方法文章

用于分析依赖帽的翻译动力学的 体外 单分子成像测定

DOI：

10.3791/61648

⸱

2020年9月15日

 ,  , 
1Molecular Biology Program, Memorial Sloan Kettering Cancer Center

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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跟踪单个翻译事件允许对依赖上限的翻译机制进行高分辨率动能研究。在这里，我们演示了基于荧光标记抗体和表皮标记的新生肽之间的成像相互作用的 体外 单分子检测。该方法使启动和肽伸长动力学的单分子特征 在主动体外 帽依赖翻译。

摘要

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依赖上限的蛋白质合成是真核细胞的主要转化途径。虽然各种生化和遗传方法允许对依赖上限的翻译及其调节进行广泛的研究，但这种翻译途径的高分辨率动能特征仍然缺乏。最近，我们开发了一种 体外 测定法，以单分子分辨率测量依赖上限的转化动力学。该检测基于荧光标记的抗体结合到新生的表皮标记的多肽。通过成像抗体与新生肽（核糖体）mRNA复合物的结合和分离，可以跟踪单个 mRNA 的翻译进展。在这里，我们提出了建立此测定的协议，包括 mRNA 和 PEGylated 幻灯片制备、翻译的实时成像以及单分子轨迹分析。此分析能够跟踪单个依赖上限的翻译事件，并解决关键的翻译动力学，如启动和拉长率。该测定可广泛应用于不同的翻译系统，在依赖上限的翻译动力学和转化控制机制的 体外研究中 应大有裨益。

引言

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在真核系统的翻译主要通过7甲基瓜诺辛（m7G）帽依赖通路1发生。研究表明，真核翻译的启动步骤是限速的，也是第2、3、4条规则的共同目标。利用遗传5、生化6、7、8、结构9和基因组10大块方法，对上限依赖转化机制进行了广泛的研究。虽然这些方法确定了调节依赖上限启动的多种机制，但其分辨率仅限于异质和异步启动事件信号的合奏平均值。最近，在体内翻译事件中，通过测量荧光抗体与新生多肽11、12、13、14上的表皮结合的方法，对个体进行了可视化。然而，这些新方法在解决单个启动事件的能力方面也受....

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方案

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1. 记者 mRNA 的一代

  1. 修改DNA转录模板，通过插入N-总站表位标记编码序列来为"标记"记者mRNA生成DNA转录模板（图2A），对批量分析"未标记"的记者mRNA进行编码。
    注:3xFLAG/防 FLAG 交互建议用于此检测，因为它具有卓越的灵敏度和短的 3xFLAG 标记长度。但是，该检测与其他表皮/抗体对兼容。
  2. 使用线性DNA模板和 体外 转录套件合成未标记和标记的RNA（参见 材料表）。通常，10-20 pmol的 体外 转录RNA足以进行后续RNA处理，以便进行系统的单分子研究。
  3. 按照制造商的建议，用 m 7 G 封顶套件（参见材料表）盖上RNA 5+端 （图 2B）。
  4. 根据与工具包提供的协议，使用生物素化试剂盒（见材料表）对RNA 3+端（图2B）进行生物基化。通过酚-氯仿提取净化RNA，然后用旋转柱进行净化。10-20微升无RNA水中的埃卢特RNA。大约 40-50% 的未封顶输入 RNA 被恢复。
  5. 评估RNA的完整性和浓度通过去硝化丙烯酰胺凝胶电泳和RNA染色，如前

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结果

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按照所描述的协议，在3'末端系记者mRNA（图1）的活性无细胞翻译过程中，能够与新生的N终端标记多肽进行单个抗体相互作用的成像，具有单分子分辨率。报告使用三种合成 mRNA 进行最小演示实验:LUC（编码未标记的路西法酶）、LUCFLAG（编码 3xFLAG 标记的路西法酶）和hp-LUCFLAG（LUC FLAG，在 5' 领先区域具有稳定的茎环）（图2C）。使用荧光酶编码 mRNA 可比较单分子观测和散装发光测量。3'生物基化mRNA的完整性通过去硝化聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和RNA染色来评估。高质量的 mRNA 显示单个干净的波段，不应显示额外的快速迁移信号 （图 3A）。糖精塞雷维西亚翻译提取物在这里使用，并准备遵循协议，.......

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讨论

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与典型的体外TIRF 单分子实验相比，此处描述的检测的单分子成像由于使用细胞提取物和高浓度荧光标记抗体而异常复杂。与一轮表面PEGylation的更常见做法相比，第二轮PEGylation（第2步）大大减少了非特异性抗体对检测表面15的结合。扩散荧光抗体的高浓度会导致极高的荧光背景，掩盖单分子检测抗体结合。为了减少这种荧光背景，激光事件角度远高于临界角（第 3.4 步）。抗体检测也因氟磷不稳定性过大而减弱，这会限制量化居住时间的能力。遇到此问题时，用更可拍照的荧光剂替换氟磷，例如与三重状态淬火47结合的氟磷，或降低激光照明强度。虽然氧气清理系统常用于体外单分子实验，以抑制氟磷光吸收48，49，这里描述的检测可以提供一个非常慷慨的检测窗口，而无需执行任何氧气清理系统15。此外，氧气清理系统可以大大降低真核细胞无翻译效率。因此，氧气清理系统在使用此.......

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

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这项工作得到了国家卫生研究院[R01GM121847]的支持;纪念斯隆·凯特林癌症中心（MSKCC）支持赠款/核心赠款（P30 CA008748）;和 MSKCC 功能基因组学倡议。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100X 油物镜， N.A. 1.49奥林巴斯UAPON 100XOTIRF
丙烯酰胺/双（40%，19：1）Bio-Rad161-0144
碱性液体洗涤剂Decon5332
氨基硅烷（N-（2-氨基乙基）-3-氨基丙基三甲氧基硅烷）UCT Specialties， LLCA0700
Andor ixon Ultra DU 897V EMCCDAndorDU-897U-CSO-#BV
Andor Solis 软件Andor用于控制 Andor EMCCD
带通滤光片Chroma532/640/25
带通滤光片ChromaNF03-405/488/532/635E-25
生物素-PEG-SVALaysan Bio Inc生物素-PEG-SVA
辅酶 A 游离酸Prolume309-250
Coolterm 软件用于控制注射泵
台式计算机Dell用于控制显微镜、相机、载物台和泵。
二向色镜SemrockR405/488/532/635
Direct-zol RNA microprep 50RNXFisher ScientificNC1139450
双荧光素酶报告基因检测系统PromegaE1910
环氧树脂Devcon14250
萤火虫荧光素 D-萤光素游离酸Prolume306-250
冰醋酸Fisher ScientificBP1185500
过氧化氢Sigma-Aldrich216763-500ML
浸油OlympusZ-81226A低自发荧光
荧光素酶检测系统PromegaE1500
MEGASCRIPT T7 转录试剂盒Thermo FisherAM1334
甲醇Fisher科学MMX04751
显微镜奥林巴斯IX83
显微镜载玻片Thermo Scientific3048
单克隆抗 FLAG M2-Cy3Sigma-AldrichA9594
mPEG-SVALaysan Bio IncmPEG-SVA-5000
MS（PEG）4Thermo Scientific22341
NaCl （5M）Thermo ScientificAM9760G
No 1.5 显微镜 盖玻片Fisherband12-544-C
奥林巴斯激光器，532nm 100mM奥林巴斯数字激光系统CMR-LAS 532nm 100mW
奥林巴斯 TirfCtrl 软件奥林巴斯用于控制激光强度和入射角
光学平台TMC 振动控制63-563带隔振
功能 酚氯仿异戊醇混合物Sigma-Aldrich77617-100ml
Pierce RNA 3' 末端生物素化试剂盒Thermo Scientific20160
氢氧化钾沉淀Sigma-AldrichP1767-500G
先前的电动 XY 平移阶段先前PS3J100
先前的 PriorTest 软件先验用于控制先前的电动阶段
重组 RNasin RNase 抑制剂PromegaN2515
载物台顶部培养箱体内科学（世界精密仪器）98710-1带有定制的丙烯酸笼
染色罐Fisher Scientific08-817
链霉亲和素Thermo Scientific43-4301
硫酸Fisher ScientificA300212
SYBR green IIFisher ScientificS7564
注射器Hamilton1725RN
注射泵哈佛仪器55-3333
Tris （1M），pH = 7.0Thermo ScientificAM9850G
超声波浴布兰森
尿素Sigma-AldrichU5378-500G
牛痘加盖系统New England BiolabsM2080S
Zymo-Spin IC 色谱柱Zymo ResearchC1004
的 CPX1800H

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hinnebusch, A. G. The scanning mechanism of eukaryotic translation initiation. Annual Review of Biochemistry. 83, 779-812 (2014).
  2. Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5

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标签

mRNA

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