了一种用于CALR遗传变异检测的高灵敏度和快速方法，即高分辨率熔解分析方法（HRM）。该方法能够快速检测1型和2型遗传变异，这些变异代表了大多数CALR突变^5。HRM于1997年与实时"聚合酶链反应"（qPCR）相结合引入，作为检测因子V Leiden^{6突变的工具}。与代表黄金标准技术的Sanger测序相比，HRM是一种更灵敏且特异性更低的方法^5。HRM方法是一种很好的筛选方法，可以快速分析大量样品，并具有巨大的成本效益⁵。这是一种在荧光染料存在下进行的简单PCR方法，不需要特定的技能。另一个好处是，该过程本身不会损坏或破坏分析的样品，这使我们能够在HRM程序⁷之后重复使用样品进行电泳或Sanger测序。唯一的缺点是有时很难解释结果。此外，HRM不能在非1型或2型突变的患者中检测到确切的突变^8。在这些患者中，应进行Sanger测序（图1）。

HRM基于在饱和DNA荧光染料存在下对特定DNA区域的扩增，其掺入双链DNA（dsDNA）中。荧光染料在掺入dsDNA时会发光。在温度逐渐升高后，dsDNA分解成单链DNA，可以在熔融曲线上检测到荧光强度的突然降低。熔化曲线的形状取决于用于检测突变的DNA序列。将样品的熔化曲线与已知突变或野生型CALR的熔融曲线进行比较。不同的熔融曲线代表非类型1或类型2⁹的不同突变。

通过HRM、琼脂糖凝胶电泳和测序方法检测 CALR 基因中体细胞遗传变异的算法（图1）在¹⁰之前发表的回顾性研究中得到了应用和验证。

方案

该研究得到了斯洛文尼亚共和国医学伦理委员会的批准。所有程序都符合《赫尔辛基宣言》。

1. 基于荧光的定量实时荧光聚合酶链（qPCR）和HRM的qPCR后分析

1. 将 材料表中 列出的引物重悬至100μM，不含无菌，RNase和DNase的H₂O（见 材料表）。制作10μM工作浓度底漆。该协议中使用的引物在²之前发表。
2. 按照制造商的说明¹¹ 通过荧光染色方法定量粒细胞DNA（见 材料表）。使用10mM Tris-Cl，0.5mM EDTA，pH 9.0制备20ng / μL DNA溶液（见 材料表）。
   1. 除DNA样本外，还准备至少三种DNA对照:两个阳性对照，NM_004343.3（CALR）:c.1099_1150del52，p.（Leu367Thrfs*46）（52 bp缺失或1型突变），和NM_004343.3（CALR）:c.1154_1155insTTGTC，p.（Lys385Asnfs*47）（5 bp插入或2型突变）遗传变异，以及野生型DNA和阴性对照作为非模板（NTC）对照。
      注意:在执行HRM设置之前，请确认qPCR仪器已针对HRM实验进行了校准。
3. 根据制造商的方案（见 材料表）制备qPCR HRM预混液如下:10μL2x qPCR预混料与染料，0.2μL10μM正向底漆，0.2μL10μM反向底漆，8.6μL无菌，RNase和DNase游离H₂O. 使用 材料表中的引物。对每个DNA样本和对照运行三次重复。
   1. 根据正在处理的样品数量准备qPCR HRM预混液。在计算中包括至少10%的过量体积，以提供试剂转移过程中发生的损失的过量体积。
4. 通过轻轻敲击并倒置管并涡旋2-3 s来混合反应内容物。通过短暂的旋转收集从管壁到底部的所有散落液滴。
5. 准备适合仪器和HRM实验的反应板（见 材料表）。将19μL qPCR HRM预混液转移到96孔光学反应板的适当孔中。
6. 将1μL阴性对照，阳性对照和样品移液到光学反应板的适当孔中。对于NTC，转移1μL无菌，RNase和DNase游离H₂O，用于制备qPCR HRM预混液而不是DNA。
7. 用光学粘合膜密封反应板。用力防止在运行过程中蒸发。检查光学胶膜是否在反应板中的所有孔上都是平面的，以确保正确的荧光检测。
8. 在室温（RT）下以780×g旋转反应板1分钟。 检查液体是否在反应板中孔的底部。继续运行测定。
   注意:协议可以在此处暂停。将板在4°C下储存不超过24小时。让储存在4°C的板温升至室温，然后在运行之前短暂旋转板。
9. 根据制造商的说明准备并开始运行以扩增和熔化DNA，并在qPCR仪器中生成HRM荧光数据。在仪器系统软件中，将控制装置和样品分配到适当的孔中。
10. 对于 CALR 遗传变异检测，更改默认的仪器扩增方案并使用以下热循环方案扩增DNA:95°C持续10分钟，然后在95°C下循环50次，持续10秒，62.5°C持续60秒。
11. 在qPCR之后立即按照制造商的说明¹² 执行熔融曲线/解离（HRM）阶段，如下所示:95°C持续10秒，60°C持续1分钟，然后升温速率为0.025°C / s，直到95°C。 将温度保持在95°C15秒，在60°C下保持15秒。
12. 运行将自动结束。首先，查看并验证扩增图（图2）。
13. 在仪器系统软件的实验菜单中，选择扩增图选项。如果未显示任何数据，请单击绿色按钮 "分析"。
    1. 在扩增图选项卡中，从图类型下拉菜单中，选择显示扩增数据的图，该图显示的原始荧光读数作为被动参考（ΔRn）的荧光归一化为来自被动参考（ΔRn）的荧光，作为周期数（ΔRn vs Cycle）的函数。在打印颜色下拉菜单中，选择" 示例"。
14. 从图形类型下拉菜单中，选择线性放大图形类型。通过选择基线开始选项，在线性放大图上显示基线开始和结束周期。验证基线设置是否正确。在检测到明显荧光信号的周期数之前，应将结束周期设置为几个周期。基线通常设置为3至15个周期（图2）。
15. 从图表类型下拉菜单中，选择log10 放大图表类型。通过选择阈值选项在图表上显示阈值线。如果未正确设置，请相应地调整阈值。正确设置的阈值意味着阈值线穿过qPCR曲线的指数相位（图2）。
16. 验证所有样品和阳性对照孔中是否有正常的扩增曲线。验证周期 40 之前 NTC 孔中没有扩增。正常的扩增图显示荧光的指数增长超过了周期15和35之间的阈值（图2）。如果孔位置没有扩增，则从分析中排除样品孔。
    注:如果扩增图看起来异常或NTC信号孔指示扩增，请根据制造商的故障排除指南识别并解决问题。
17. 排除定量周期（Cq）值与仪器系统软件¹²中的重复值相差2以上异常值。异常值可能会产生错误的 HRM 结果。
18. 在导数熔化曲线中，查看熔化前和熔化后区域/温度线。熔化前和熔后区域应在荧光水平中没有大峰或斜率的平坦区域内（图3）。如果需要，请相应地进行调整。设置熔化前和熔化后温度管路的启动和停止，彼此相距约0.5°C（图3）。如果通过单击"分析"按钮调整了参数，请重新启动 分析 。
19. 在差异图选项卡的图解设置选项卡中，选择一个野生型对照（纯合子）复制作为参考DNA，然后单击" 分析 "按钮重新开始分析。
20. 在对齐的熔体曲线选项卡中，确认所有阳性对照具有正确的基因型并且NTC未能扩增（图4）。从孔表中，选择包含正对照的孔，以突出显示分析图中的相应熔融曲线。确认品系的颜色对应于正确的基因型。对含有其他阳性对照和NTC的孔重复步骤。
21. 在对齐的熔融曲线选项卡中，仔细查看未知样品的图显示，并将其与对照的图显示进行比较（图4）。从孔表中，选择包含未知样品重复的孔，检查熔体曲线的颜色，并通过逐个选择包含阳性对照的孔，按顺序将它们与对照对齐。对所有未知样本重复该过程。
    注:如果其中一个对照的熔化曲线与其紧密对齐，则未知样品包含其变体。可以显示不同的变体组（不同的颜色），表明未知样本由未知变体组成，与对照不对应（图8）。患者样本中可能存在低水平的体细胞遗传变异。这可能会影响HRM结果的解释，特别是在测定的检测限下（图9）。在这些情况下，线条的颜色甚至形状可能与野生型基因型的颜色非常相似。
    1. 当结果不确定时，将HRM结果与琼脂糖凝胶电泳和测序方法的结果相结合。重新测试样品或请求，并在需要时重新测试新样品。
    2. 仔细检查数据集中的仿行曲线，并检查组中每个仿行的对齐是否紧密。如果重复与组中的其他样本（异常值）不紧密对齐，则将其排除。如果存在更多异常值并且结果不确定，请重新测试样本。请注意，DNA样本的数量和质量会影响HRM结果。
22. 在 "差值 "图选项卡中分析未知样本的结果。重复步骤1.21中描述的过程，并验证为未知样品获得的结果是否相同。
23. 然后，在琼脂糖凝胶上运行qPCR HRM产物。
    注意:协议可以在此处暂停。将板在4°C下储存不超过24小时，或在-20°C下储存更长的时间但不超过7天。让储存在4°C的板温升至室温，然后在运行之前短暂旋转板。让储存在-20°C的板解冻并加热到室温，然后在运行之前短暂旋转板。

2. 琼脂糖凝胶电泳

1. 使用适当的凝胶电泳系统在含有荧光核酸染色的4%琼脂糖预浇注凝胶上运行qPCR HRM产物（见 材料表， 图5）。仅运行一个阳性、阴性、NTC 和样品 qPCR HRM 重复。
   注意:处理凝胶时应始终佩戴手套。如果选择等效的琼脂糖百分比，荧光核酸染色和孔格式，任何其他凝胶电泳系统都可以实现这一目的。
2. 根据制造商的协议运行凝胶电泳系统（见 材料表）。从包装中取出盒中的预制凝胶，取出梳子并按照制造商的说明将其插入设备（见 材料表）。
   注意:在打开包装后15分钟内加载凝胶。
3. 用无菌，RNase和DNase游离的H 2 O将10μL样品稀释至20μL，用20μL稀释的样品加载每个孔。
4. 将3μLDNA大小标准溶液稀释至20μL，不含无菌，RNase和DNase的H₂O（见材料表）。用20μL稀释的DNA大小标准溶液加载M孔（图6）。
5. 用20μL无菌，RNase和DNase游离H₂O填充任何空孔。
6. 立即根据正在电泳的凝胶百分比选择程序，并将设备上的电泳时间设置为10分钟。
7. 通过按下 GO 按钮在加载样品后1分钟内开始电泳。如果获得不充分的分辨率，电泳时间可以延长。
   注:根据制造商的说明，不要超过建议的最长琼脂糖电泳运行时间。
8. 电泳完成后，使用蓝光或紫外线透射可视化凝胶中的DNA。可视化，分析和存储电泳图像主要由带有照片记录系统的凝胶成像仪完成（图5）。
9. 通过将未知样品的结果与阳性对照的结果进行比较来分析和解释可视化的qPCR HRM产物凝胶图谱（图7和图8）。
10. 如果未知样品HRM和凝胶电泳结果表明存在未知的遗传变异，则使用材料表中描述的引物根据所述方案对qPCR HRM产物进行测序^13。
    注意:含有荧光核酸染色剂的琼脂糖凝胶必须根据机构法规进行适当处理。

结果

成功扩增的DNA感兴趣区域，荧光指数增加，超过周期15和35之间的阈值，并且所有重复样品和对照的定量周期（Cq）值非常窄（图2）是通过HRM分析可靠地鉴定遗传变异的先决条件。这是通过在qPCR HRM实验中使用荧光染色和等量DNA精确测定DNA来实现的（参见步骤1.2）。 图2 显示了目标DNA区域的成功扩增，其中所有样品和对照的Cq值都处于非常窄的间隔内。NTC孔中没有扩增。

HRM阶段在qPCR之后立即使用步骤1.11中描述的协议执行。样品，对照和NTC的活性熔体区域（图3，标签（c））用于创建其对齐的熔体曲线图（图4）。因此，正确设置的熔化前和熔后区域/温度线（图3A）对于正确可视化和鉴定样品中的遗传变异非常重要。图4A和...

讨论

DNA的高分辨率熔化是基因分型和遗传变异扫描的简单解决方案^14。它取决于导致异质双面体改变熔化曲线形状的序列差异。在特定癌症患者群体^{1、2、15、16、10}的基因特异性中可以观察到不同频率的不同类型的遗传变异。目的基因中的缺失或插入可以通过HRM分析来检测，如图4A所示。在将qPCR HRM测定应用于常规测试时，我们进行了初步评估研究，包括21名JAK2 V617F阴性ET患者，中位年龄为63岁（范围从24岁到90岁）。在21名JAK2 V617F阴性ET患者中，有12名检测到CALR基因的遗传变异（比例0.57）。在 21 例患者中有 9 例（比例 0.43）检测到 52 bp 缺失（1 ...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
E-Gel EX 4% 琼脂糖	Invitrogen、Thermo Fischer Scientific	G401004
Fuorometer 3.0 QUBIT	Invitrogen、Thermo Fischer Scientific	Q33216
Invitrogen E-Gel iBase 和 E-Gel Safe 成像仪组合试剂盒	Invitrogen、Thermo Fischer Scientific	G6465EU
MeltDoctor HRM MasterMix 2X	Applied Biosystem、Thermo Fischer Scientific	4415440	组分：AmpliTaqGold 360 DNA 聚合酶、MeltDoctor 贸易 HRM 染料、dNTP 混合物（包括 dUTP）、镁盐和其他缓冲液组分，经过精确配制以获得最佳 HRM 结果
MicroAmp Fast 96 孔反应板 （0.1 mL）	Applied Biosystems、Thermo Fischer Scientific	4346907
MicroAmp 光学胶膜	Applied Biosystems、Thermo Fischer Scientific	4311971
NuGenius	Syngene	NG-1045	凝胶记录系统
引物 CALRex9 正向	Eurofins 基因组学		序列：5'GGCAAGGCCCTGAGGTGT'3 （高纯度，无盐）
引物 CALRex9 反向	Eurofins 基因组学		序列：5'GGCCTCAGTCCAGCCCTG'3 （高纯度，无盐）
QIAamp DNA 小量试剂盒	QIAGEN	51306	DNA 分离试剂盒，含 DNA 稀释缓冲液。
Qubit 检测管	Invitrogen、Thermo Fischer Scientific	Q32856
QUBIT dsDNA HS 检测	Invitrogen、Thermo Fischer Scientific	Q32854
Trackit 100bp DNA 分子量标准	Invitrogen、Thermo Fischer Scientific	10488058	分子量标准由 13 个单独的片段组成，参比条带分别为 2000、1500 和 600 bp。
ViiA7 实时荧光定量 PCR 系统、	Applied Biosystems、Thermo Fischer Scientific	4453534
无核酸酶	VWR、生命科学	436912C	RNase、DNase 和蛋白酶无水