澳大利亚同步辐射光源上用于序列晶体学测量的脂质注射方案

摘要

本实验方案的目的是演示如何制备用于在澳大利亚同步加速器新近投入使用的高粘性喷射器Lipidico上进行数据采集的序列晶体学样品。

摘要

在澳大利亚同步加速器上已建立一个用于进行序列晶体学测量的设施。该设施包含一种专门设计的高黏度喷射器Lipidico，作为大分子晶体学（MX2）光束线的一部分，用于在室温下测量大量微小晶体。该技术的目标是实现晶体的生长/转移 用于序列晶体学数据收集的注射器中的玻璃注射器。该注射器的优点包括能够快速响应 在不中断液流的情况下调节流速。该高粘度进样器（HVI）存在若干局限性，包括对允许的样品粘度范围有所限制。 >10 Pa·s。流体稳定性也可能因样品的具体性质而成为问题。本文提供了在澳大利亚同步辐射光源上进行序列晶体学测量时，样品制备和喷射器操作的详细方案。该方法展示了样品的制备过程，包括将溶菌酶晶体转移至高黏性介质（硅脂）中，以及在MX2光束线上操作喷射器进行数据采集的步骤。

引言

序列晶体学（Serial crystallography, SX）最初是在X射线自由电子激光器（X-ray Free Electron Lasers, XFELs）的背景下发展起来的一种技术^1,2,3,4。尽管固定靶方法也可用于SX^5,6,7，但通常采用喷射系统将晶体持续不断地输送到X射线束中。由于该技术整合了大量晶体的数据，因此在实验过程中无需进行任何晶体取向调整，并能够在室温下收集数据^8,9。借助合适的喷射装置，晶体被逐个送入X射线作用区域，并在面阵探测器上收集相应的衍射数据^9,10。迄今为止，SX已成功解析了多种蛋白质结构^1,11,12,13，包括那些因尺寸过小而无法通过传统晶体学方法测量的晶体。此外，利用XFEL的飞秒脉冲持续时间，SX还在时间分辨分子动力学研究方面提供了新的见解。通过使用光学激光源启动泵浦-探测反应，研究人员已对光系统II^14,15、光敏黄色蛋白^16,17、细胞色素c氧化酶¹⁸以及细菌视紫红质^19,20,21开展了深入研究。这些研究探测了光激活后发生的电子转移动力学过程，充分展示了序列晶体学在理解时间分辨生物学过程方面的巨大潜力。

在同步辐射光源处，序列晶体学的发展也正变得越来越普遍^{9,12,20,22,23,24}。基于同步辐射的序列晶体学（SX）能够在室温下利用合适的注射系统高效地测量大量单独晶体。该方法适用于较小的晶体，因此除了需要高速帧率探测器来收集数据外，还需要微聚焦光束。与传统晶体学相比，SX无需将单个晶体安装并调整至X射线束中。由于来自大量单独晶体的数据会被合并，每个晶体所受到的辐射剂量可显著低于传统晶体学。只要具备足够高帧率的探测器（例如100 Hz或更高），同步辐射SX还可用于时间分辨反应的研究，甚至可达到毫秒量级。已有多个序列晶体学实验在同步辐射装置上开展，所用注射器最初是在XFEL光源处开发的^20,22,23。其中最常见的两种注射器类型是气体动力学虚拟喷嘴（GDVN）²⁵和高黏度注射器（HVI）^{9,24,26,27,28}。GDVN适用于低黏度液体样品的注射，但需要高流速以实现稳定的液流，这反过来导致样品消耗量较高。相比之下，HVI适用于高黏度样品，可在低得多的流速下产生稳定液流，从而显著降低样品消耗。因此，HVI注射器更适合于需使用黏稠载体的样品递送（例如用于膜蛋白的脂质基载体）和/或样品量有限的情况。SX注射器通常操作难度较大，需要经过 extensive 培训才能使用。此外，其还涉及复杂的样品转移流程，因为样品必须被装入专用储液器，这一过程通常存在较高的样品损失风险，可能发生在“死体积”中或因连接处泄漏所致。因此，优化注射器设计以减少样品在到达X射线束之前可能发生的任何损失是十分必要的。

最近，使用溶菌酶作为靶标，结合Eiger 16M探测器，首次发表了基于Lipidico²³ 的SX实验结果。 该注射器设计通过减少从初始结晶到将晶体转移至注射器并最终送入X射线束过程中的操作步骤，显著降低了样品浪费。本文详细描述并演示了从样品制备、注射过程到数据收集的完整样品转移流程，全程使用相同的结晶容器。文中还介绍了注射器的操作方法。

方案

1. 使用玻璃注射器在高黏度介质中制备晶体

1. 轻柔离心晶体溶液（约1,000） x g，室温（约22 °C）下离心约10分钟，形成柔软的晶体沉淀并去除多余缓冲液。沉淀中将含有高浓度晶体，可用于数据收集。
   注意：为防止高黏性介质被稀释，此步骤需增加晶体浓度。针对每个样品优化高黏性介质与晶体体积的比例，以在保持介质高黏性的同时获得较高的晶体浓度。参照 Darmanin 等人的方法，通过离心晶体溶液形成沉淀，并去除过量缓冲液，以提高溶液中的晶体浓度。²⁹.
2. 使用连接器安装两个100 µL注射器。
3. 将接头固定在第一支注射器的末端，并向注射器顶部加入 28 µL 结晶溶液。缓慢将活塞插入注射器顶部，轻轻推动溶液至接头尖端，排除形成的任何气泡。可通过以下两种方法之一进行操作。
   注意：若晶体的加入量不会显著改变整个样品的黏度，则可适当调整加入高黏性介质中的晶体体积。
   1. 第一种方法：利用快速的压力变化使气泡破裂。
      1. 用戴着手套的手指轻轻按压在钝化耦合器针头的顶端，施加轻微压力以形成密封。切勿用力过猛，以免造成针刺伤。
      2. 现在将活塞向后拉动，使溶液离开针尖，这会在注射器内产生压力积聚。
      3. 迅速移开堵住钝针尖的手套手指，释放注射器顶部的压力。注意，若移开手指时样品过于接近针尖，可能导致样品喷出而造成损失。注射器内压力的快速变化会使气泡破裂。重复此操作，直至所有气泡完全去除。
   2. 第二种方法：使用“人体离心机”去除气泡。
      1. 将注射器握于一手，针头朝上，活塞置于两指之间固定，防止其移动。
      2. 快速将持注射器的手臂朝一个方向旋转2–3次，样品所受的离心力会将注射器中的气泡排出。注意操作需迅速，若旋转过慢可能导致样品损失。
      3. 检查注射器中是否有气泡，如果仍有气泡，重复步骤 1.3.2.1 – 1.3.2.2，直至所有气泡完全排除。
4. 使用精细的刮刀，将约 42 µL 高真空硅脂直接加至第二个注射器顶部。将推杆完全推到底端，排出所有气泡，并确保注射器末端无任何空气间隙。
   注意：硅脂的确切成分并不关键，因其仅作为惰性载体使用。其黏度值为 >10 Pa·s 或约 60:40 的硅脂与晶体溶液比例最适合注射，但该比例可能因样品的具体特性而有所变化。可根据讨论部分所述，调整加入硅脂的晶体溶液体积，以优化混合物中的晶体浓度。只要与样品相容，也可使用其他高黏性介质替代硅脂。^30,31,32,33.
5. 确保两个注射器中均无气泡，并使用连接器将注射器连接在一起。操作时应仅握住注射器末端并保持垂直，因为手指产生的热量可能导致注射器升温，从而影响样品。
6. 轻轻按压晶体溶液一侧的活塞，使样品缓缓混入硅脂中，然后推动硅脂一侧的活塞，将样品重新推回晶体溶液一侧。轻柔地重复此过程50至100次，直至样品充分混合，外观均匀一致。.
   注意：如果晶体直接在高黏性介质（如脂质立方相，LCP）中生长，则无需执行步骤1.1–1.6。有关在注射器内生长晶体的实验方案可参见Liu等人的文献。^34,35遵循本方案至样品合并步骤10，此时所有样品已集中于一支注射器中，结晶缓冲液已被去除。本方案无需添加7.9MAG。相反，应轻轻推动注射器活塞，排出注射器内所有多余液体，直至无残留液体为止。
7. 通过光学显微镜观察晶体，可直接在注射器中观察，或为获得最佳效果，取少量样品（约1 µL）滴于玻璃载片上，盖上盖玻片后观察。
8. 检测晶体浓度。
   1. 使用光学显微镜图像，通过统计特定区域内晶体数量来确定硅脂中晶体的浓度。为获得最佳结果，介质中晶体分布均匀且密度较高为宜（>10⁶ 晶体/mL），以获得较高的晶体命中率。
   2. 通过调整步骤1.3和1.4中晶体与粘性介质的比例，调节注射器中晶体的浓度。
      1. 为降低晶体浓度，可在步骤1.4中通过增加硅脂/HV培养基的量来稀释注射器中的晶体，或在步骤1.1设置注射器之前，用结晶缓冲液将晶体沉淀在溶液中进行稀释。
      2. 为提高晶体浓度，可减少第1.4步中硅脂的用量，但需注意避免黏度降至10 Pa·s以下。
         注意：此处报告的晶体浓度是针对该特定样品和晶体尺寸优化的结果。然而，理想的晶体浓度取决于晶体尺寸、光束尺寸、毛细管内径（I.D.）以及入射X射线通量。可通过命中率来确定最佳浓度，通常将约30%的命中率视为“良好”。在实际操作中，必须在光束时间期间针对不同样品优化晶体浓度，以获得理想的命中率。起始时采用较高的晶体浓度，10⁹ 晶体/mL。调整晶体浓度的步骤见Liu等人的文献。³⁵.
   3. 此处可暂停操作，直至注射器准备就绪以进行数据采集。
      1. 如果晶体在LCP中生长，则密封 它们并让其在室温下于注射器中保存数天。
      2. 如果晶体已被转移至不同的高黏性介质（例如硅脂）中，则 应在测量前对晶体进行随时间变化的稳定性测试。这将确定晶体在惰性介质中保持稳定的时长（理想情况下 > 8 小时）以及数据收集的时间限制。在此，溶菌酶晶体在硅脂中数天内保持稳定，使用光学显微镜观察时未出现溶解迹象。
9. 在断开连接器之前，先将所有样品转移至同一注射器中。将连接器从注射器上拆下，并安装进样针头。将针头牢固地旋紧在注射器底部，确保连接紧密，防止泄漏。本实验使用内径为108 µm的针头（针头长度13 mm，尖端类型3）。根据晶体尺寸和光束大小，选择使用内径为51 µm或108 µm的针头。
   注意：在使用光束时间之前，必须对样品流进行预测试，以选择合适的注射器针头尺寸。根据样品特性（如黏度、带电情况、缓冲液组成）以及针头内径的不同，样品的流动行为会有所差异。因此，建议测试多种针头尺寸，以获得最稳定的液流，并尽可能选用最小内径的针头，从而在数据采集过程中最大化信噪比。
10. 如果注射器已安装并校准在光束线上，则转至第3节，将样品注射器直接安装到注射器上。
    注意：此处可暂停本实验方案。

2. 注射器安装与控制

1. 将喷射器安装到光束线上。拆下 MX2 光束线上的低温喷嘴，并将其更换为喷射器。松开固定低温喷嘴的夹紧螺丝，并将其固定在电机化平台旁边的支架上。
2. 握住黑色手柄将喷射器从手推车上抬起，并将其放置在电机化平台上。
   1. 为将喷射器固定在电机化平台上，用手拧紧黑色夹紧螺丝旋钮。
3. 在喷射器上安装一个空的注射器
   1. 在喷射器计算机控制界面（即 EPOS 位置控制软件）中，从软件菜单的 工具 下选择 回零模式，然后选择 负限位开关 并点击 开始回零，让软件运行直至螺杆充分缩回，以便注射器能够置于螺杆下方。若无人监管运行，限位开关将自动停止螺杆运动。
   2. 通过将针头插入注射器支架的狭缝中，将一个空的（“假”）注射器安装到喷射器上，并将注射器与支架对齐。
   3. 用两个 O 型圈固定注射器。
      1. 将第一个 O 型圈缠绕在注射器的中段，并将其固定在注射器两侧的挂钩上。
      2. 将第二个 O 型圈绕在注射器上部的挂钩上，然后将 O 型圈的一部分放在玻璃注射器顶部，如演示所示及 图 1B 所示。
4. 将喷射器与 X 射线束对齐
   1. 通过光束线控制软件，将带有喷射器的电机化平台移向 X 射线相互作用点。可通过 在线相机 观察此过程。屏幕上以红色十字标记光束的大小和位置，可移动电机化平台，使针头与 X 射线相互作用区域对齐。
   2. 调节平台的 x 和 y 位置，使针头与红色十字对齐。
   3. 调节 z 方向位置，直至针尖处于焦点位置。
   4. 通过检查光学显微镜图像中注射器尖端是否与十字准线重合，目视验证针尖与 X 射线束的对齐情况，该图像由光束线相机生成。
   5. 一旦针尖对齐，将针尖向上移动至十字准线上方约 100 µm 处。这可消除 针尖产生的 X 射线散射。
      注：在同步辐射 MX2 光束线上安装和对齐喷射器必须由光束线科学家操作，可在 30 分钟内完成。

3. 安装样品注射器

1. 按照步骤 2.3，将空注射器更换为样品注射器。
2. 将注射器帽安装在样品注射器的推杆头部。
3. 将驱动螺杆移至帽的顶部。
4. 在注射器控制软件中选择 速度模式。
5. 输入 3000 rpm（约 115 nL/s）作为 设定值，然后点击 应用设定值。
6. 当驱动螺杆接触到注射器推杆头部的帽时，停止电机。
   1. 在螺杆接近帽时，通过将控制软件中的 设定值 更改为“0”，将转速设为零。
   2. 一旦接触完成，立即按下 应用设定值 激活预设值，使螺杆瞬间停止。
7. 轻轻晃动帽，确保其牢固就位。
   注意：每当在控制软件的 设定值 框中输入新的设定值后，必须按下 应用设定值 才能生效。

4. 运行注射器

1. 当帽驱动螺丝与柱塞顶部牢固接触后，将转速设定值调整为100。这相当于约4 nL/s。
2. 当样品首次从针尖流出时，目视检查针尖，或查看光束线摄像机拍摄的针头图像，以观察样品何时开始从针尖挤出。
3. 对实验舱进行搜索，关闭舱门，并开启X射线束。自此之后，必须在实验舱外远程操作注射器。
4. 调节转速，直至形成稳定的液流。
   1. 将转速设定值降低至90。
   2. 重复步骤4.4.1，每次将转速设定值降低10，以减缓液流速度，但仍保持液流稳定。对于硅脂样品，使用的转速值为30 rpm。
      注：典型转速范围根据样品特性及X射线曝光时间的不同，通常在30–100 rpm（1–4 nL/s）之间变化。一般情况下，应调节转速以产生最慢的流速（以最小化样品消耗），同时维持液流稳定。
5. 处理流动不良的样品液流。
   1. 以10为增量持续提高转速设定值，直至液流变得更直。如果即使将转速设定值提高至最大值100 rpm后液流仍无法稳定，可尝试采用以下两种方法之一来改善稳定性。
      1. 第一种方法：在样品液流下方插入一个聚苯乙烯样品收集器，以帮助引导样品。该方法对高电荷样品液流效果良好。
      2. 第二种方法：将文丘里抽吸漏斗连接至样品收集器。通过将漏斗连接到实验舱内的空气出口管，为其提供气流。该方法可在不依赖液流电荷的情况下，辅助引导和稳定样品流动。
6. 一旦获得恒定且稳定的液流，即可开始数据采集，并根据常规X射线晶体学实验的要求优化探测器距离。
   注：使用补充信息中的“Lipidico Device Calculator”提供的换算表将转速转换为流速。输入转速值、针头直径和注射器体积，即可通过该计算器计算出流速。

结果

Lipidico 是一种高黏度注射器（HVI），设计作为在 MX2 上使用的替代递送系统（图1）。它特别适用于串行晶体学（SX）实验，其中晶体要么在脂质立方相中生长，要么被转移至高黏度惰性介质中。

为了演示喷射器的应用，将混合了溶菌酶晶体的硅脂用于在澳大利亚同步辐射中心的 MX2 光束线上收集序列晶体学（SX）数据。将喷射器安装到 MX2 光束线时，需移除低温喷嘴，并替换为喷射器，如图1所示。注射器样品直接安装在喷射器上，并使用O形圈固定（图1B）。更换样品后几分钟内即可开始数据采集。该喷射器设计用于快速样品控制，其结构简单，便于不熟悉序列晶体学（SX）的用户操作。

讨论

一种新型的高通量进样装置（HVI）已被开发出来，非常适合在同步辐射光源上进行串行晶体学（SX）实验。该装置相较于现有的HVI具有两个关键优势。首先，它在光束线上安装简便，可在常规晶体学与SX实验之间快速切换，在MX2光束线上完成安装 和对准仅需约30分钟。其次，用于晶体生长的样品注射器可直接用作进样储液池，从而在样品转移过程中最大限度减少样品浪费。本文已描述并演示了更换样品的操作流程。该设计无需像其他HVI那样依赖复杂的气体气流来控制液流，简化了操作。同时，本文还展示了一种调节进样器流速的简便方法，可实现无延迟响应的实时调整。

成功进行SX数据收集最关键的步骤是优化晶体浓度、获得均一的高黏性介质混合物，以及产生稳定的射流用于数据采集。通过将晶体离心形成沉淀，并向载体介质中加入更高浓度的晶体，可在耦合系统中确保样品充分混合，从而实现最佳的晶体浓度和均一性。一旦晶体浓度得到优化，即可在光束时间期间轻松调节注射器流速，以获得稳定的射流。高黏性样品常出现黏性射流卷曲的现象。本文提出两种解决方案：对带电样品使用聚苯乙烯样品收集器，或加装文丘里吸力漏斗作为收集装置。初步测试表明这些方...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
溶菌酶（来自鸡蛋清）	Sigma-Aldrich	L6876	用于生长晶体以测试注射器，晶体随后转移至硅脂中。https://www.sigmaaldrich.com/
高真空硅脂	Dow Corning	Z273554-1EA	用于注射器测试。https://www.sigmaaldrich.com/
注射针（108 µm 内径）	Hamilton	货号：7803-05	www.hamiltoncompany.com
玻璃气密式注射器，100 µl	Hamilton	货号：7656-01	用于样品注射的注射器。www.hamiltoncompany.com
LCP 注射器连接器	Formulatrix	209526	用于混合样品的注射器连接装置
Lipidico 注射器	La Trobe University/ANSTO		这是一种特定设备，可通过 La Trobe 大学 / ANSTO 澳大利亚同步辐射设施获取使用