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方法文章

一个 体外 单分子成像分析帽依赖性翻译动力学实验方法

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DOI：

10.3791/61648

⸱

2020年9月15日

 ,  , 
1Molecular Biology Program, Memorial Sloan Kettering Cancer Center

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

追踪单个翻译事件可实现对帽依赖性翻译机制的高分辨率动力学研究。本文中我们展示了一种 体外 基于荧光标记抗体与表位标记新生肽段之间相互作用成像的单分子检测方法。该方法可实现对活性翻译过程中起始及肽链延伸动力学的单分子表征 体外 帽依赖性翻译

摘要

帽依赖性蛋白质合成是真核细胞中主要的翻译途径。尽管已有多种生物化学与遗传学方法被用于深入研究帽依赖性翻译及其调控机制，但对该翻译途径的高分辨率动力学表征仍然缺乏。最近，我们开发了一种体外（in vitro）检测方法，可实现以单分子分辨率测量帽依赖性翻译动力学。该检测基于荧光标记抗体与新生表位标签多肽的结合。通过成像抗体与新生肽–核糖体–mRNA复合物的结合与解离过程，可追踪单个mRNA上的翻译进程。本文中，我们提供建立该检测方法的详细方案，包括mRNA与聚乙二醇化载玻片的制备、翻译的实时成像以及单分子轨迹的分析。该方法能够追踪单个帽依赖性翻译事件，并解析关键的翻译动力学参数，如起始速率与延伸速率。该检测方法可广泛应用于不同的翻译系统，将为帽依赖性翻译动力学及翻译调控机制的体外（in vitro）研究提供广泛支持。

引言

真核系统中的翻译主要通过7-甲基鸟苷（m7G）帽依赖性途径1研究表明，真核生物翻译的起始步骤是限速步骤，也是调控的常见靶点2,3,4. 基于帽结构的翻译机制已通过遗传学方法被广泛研究5，生化6,7,8，结构的9，以及基因组学10 整体方法。尽管这些方法已鉴定出多种调控帽依赖性起始的机制，但由于分辨率的限制，它们只能对异质且不同步的起始事件产生的信号进行集合平均。最近，单个 体内 通过检测荧光抗体与新生多肽上表位的结合，可对翻译事件进行可视化观察11,12,13,14然而，这些新方法在解析单个起始事件方面也存在局限性，因为必须有多个荧光标记的抗体结合到新生肽链上，才能从较高的细胞内荧光背景中分辨出单个翻译事件。在许多生物学相互作用中，解析单个动力学事件为理解复杂的多步骤且重复的生物学过程提供了关键见解，而这些过程在分子水平上难以实现同步。为了更深入地理解帽依赖性起始及其调控机制，亟需能够追踪单个翻译事件动态变化的新方法。

我们最近开发了一种 体外 一种以单分子分辨率测量帽依赖性起始动力学的检测方法15考虑到该起始途径中涉及的大量已知和未知蛋白质因子3,16单分子检测技术被开发为可与现有技术兼容 体外 无细胞翻译系统，可保留细胞因子并维持高效的翻译活性17,18,19,20,21,22,23,24,25此外，无细胞翻译系统的使用使得单分子观测结果与以往的群体实验结果之间能够进行更为兼容的比较。该方法可将新的单分子动力学信息直接整合到现有的帽依赖性起始机制框架中。为建立单分子检测体系，对传统的无细胞翻译系统进行了三方面的改造：在报告mRNA开放阅读框（ORF）的起始位置插入一段编码表位的序列；对报告mRNA的3′端进行生物素标记，以实现mRNA末端与单分子检测表面的固定；并在翻译提取物中添加荧光标记的抗体。这些改造仅需常规的分子生物学技术及普遍可得的试剂即可完成。此外，这些修饰以及单分子成像条件均能保持群体无细胞翻译反应的翻译动力学特性15.

在此实验中（图1），5′端加帽且3′端生物素标记的报告mRNA被固定于流式室内的链霉亲和素包被检测表面。随后将流式室填充含有荧光标记抗体的无细胞翻译混合物。当mRNA翻译进行至表位序列下游约30–40个密码子时26,27，表位从核糖体出口通道暴露出来，可与荧光标记的抗体发生相互作用。该相互作用迅速，通过单分子荧光成像技术可检测到这一过程，从而在无细胞翻译活跃进行时以单分子分辨率追踪翻译动力学。该检测方法应具有广泛的应用价值 体外 帽依赖性翻译动力学及其调控机制的研究，特别是针对具有功能性整体组分的系统 体外 检测

建立该单分子检测方法的前提是具备一个可正常工作的无细胞体外翻译体系，该体系可使用 commercially available 的翻译提取物，或按照先前描述的方法制备的提取物来实现。28真核生物翻译提取物可从多种细胞中获得，包括真菌、哺乳动物和植物细胞28成像需要配备可调激光强度和入射角的全内反射荧光显微镜（TIRF）、电动样品台、自动化流体系统以及样品温度控制装置。此类要求在现代 体外 单分子TIRF实验可采用不同方式实现。本文所述实验使用一种基于物镜的TIRF系统，该系统由 commercially available 显微镜、软件及附件组成，具体清单见下文 材料表.

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方案

1. 报告基因mRNA的制备

  1. 通过在编码“无标签”报告mRNA的DNA转录模板中插入一个编码N端表位标签的序列，对该模板进行改造，以生成编码“带标签”报告mRNA的DNA转录模板（图2A).
    注意：由于3xFLAG/抗FLAG相互作用具有更高的灵敏度且3xFLAG标签较短，建议本实验采用该组合。然而，本实验也可兼容其他表位/抗体组合。
  2. 使用线性化DNA模板和标记与非标记RNA的合成 体外 转录试剂盒（参见 材料表）。通常使用 10–20 pmol 的 体外 转录的RNA足以进行后续的RNA加工，从而实现系统的单分子研究。
  3. 对RNA的5′端进行加帽（图2B）与一个 m7G加帽试剂盒（参见 材料表按照制造商的建议进行。
  4. 生物素标记RNA 3′末端（图2B) 使用生物素标记试剂盒（参见 材料表按照试剂盒说明书进行操作。采用苯酚-氯仿抽提法纯化RNA，随后使用离心柱进一步纯化。用10–20 μL无RNase的水洗脱RNA。未加帽的输入RNA回收率约为40–50%。
  5. 通过变性丙烯酰胺凝胶电泳及RNA染色评估RNA的完整性与浓度，方法如前所述29.
  6. 进行大规模无细胞翻译30 使用3′端生物素标记的报告mRNA，以确认修饰后的mRNA保留了感兴趣的翻译特性。例如，可通过在无帽和有帽报告mRNA的全细胞无细胞翻译反应中测量并比较报告基因活性来验证帽依赖性翻译（参见 代表性结果).

2. 流动腔室的制备

  1. 根据显微镜物镜规格说明书选择合适的盖玻片厚度。对于物镜型或棱镜型全内反射荧光（TIRF）成像系统，选择玻璃或石英载玻片31分别。
  2. 进行盖玻片和载玻片的清洗、硅烷化、聚乙二醇化（PEGylation）及腔室组装 参照 Chandradoss 等人所述的实验方案32 并作如下修改。
    1. 将带有钻孔的载玻片在10%碱性液体洗涤剂（v/v）中清洗20分钟，并辅以超声处理。从后续所有清洗步骤开始，将载玻片与盖玻片合并处理。
    2. 省略丙酮清洗步骤。将Piranha蚀刻孵育时间从20分钟延长至1小时。第一轮PEG化孵育3小时。第二轮PEG化使用MS(PEG)进行孵育。4 3小时。

3. 仪器设备准备

  1. 在进行单分子实验前至少3小时，打开显微镜培养箱并将气流调至低速，以避免对实验造成过度的声学干扰。将培养箱温度设定为无细胞翻译系统的最佳工作温度。
    注意：翻译过程对温度极为敏感。每种细胞提取物系统均有其特定的最佳反应温度。反应温度的表征是构建整体无细胞翻译系统的关键步骤。本单分子检测应在与相应整体翻译条件相同且最优的温度下进行。
  2. 在进行单分子实验前至少1小时，按下激光器箱后方的激光电源按钮开启激光，转动激光安全钥匙，并按下启动按钮；开启显微镜，轻触触摸屏控制面板，选择成像模式、物镜和滤光片组。
  3. 通过按下电源按钮，依次开启EMCCD相机、Prior载物台控制器和注射泵。开启计算机，并运行软件 Andor Solis（软件1）以控制EMCCD相机，TirfCtrl（软件2）以控制激光器，PriorTest（软件3）以控制电动载物台，以及Coolterm以控制注射泵。在开始数据采集前，确保相机已冷却并稳定至其指定的工作温度。
  4. 在软件2中，确认已为激光波长、物镜类型以及玻璃和样品的折射率设置正确的参数。点击连接按钮。为设定激光强度，点击激光波长旁边的控制按钮，然后在弹出的激光控制窗口中拖动强度滑块。通过拖动光纤位置滑块或输入相应的穿透深度，将激光设定至所需角度。确保勾选快门框，以便在不进行成像时使激光保持在关闭模式。
    注意：通过勾选或取消勾选快门框来打开或关闭激光快门。在初次建立检测体系时，应测试不同的激光强度和入射角度，以实现最佳的单分子检测效果。最佳激光强度需在获得明亮的单分子荧光信号与避免荧光染料快速漂白之间取得平衡。应将入射角度调至超过临界角，以降低来自扩散标记抗体的高荧光背景，直至能清晰分辨与mRNA结合的抗体。作为参考，在一项研究中15，使用标记比率为每抗体2–7个染料的Cy3标记抗FLAG抗体时，将532 nm激光在物镜处设定为10 μW，激光入射角设定为71.5°。
  5. 在软件1中，在采集模式下选择动力学模式，输入曝光时间、动力学序列长度和EM增益值等参数。选择保存路径并为数据图像文件命名。
  6. 将注射泵设定为中等至较快的流速，用于后续的管路清洗步骤。
    用移液器吸取一份70%乙醇至微量离心管中，将注射泵管路末端插入乙醇溶液，使用Coolterm在“吸取”和“推出”模式之间切换三次，以清洗管路。随后用无RNase水重复该步骤。
    注意：管路长度必须足够长，以确保在第5步中加入的翻译混合物仅接触管路，而不接触注射器活塞。此处的冲洗体积应大于第5步中推出的翻译混合物体积，以确保第5步中的翻译混合物始终与已消毒的管路接触。
  7. 完成最后一次水冲洗并推出液体后，用干净的纸巾轻拭管路末端，去除管路内部残留的水分。将管路末端置于干净的微量离心管中，保持其干燥状态。

4. 3′端生物素标记mRNA的固定

  1. 在使用前，将细胞提取物和翻译反应混合液保持在干冰上冷冻。其余冷冻试剂解冻后置于冰上保存。
  2. 将流动室放入显微镜样品架中，盖玻片一侧朝下，并用胶带固定。对于未使用的流道入口和出口，使用胶带覆盖密封。
  3. 向流道中加入相对于流道体积1.5倍体积的0.2 mg/mL链霉亲和素溶液（此比例同样适用于步骤4和步骤5中的其他操作），室温孵育10分钟。
  4. 为去除未结合的链霉亲和素，每次用3倍流道体积的T50洗涤缓冲液（20 mM Tris HCl，pH 7.0，50 mM NaCl，0.2 U/μL RNase抑制剂）洗涤流道，共洗涤三次。
    注意：必须防止废液倒流回流道中。如果流道出口未连接至废液收集管，请在出口附近放置折叠的纸巾以吸收流出的液体。
  5. 将翻译提取物和混合液从干冰转移至冰上，使其解冻。
  6. 在物镜上滴加一滴浸油。将装有流动室的显微镜样品架放入显微镜载物台。调节物镜接近盖玻片，直至物镜上的浸油与盖玻片接触。移动样品台，使流道位置正对物镜镜头下方。
  7. 在软件2中打开激光快门，并调节激光强度。
  8. 在显微镜控制触摸屏上，选择 Focus 选项卡，点击 Focus Search 和 Start 按钮。当成功找到焦平面时会发出蜂鸣声。
  9. 在软件1中以 Live 模式成像流道表面。通过触摸屏上的微调步进控制调节物镜位置，优化焦距以获得更清晰的图像。
  10. 在软件3中移动载物台，评估流道检测表面不同区域的荧光背景水平。若荧光背景较低，可继续实验；若荧光背景过高，则应考虑弃用该流动室。
  11. 在软件2中关闭激光快门。
  12. 用移液器吸出流道中的T50洗涤缓冲液，立即加入2倍体积的生物素化mRNA溶液至流道中，孵育15分钟。
    注意：对于每一批制备的mRNA，应测试mRNA浓度和孵育时间，以达到单分子检测所需的mRNA表面密度。合适的mRNA表面密度可使抗体结合后产生的荧光点重叠率不超过约5%（参见 代表性结果）。作为起始参考，建议使用浓度为2–20 nM的生物素化mRNA。
  13. 每次用3倍体积的翻译兼容缓冲液洗涤流道，共洗涤三次。

5. 用于单分子检测的翻译反应体系配制及向流动通道的递送

  1. 在冰上，按照步骤1.7的批量翻译方案，在微量离心管中配制3倍体积的翻译混合液30，但省略mRNA，并补充优化浓度的荧光标记抗体。短暂离心微量离心管，使翻译混合液沉降至管底。
    注意：在建立检测方法时，需测试不同抗体浓度。最佳浓度应表现为抗体在检测表面的非特异性结合量较低，且对新生肽段的结合速度较快（有关检测校准的详细信息，请参见步骤7.1和7.2）。
  2. 将翻译混合液转移至0.7 mL微量离心管盖内。将注射泵设置为“吸取”模式，将泵管末端插入翻译混合液中，启动注射泵吸取，使翻译混合液进入泵管。随后将注射泵切换至“分配”模式，并将流速调节至适合输送翻译混合液的最佳速率。
    注意：在将翻译混合液转移至泵管过程中，应避免产生气泡。吸取时避免将翻译混合液吸入未在步骤3.6中进行灭菌和冲洗的管段。在建立检测方法时，需测试不同的输送流速以确定最佳流速（有关检测校准的详细信息，请参见步骤6.2）。
  3. 若泵管末端与翻译混合液之间存在间隙，启动注射泵，使翻译混合液流至管端，然后停止注射泵。
  4. 将泵管末端插入流动通道的入口。连接时应避免将气泡引入翻译混合液中。通过将定制的金属支架拧紧在显微镜样品载物板上，以固定连接部位。检查显微镜的焦平面及成像区域的荧光情况。
    注意：可使用先前描述的定制部件将泵管夹紧在流动池上33。其他类型的流体系统也可用于本检测34。连接前后视野应基本一致。若连接后出现更多荧光点，则翻译混合液可能从输送管路泄漏。根据具体应用，泄漏了翻译混合液的通道可能需要弃用。
  5. 确认视频采集参数设置正确，并已输入适当的文件名和保存路径。
  6. 移动载物台，使成像区域位于流动通道检测表面的中心。在显微镜控制触摸屏上，选择连续自动对焦（Continuous AF）选项卡，点击对焦搜索（Focus Search）和开始（Start）按钮，以在实验过程中维持焦平面位置。当成功实现对焦时，会发出蜂鸣声。
  7. 在软件2中打开激光快门。在软件1中点击采集信号（Take Signal）按钮开始记录。记录约5秒后，在Coolterm中输入运行（Run）命令，将翻译混合液送入流动通道。以0.5–2秒/帧的时间分辨率持续记录，最长可达2小时。
    注意：最大数据采集时长取决于翻译提取物随时间推移失去活性的速度，可通过使用荧光素酶报告基因mRNA进行批量无细胞翻译反应，并在不同时间点测定翻译反应中的荧光素酶活性来方便地表征35。
  8. 数据采集完成后，关闭激光，关闭显微镜控制触摸屏上的连续自动对焦（Continuous AF），并拆下流动池上的管路。
  9. 用移液器从流动通道入口吸出翻译混合液，转移至微量离心管中，并将管子浸入液氮中快速冷冻。随后于-80 °C保存。
  10. 用无RNase水冲洗注射泵管路3次，再用70%乙醇冲洗3次。最后将70%乙醇吸入注射泵管路中用于保存。
  11. 关闭显微镜及所有附件设备，清理实验台。

6. 数据分析

注意：本实验的数据显示分析需要采用单分子生物物理研究中的常用方法。所有计算密集型步骤均可使用现有的算法和软件完成（相关步骤下文已提供参考文献）。

  1. 可选：如适用，将获取的图像序列文件转换为与所选图像处理软件或编程语言兼容的格式。
  2. 确定翻译反应的起始点及试剂交换时间。
    注意：由于翻译混合液中存在扩散的荧光抗体，成像区域的背景荧光强度在通道内从翻译兼容缓冲液切换至翻译混合液的过程中会逐渐升高。翻译反应的起始点定义为试剂交换完成的时刻。该完成时刻可通过在递送翻译混合液期间测量背景荧光强度，并识别荧光强度增长趋于平稳的时间点来确定15，如下所述。
    1. 计算每帧图像的总荧光计数，并绘制相应的时间变化曲线。在时间曲线图中识别总荧光信号的突然上升阶段。
      注意：总荧光信号的增加是由于试剂交换过程中荧光标记抗体浓度逐渐升高所致。
    2. 识别总荧光上升阶段的终点，并将此时间点设为翻译反应的起始点（即时间零点）。同时确定总荧光上升阶段的起始和终止时间点，并将两者之间的时间差定义为试剂交换时间。
      注意：试剂交换的总持续时间取决于流动通道的尺寸和所选流速。在试剂交换完成前，部分翻译因子可能已开始与mRNA结合，这可能会降低所测定首轮起始时间的分辨率。因此，建议在建立实验体系时测试不同流速，并选择能够在3–4秒内完成试剂交换的流速，以匹配0.5–2秒/帧的数据采集速度。
  3. 可选：进行视频漂移校正。
    注意：由于显微镜部件及附件可能发生漂移，数据图像中结合抗体的位置可能随时间发生变化。若在视频中可明显观察到漂移现象，则在进一步数据分析前需进行校正。目前已有多种空间漂移校正算法和脚本可供使用36,37,38。
    1. 在每一帧图像中，寻找像素计数的局部最大值，以像素级精度确定每帧中结合抗体的位置。设定像素计数阈值，确保仅选择明显高于背景噪声的信号点。
    2. 计算相邻两帧图像之间各个抗体位置在每个方向上的变化量。
    3. 分别针对每个方向，绘制相邻帧间抗体位置变化的直方图，并对每个直方图进行高斯拟合，将峰中心位置作为相邻帧之间的方向性漂移量。
    4. 为抵消观测到的漂移，将每帧图像沿相反方向移动相应的漂移量。
  4. 构建单分子轨迹。
    注意：已有检测/追踪软件可用于识别亮斑并从图像序列中提取其荧光强度39,40。
    1. 按照步骤6.3.1所述方法确定抗体位置。
      注意：建议进行视觉检查，以确保所选阈值不会导致颗粒过度或不足识别。可通过将识别出的质心位置叠加至各帧图像上，并直观评估其匹配程度来实现（参见代表性结果）。
    2. 整合所有帧中识别出的颗粒，并去除重复的颗粒位置。
    3. 目视检查结合抗体的图像，选择一个正方形区域，该区域包含明显高于背景且代表单个结合抗体的像素。
      注意：点扩散函数（即单分子对应的正方形大小）由光学系统和探测器像素尺寸决定。
    4. 对于每个颗粒位置，通过计算其周围正方形区域内所有像素的总强度，逐帧构建单分子轨迹。轨迹需针对每个位置、每一帧以及整个数据视频进行构建。
  5. 可选：应用非线性前后向滤波器41以降低单分子轨迹中的背景噪声。
  6. 可选：使用现有的步进检测算法42,43,44,45对轨迹进行数字化处理。
    注意：步进检测算法的选择取决于单分子动力学的复杂程度。在最简单的情况下（即仅存在孤立核糖体翻译，无多聚核糖体形成）且信噪比较高时，对荧光计数应用阈值即可充分识别单分子轨迹中抗体结合与解离事件的发生时间。建议对每种实验条件下至少100条轨迹进行目视检查，以确保步进检测策略正确识别了轨迹中的步进事件。
  7. 通过数字化轨迹或对未数字化轨迹应用阈值，确定每条轨迹中首次抗体结合事件的时间（即首次到达时间，t1）。
    注意：可在不同翻译条件下比较首次到达时间分布的中位数。或者，可将首次到达时间分布拟合为偏移的（三参数）对数正态函数，以确定其平均值15 <t1>。由于首次到达时间分布通常呈偏态且具有长尾特征，不应直接对观测到的首次到达时间取算术平均值来计算均值。
  8. 可选：停留时间分析及平均肽链合成速率的计算。
    1. 利用数字化轨迹识别每条轨迹中的单核糖体（单个核糖体）翻译事件，并通过计算相应抗体结合与解离事件之间的时间差，得到单次结合事件的停留时间。
      注意：当多个分子事件在时间上重叠时，用于轨迹数字化的步进检测算法通常可靠性较低。因此，建议在停留时间分析中排除多聚核糖体事件。对于富含多聚核糖体事件而单核糖体事件较少的高活性翻译系统，可使用标记与未标记抗体的混合物，以提高在单分子轨迹中观察到孤立翻译事件的概率。
    2. 将分布拟合为对数正态函数，并利用拟合函数计算平均停留时间。
      注意：由于停留时间分布通常呈偏态且具有长尾特征，不建议通过直接平均观测到的停留时间来计算均值。
    3. 通过从开放阅读框（ORF）密码子总数中减去表位氨基酸长度与35（新生肽链在核糖体出口通道内的平均氨基酸长度）之和，确定在抗体结合停留期间翻译的氨基酸数量。
    4. 为确定平均肽链合成速率，将翻译的氨基酸数量除以平均停留时间。
  9. 可选：计算平均首轮起始时间（<t1_I>）。
    注意：在起始动力学研究中，通常有意保持起始位点序列环境和编码序列等起始与延伸条件一致。因此，步骤6.7中获得的平均首次到达时间<t1>可直接用于计算不同条件下首轮起始动力学的变化。以下校正仅在需要确定首轮起始时间的实际数值时才必要。
    1. 将表位长度与35（新生肽链在核糖体出口通道内的平均氨基酸长度）之和除以平均肽链合成速率（来自步骤6.8.4），计算该N端区域的平均肽链延伸时间（<t1_tag>）。
    2. 由于首次到达时间等于首轮起始时间与t1_tag之和，因此从平均首次到达时间<t1>中减去<t1_tag>，即可得到平均首轮起始时间<t1_I>：<t1_I> = <t1> - <t1_tag>

7. 检测校准

注意：在首次建立该检测方法时，需执行以下校准步骤。

  1. 为检测抗体结合特异性，分别对未带标签和带标签的 mRNA 执行第 4 和第 5 节中的实验步骤（图 2）。在含有相应 mRNA 的通道中，抗体结合水平分别代表抗体对检测表面的非特异性结合程度以及对新生肽段的特异性结合程度。
    注意：建议特异性结合与非特异性结合的比值应 >10，可通过不同的表面钝化策略、较低的抗体浓度或较高的 mRNA 表面密度来提高该比值。
  2. 为测量抗体结合速率，在第 4 步和第 5 步之间增加一个额外步骤。
    1. 在完成第 4 步后，将通道与不含抗体的翻译混合物孵育，以预先生成 mRNA/核糖体/肽段复合物。
    2. 随后进行第 5 步，将含有抗体的翻译混合物注入通道中。
    3. 通过对首次到达时间直方图进行指数拟合，量化抗体对预先生成的新生肽段的平均结合速率。
      注意：抗体对预先生成肽段的结合应迅速，通常在数秒量级，且应快于翻译动力学过程。可使用较高浓度的抗体以提高抗体结合速率。
  3. 荧光标记抗体的光稳定性。
    1. 按照第 2 步的方案制备载玻片，但跳过 PEG 化步骤。在硅烷化处理后组装流动室。硅烷涂层可有效促进抗体非特异性地结合至检测表面。
    2. 将荧光标记的抗体加入通道中，使其在检测表面达到单分子密度的非特异性结合。首先将荧光标记抗体用 T50 洗涤缓冲液高度稀释后加入，随后逐步提高抗体浓度，直至达到所需的单分子密度。
    3. 对检测表面进行成像，直至大多数抗体荧光信号不再可检测。
    4. 绘制随时间变化的可见抗体总数曲线，以评估因荧光染料光漂白导致的抗体荧光信号衰减速率。
      注意：抗体标记通常使每个抗体携带多个荧光分子。单个抗体在所有连接的荧光染料均发生光漂白之前仍可被检测到。

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结果

按照所述方案，可在3'端固定化的报告mRNA进行活跃的无细胞翻译过程中，以单分子分辨率对单个抗体与新生N端标记多肽的相互作用进行成像（图1）。本研究使用三种合成mRNA进行了一项最小化的示范实验：LUC（编码无标签的荧光素酶）、LUCFLAG（编码3xFLAG标签荧光素酶）以及hp-LUCFLAG（在5'前导区含有稳定茎环结构的LUCFLAG）（图2C）。使用编码荧光素酶的mRNA可实现单分子观测结果与整体发光测量数据之间的比较。通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和RNA染色评估3'端生物素化mRNA的完整性。高质量的mRNA应呈现单一清晰条带，不应出现额外的快速迁移信号（图3A）。本实验采用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae...

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讨论

与典型的相比 体外 TIRF单分子实验，此处所述检测方法因使用细胞提取物和高浓度荧光标记抗体而更加复杂。与通常仅进行一轮表面聚乙二醇化（PEGylation）的做法相比，第二轮PEGylation（步骤2）可显著降低抗体对检测表面的非特异性结合15荧光抗体的高浓度扩散会导致极强的荧光背景，从而掩盖抗体结合的单分子检测信号。为降低该荧光背景，需将激光入射角调至远高于临界角（步骤3.4）。抗体检测还可能因荧光染料的过度不稳定而受限，这会限制对结合停留时间的定量分析能力。当遇到此问题时，应将荧光染料替换为光稳定性更高的荧光染料，例如与三重态猝灭剂偶联的荧光染料。47，或降低激光照射强度。尽管氧气清除系统通常用于 体外 单分子实验中抑制荧光团光漂白的方法48,49该检测方法无需使用任何氧气清除系统，即可提供非常宽泛的检测窗口15此外，除氧系统会显著降低...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院 [R01GM121847]、纪念斯隆-凯特琳癌症中心（MSKCC）支持基金/核心基金（P30 CA008748）以及 MSKCC 功能基因组学计划资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100倍油镜，数值孔径 1.49OlympusUAPON 100XOTIRF
丙烯酰胺/双丙烯酰胺（40%，19:1）Bio-Rad161-0144
碱性液体洗涤剂Decon5332
氨基硅烷（N-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷）UCT Specialties, LLCA0700
Andor ixon Ultra DU 897V EMCCDAndorDU-897U-CSO-#BV
Andor Solis 软件Andor用于控制 Andor EMCCD
带通滤光片Chroma532/640/25
带通滤光片ChromaNF03-405/488/532/635E-25
生物素-PEG-SVALaysan Bio IncBiotin-PEG-SVA
辅酶A游离酸Prolume309-250
Coolterm 软件用于控制注射泵
台式计算机Dell用于控制显微镜、相机、载物台和泵
二向色镜SemrockR405/488/532/635
Direct-zol RNA 微量提取试剂盒 50RNXFisher ScientificNC1139450
双荧光素酶报告基因检测系统PromegaE1910
环氧树脂Devcon14250
萤火虫荧光素 D-荧光素游离酸Prolume306-250
冰醋酸Fisher ScientificBP1185500
过氧化氢Sigma-Aldrich216763-500ML
浸油OlympusZ-81226A低自发荧光
荧光素酶检测系统PromegaE1500
MEGASCRIPT T7 转录试剂盒Thermo fisherAM1334
甲醇Fisher ScientificMMX04751
显微镜OlympusIX83
显微镜载玻片Thermo Scientific3048
单克隆抗FLAG M2-Cy3抗体Sigma-AldrichA9594
mPEG-SVALaysan Bio IncmPEG-SVA-5000
MS(PEG)4Thermo Scientific22341
NaCl (5M)Thermo ScientificAM9760G
1.5号显微镜盖玻片Fisherband12-544-C
Olympus 激光器，532 nm，100 mWOlympus 数字激光系统CMR-LAS 532nm 100mW
Olympus TirfCtrl 软件Olympus用于控制激光强度和入射角度
光学平台TMC 振动控制63-563带振动隔离功能
苯酚-氯仿-异戊醇混合液Sigma-Aldrich77617-100ml
Pierce RNA 3'端生物素标记试剂盒Thermo Scientific20160
氢氧化钾颗粒Sigma-AldrichP1767-500G
Prior 电动XY平移载物台PriorPS3J100
Prior PriorTest 软件Prior用于控制 Prior 电动载物台
重组RNasin核糖核酸酶抑制剂PromegaN2515
载物台培养箱In vivo scientific (World Precision Instruments)98710-1配有定制亚克力笼
染色缸Fisher Scientific08-817
链霉亲和素Thermo Scientific43-4301
硫酸Fisher ScientificA300212
SYBR Green IIFisher ScientificS7564
注射器Hamilton1725RN
注射泵Harvard apparatus55-3333
Tris (1M)，pH = 7.0Thermo ScientificAM9850G
超声波清洗仪BransonCPX1800H
尿素Sigma-AldrichU5378-500G
痘苗病毒加帽系统New England BiolabsM2080S
Zymo-Spin IC 柱Zymo ResearchC1004

参考文献

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