使用高分辨率熔解分析检测 CALR 基因中的遗传变异

摘要

高分辨率熔解分析（HRM）是一种灵敏且快速的遗传变异检测方法。该方法依赖于序列差异所导致的异源双链体，从而改变熔解曲线的形状。通过结合HRM与琼脂糖凝胶电泳，可识别包括插入缺失（indels）在内的多种类型的遗传变异。

摘要

高分辨率熔解分析（HRM）是一种用于基因分型和遗传变异扫描的强有力方法。大多数HRM应用依赖于饱和染料检测DNA序列差异，以及通过异源双链改变熔解曲线的形状。为了识别能够指示变异或基因型的微小熔解曲线差异，需要优异的仪器分辨率和专门的数据分析软件。在特定疾病（尤其是癌症）患者以及费城染色体阴性骨髓增殖性肿瘤患者中与CALR基因相关的基因内，可观察到多种类型且频率各异的遗传变异。目标基因中的单核苷酸变化、插入和/或缺失（indels）均可通过HRM分析检测出来。不同类型遗传变异的鉴定主要依赖于qPCR HRM检测中所使用对照。然而，随着扩增子长度的增加，野生型与杂合子曲线之间的差异会变小，遗传变异类型的判断也变得更加困难。因此，当目标基因中预期主要的遗传变异为插入/缺失时，可采用琼脂糖凝胶电泳等附加方法来明确HRM结果。在某些情况下，不确定的结果必须通过标准的Sanger测序重新验证或再诊断。在本项回顾性研究中，我们将该方法应用于MPN且JAK2 V617F阴性的患者。

引言

2013年，在患有骨髓增殖性肿瘤（MPN）（如原发性血小板增多症和原发性骨髓纤维化）的患者中发现了钙网蛋白基因（CALR）的体细胞遗传变异^1,2。自那时起，已发现超过50种CALR基因的遗传变异，这些变异均引起+1（−1+2）移码突变³。其中最常见的两种CALR遗传变异分别为52 bp缺失（NM_004343.3 (CALR):c.1099_1150del52, p.(Leu367Thrfs*46)），也称为1型突变，以及5 bp插入（NM_004343.3 (CALR):c.1154_1155insTTGTC, p.(Lys385Asnfs*47)），也称为2型突变。这两种遗传变异占所有CALR遗传变异的80%。其余变异则根据其是否保留靠近野生型CALR的α螺旋结构，通过算法被归类为类1型或类2型⁴。本文介绍一种高灵敏度且快速检测CALR遗传变异的方法——高分辨率熔解分析法（HRM）。该方法可快速检测占CALR突变大多数的1型和2型遗传变异⁵。HRM于1997年与实时定量聚合酶链式反应（qPCR）结合首次被提出，用于检测V因子Leiden突变⁶。与作为金标准的Sanger测序相比，HRM具有更高的灵敏度但特异性较低⁵。HRM是一种良好的筛查方法，能够以较高的成本效益快速分析大量样本⁵。该方法是一种简单的PCR技术，在荧光染料存在下进行，无需特殊操作技能。另一优势在于该检测过程本身不会破坏所分析的样本，因此在完成HRM检测后，样本仍可用于后续的电泳或Sanger测序⁷。其唯一缺点是结果有时难以解读。此外，HRM无法检测非1型或2型突变患者中的确切突变类型⁸。对于此类患者，应进一步进行Sanger测序（图1）。

高分辨率熔解曲线分析（HRM）基于在饱和DNA荧光染料存在下扩增特定DNA区域，该染料可嵌入双链DNA（dsDNA）中。当染料嵌入dsDNA后会发出荧光。随着温度逐步升高，dsDNA解链为单链DNA，这一过程可在熔解曲线上表现为荧光强度的突然下降。熔解曲线的形状取决于所用的DNA序列，可用于检测突变。将待测样本的熔解曲线与已知突变或野生型CALR的熔解曲线进行比较。不同的熔解曲线代表不同于1型或2型的其他突变⁹。

通过高分辨率熔解曲线分析（HRM）、琼脂糖凝胶电泳和测序方法检测CALR基因体细胞遗传变异的算法（图1）已在先前发表的回顾性研究中被采用并验证¹⁰。

方案

该研究已获得斯洛文尼亚共和国医学伦理委员会的批准。所有程序均符合赫尔辛基宣言的规定。

1. 基于荧光的定量实时 PCR（qPCR）及高分辨率熔解曲线（HRM）后续分析

1. 使用无菌、无 RNase 和无 DNase 的 H₂O 将 材料表 中列出的引物重悬至 100 µM（参见 材料表）。配制浓度为 10 µM 的工作引物溶液。本实验方案中使用的引物此前已有报道²。
2. 按照制造商说明书¹¹采用荧光染色法对粒细胞 DNA 进行定量（参见 材料表）。使用 10 mM Tris-Cl、0.5 mM EDTA、pH 9.0 的溶液配制浓度为 20 ng/µL 的 DNA 溶液（参见 材料表）。
   1. 除 DNA 样本外，至少准备三种 DNA 对照：两种阳性对照，分别含有 NM_004343.3 (CALR): c.1099_1150del52, p.(Leu367Thrfs*46)（52 bp 缺失，即 1 型突变）和 NM_004343.3 (CALR): c.1154_1155insTTGTC, p.(Lys385Asnfs*47)（5 bp 插入，即 2 型突变）的遗传变异，以及野生型 DNA 和非模板（NTC）阴性对照。
      注意：在进行高分辨率熔解（HRM）设置之前，需确认 qPCR 仪器已针对 HRM 实验完成校准。
3. 根据制造商说明书（参见 材料表）配制 qPCR HRM 主混合液：10 µL 的 2× qPCR 主混合液（含染料），0.2 µL 的 10 µM 正向引物，0.2 µL 的 10 µM 反向引物，8.6 µL 无菌、无 RNase 和无 DNase 的 H₂O。使用 材料表 中提供的引物。每个 DNA 样本和对照均需设置三个重复。
   1. 根据待处理样本数量配制 qPCR HRM 主混合液。计算时应额外增加至少 10% 的体积，以补偿试剂转移过程中的损耗。
4. 通过轻轻敲击和倒置离心管并涡旋 2–3 秒混合反应体系。短暂离心以使管壁上的液滴全部收集至管底。
5. 准备适用于仪器和 HRM 实验的反应板（参见 材料表）。将 19 µL qPCR HRM 主混合液转移至 96 孔光学反应板的相应孔中。
6. 用移液器将 1 µL 阴性对照、阳性对照和样本加入光学反应板的相应孔中。对于 NTC，使用配制 qPCR HRM 主混合液时所用的无菌、无 RNase 和无 DNase 的 H₂O 1 µL 代替 DNA。
7. 用光学粘性封膜密封反应板，确保密封牢固，防止运行过程中蒸发。检查光学粘性封膜是否平整覆盖反应板所有孔，以确保荧光信号正确检测。
8. 在室温（RT）下以 780 × g 离心 1 分钟。检查液体是否全部位于反应板孔的底部。随后开始运行实验。
   注意：此处可暂停实验流程。将反应板在 4 °C 保存，时间不超过 24 小时。运行前需将保存于 4 °C 的反应板恢复至室温，并短暂离心。
9. 根据制造商说明书在 qPCR 仪器中设置并启动运行程序，以扩增和熔解 DNA，并生成 HRM 荧光数据。在仪器系统软件中，将对照和样本分配至相应孔位。
10. 对于 CALR 遗传变异检测，修改仪器默认的扩增程序，采用以下热循环程序进行 DNA 扩增：95 °C 预变性 10 分钟，随后进行 50 个循环（95 °C 变性 10 秒，62.5 °C 退火 60 秒）。
11. qPCR 结束后立即按照制造商说明书¹²进行熔解曲线/解离（HRM）阶段：95 °C 保持 10 秒，60 °C 保持 1 分钟，然后以 0.025 °C/s 的升温速率升至 95 °C。在 95 °C 保持 15 秒，在 60 °C 保持 15 秒。
12. 运行自动结束。首先查看并验证扩增曲线图（图 2）。
13. 在仪器系统软件的实验菜单中选择“扩增曲线”选项。若未显示数据，点击绿色的 分析 按钮。
    1. 在扩增曲线标签页中，从“曲线类型”下拉菜单中选择以循环数为横坐标、以归一化荧光信号（ΔRn）为纵坐标的原始荧光读数曲线（ΔRn vs Cycle）。在“曲线颜色”下拉菜单中选择 样本。
14. 从“图形类型”下拉菜单中选择线性扩增图。通过选择“基线起始”选项，在线性扩增图上显示基线起始和终止循环数。验证基线设置是否正确。终止循环数应设置在显著荧光信号出现前几个循环处。基线通常设置在第 3 至第 15 个循环之间（图 2）。
15. 从“图形类型”下拉菜单中选择 log10 扩增图。通过选择“阈值”选项在图上显示阈值线。若阈值设置不正确，需进行相应调整。正确设置的阈值线应穿过 qPCR 曲线的指数扩增阶段（图 2）。
16. 验证所有样本孔和阳性对照孔中均出现正常的扩增曲线。验证 NTC 孔在第 40 个循环前无扩增信号。正常的扩增曲线表现为荧光信号呈指数增长，并在第 15 至第 35 个循环之间超过阈值（图 2）。若某孔无扩增信号，则将其从分析中排除。
    注意：若扩增曲线异常或 NTC 孔出现扩增信号，应根据制造商提供的故障排除指南识别并解决问题。
17. 在仪器系统软件中排除定量循环（Cq）值与重复样本相差超过 2 的离群值¹²。离群值可能导致 HRM 结果错误。
18. 在导数熔解曲线中，检查熔解前和熔解后的区域/温度线。熔解前后区域应位于平坦区域，即荧光水平无明显峰或斜率变化的区域（图 3）。如有需要，进行相应调整。将熔解前后温度线的起始和终止点设置为彼此相差约 0.5 °C（图 3）。若参数已调整，点击 分析 按钮重新开始分析。
19. 在差异图标签页的“图形设置”标签页中，选择一个野生型对照（纯合子）的重复作为参考 DNA，并点击 分析 按钮重新开始分析。
20. 在归一化熔解曲线标签页中，确认所有阳性对照均具有正确的基因型，且 NTC 未扩增（图 4）。从孔板表格中选择含有阳性对照的孔，以在分析图中高亮显示相应的熔解曲线。确认曲线颜色与正确基因型对应。对其他阳性对照和 NTC 孔重复此步骤。
21. 在归一化熔解曲线标签页中，仔细查看未知样本的曲线图，并与对照的曲线图进行比较（图 4）。从孔板表格中选择含有未知样本重复的孔，检查熔解曲线颜色，并通过逐一选择含有阳性对照的孔，将未知样本曲线按顺序与对照对齐。对所有未知样本重复此过程。
    注意：若未知样本的熔解曲线与某一对照高度一致，则表明其含有该对照的变异类型。若出现不同颜色的变异组，可能提示未知样本含有与对照不匹配的新变异（图 8）。患者样本中可能存在低水平的体细胞遗传变异，这可能影响 HRM 结果的判读，尤其是在检测限附近（图 9）。在此类情况下，曲线的颜色甚至形状可能与野生型基因型非常相似。
    1. 当结果不明确时，应结合琼脂糖凝胶电泳和测序方法的结果进行综合判断。必要时可重新检测样本，或要求重新采集并检测新样本。
    2. 仔细检查重复曲线的数据集，确认组内各重复曲线是否高度一致。若某重复曲线未与其他样本紧密对齐（离群值），应将其排除。若存在多个离群值且结果不明确，应重新检测样本。需注意，DNA 样本的数量和质量会影响 HRM 结果。
22. 在 差异图 标签页中分析未知样本的结果。重复步骤 1.21 所述操作，并验证未知样本的分析结果一致。
23. 随后，将 qPCR HRM 产物在琼脂糖凝胶上进行电泳。
    注意：此处可暂停实验流程。将反应板在 4 °C 保存不超过 24 小时，或在 -20 °C 保存更长时间但不超过 7 天。运行前需将保存于 4 °C 的反应板恢复至室温并短暂离心；将保存于 -20 °C 的反应板解冻并恢复至室温后，再短暂离心。

2. 琼脂糖凝胶电泳

1. 使用适当的凝胶电泳系统，在含有荧光核酸染料的4%琼脂糖预制凝胶上运行qPCR HRM产物（参见材料表和图5）。每种阳性对照、阴性对照、NTC及样本的qPCR HRM重复反应仅运行一个。
   注意：操作凝胶时应始终佩戴手套。若选择相同琼脂糖浓度、荧光核酸染料和加样孔格式，其他任何凝胶电泳系统也可用于此目的。
2. 根据制造商的说明书运行凝胶电泳系统（参见材料表）。从包装中取出带有凝胶的卡盒，移除梳子，并按照制造商的说明将其插入电泳装置中（参见材料表）。
   注意：打开包装后应在15分钟内完成加样。
3. 将10 μL样品用无菌、无RNase和无DNase的H₂O稀释至20 μL。每个加样孔加入20 μL稀释后的样品。
4. 将3 μL DNA大小标准品溶液用无菌、无RNase和无DNase的H₂O稀释至20 μL（参见材料表）。在M孔中加入20 µL稀释后的DNA大小标准品溶液（图6）。
5. 用20 μL无菌、无RNase和无DNase的H₂O填充所有空的加样孔。
6. 立即根据所用凝胶的百分比选择相应的程序，并将电泳时间设置为10分钟。
7. 加样后1分钟内按下GO按钮启动电泳。如果分辨率不足，可适当延长电泳时间。
   注意：不得超出制造商推荐的最大琼脂糖凝胶电泳运行时间。
8. 电泳完成后，使用蓝光或紫外透射仪观察凝胶中的DNA。凝胶图像的观察、分析和保存通常由配备图像记录系统的凝胶成像仪完成（图5）。
9. 通过将未知样本的结果与阳性对照进行比较，分析并解读可视化后的qPCR HRM产物凝胶图谱（图7和图8）。
10. 如果未知样本的HRM和凝胶电泳结果表明存在未知遗传变异，则根据文献¹³所述方案，使用材料表中描述的引物对qPCR HRM产物进行测序。
    警告：含荧光核酸染料的琼脂糖凝胶必须按照机构规定妥善处理。

结果

在所有重复样本和对照中，目标DNA区域成功扩增，荧光信号呈指数增长，并在第15至35个循环之间超过阈值，且定量循环值（Cq）范围非常狭窄（图2），这是通过HRM分析可靠鉴定基因变异的前提条件。为实现此目标，需通过荧光染料精确定量DNA，并在qPCR HRM实验中使用等量的DNA（见步骤1.2）。图2显示了目标DNA区域的成功扩增，所有样本和对照的Cq值均处于非常狭窄的区间内。NTC孔中未出现扩增信号。

高分辨率熔解（HRM）阶段在qPCR完成后立即进行，所用方案如步骤1.11所述。利用样本、对照和无模板对照（NTC）的活性熔解区域（图3，标签(c)），生成其比对后的熔解曲线图（图4）。因此，正确设置熔解前和熔解后的区域/温度线（图3A）对于准确可视化并识别样本中的遗传变异至关重要。

讨论

DNA 高分辨率熔解是一种用于基因分型和遗传变异扫描的简单解决方案¹⁴。该方法依赖于序列差异所形成的异源双链体，从而改变熔解曲线的形状。在特定癌症患者群体的相关基因中，可观察到多种类型且频率各异的遗传变异^1,2,15,16,10。正如我们在图4A中所示，HRM 分析可检测目的基因中的缺失或插入突变。在将 qPCR HRM 检测方法应用于常规检测时，我们开展了一项初步评估研究，共纳入 21 例 JAK2 V617F 阴性的原发性血小板增多症（ET）患者，中位年龄为 63 岁（年龄范围为 24 至 90 岁）。在 21 例 JAK2 V617F 阴性 ET 患者中，有 12 例（比例为 0.57）检测到 ...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
E-Gel EX 4% 琼脂糖	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	G401004
QUBIT 3.0 氟光计	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	Q33216
Invitrogen E-Gel iBase 与 E-Gel Safe Imager 组合试剂盒	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	G6465EU
MeltDoctor HRM MasterMix 2X	Applied Biosystem, Thermo Fischer Scientific	4415440	组分：AmpliTaqGold 360 DNA 聚合酶、MeltDoctor 商标 HRM 染料、包含 dUTP 的 dNTP 混合物、镁盐及其他缓冲液组分，精确配制以获得最佳 HRM 结果
MicroAmp 快速 96 孔反应板（0.1 mL）	Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific	4346907
MicroAmp 光学粘性封膜	Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific	4311971
NuGenius	Syngene	NG-1045	凝胶成像系统
引物 CALRex9 正向	Eurofins Genomics		序列：5'GGCAAGGCCCTGAGGTGT'3（高纯度，无盐）
引物 CALRex9 反向	Eurofins Genomics		序列：5'GGCCTCAGTCCAGCCCTG'3（高纯度，无盐）
QIAamp DNA Mini 试剂盒	QIAGEN	51306	用于 DNA 提取的试剂盒，包含 DNA 稀释用缓冲液。
Qubit 检测管	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	Q32856
QUBIT dsDNA HS 检测试剂	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	Q32854
Trackit 100bp DNA Ladder	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	10488058	该 DNA Ladder 包含 13 个独立片段，参考条带位于 2000、1500 和 600 bp。
ViiA7 实时荧光定量 PCR 系统	Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific	4453534
无核酸酶水	VWR, Life Science	436912C	无 RNase、DNase 和蛋白酶的水