本文介绍一种结合化学表观遗传擦除与力学感应相关信号的方法，可高效生成哺乳动物多能细胞，且无需基因转染或逆转录病毒载体。因此，该策略在转化医学领域具有广阔前景，并代表了干细胞类器官技术的重要进展。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
细胞表型可通过不同方法实现逆转或修饰，每种技术均有其特定的优势与局限性。本文介绍一种新策略，该策略结合化学表观遗传擦除与机械感应相关信号，以生成哺乳动物多能性细胞。该方法需经过两个主要步骤。第一步，将成年成熟（终末分化）细胞暴露于表观遗传擦除剂5-aza-胞苷中，以诱导其进入多能性状态。该部分方案的建立基于对调控细胞命运与分化的表观遗传机制的深入理解，涉及使用表观遗传修饰剂消除细胞的分化状态，进而诱导其进入一个短暂的高可塑性窗口期。
在第二步中，将已重编程的细胞封装在聚四氟乙烯（PTFE）微型生物反应器（也称为液态弹珠）中，以促进细胞三维重排，从而延伸并稳定维持所获得的高可塑性。PTFE是一种惰性的疏水性合成化合物，其应用可构建出传统二维培养系统无法实现的细胞微环境。该系统通过与生物机械感应相关的信号通路，促进并增强多能性的维持。
本文所述的技术流程是诱导并维持成年体细胞处于高可塑性状态的简单策略。该方案已在所有经过测试的哺乳动物物种中成功获得高可塑性细胞。由于该方法不涉及基因转染，且无需使用病毒载体，因此可能代表了转化医学应用中的一项重要技术进步。此外，微型生物反应器系统通过在体外重建特定的微环境，实现了干细胞类器官技术的显著进步，从而支持高可塑性细胞（如ESC、iPSC、表观遗传重编程细胞和MSC）的长期培养。
引言
在过去的几十年中，关于细胞命运单向走向承诺和分化的广泛接受概念已被彻底修正。已有研究表明，细胞特化过程可以被逆转，通过不同方法可将终末分化的细胞重新诱导至更低分化程度且更具可塑性的状态。
在已提出的多种方法中，最有前景的方法之一是利用化学化合物诱导细胞进入所谓的化学诱导多能性状态。该方法所用的小分子能够相互作用并修饰成体成熟细胞的表观遗传特征，从而避免了使用任何转基因和/或病毒载体的需要1,2,3,4,5,6,7,8,9,10。最近的大量研究表明，通过提供特定的生化和生物学刺激，可诱导超甲基化基因的再激活，从而实现细胞从一种表型向另一种表型的转换11,<....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有研究均经米兰大学伦理委员会审查并批准。所有动物实验均按照美国国立卫生研究院（NIH）发布的《实验动物护理和使用指南》进行。健康成年个体人源细胞的分离经米兰马焦雷综合医院伦理委员会批准。本研究中的所有方法均按照批准的指南实施。
1. 皮肤成纤维细胞的分离
注意：以下所述所有步骤均可应用于从小鼠、猪和人类等不同哺乳动物物种分离的成纤维细胞。小鼠细胞取自7周龄雄性小鼠，猪皮肤组织取自当地屠宰场。人源细胞取自成年患者，采集前已获得书面知情同意。
- 配制 0.1% 猪源明胶溶液。
- 称取 0.1 g 猪源明胶，溶于 100 mL 水中。使用前通过高压灭菌对明胶溶液进行灭菌处理。
- 向 35 mm 培养皿中加入 1.5 mL 上述配制的溶液，以 0.1% 猪源明胶包被。室温孵育 2 小时。
- 获取哺乳动物（小鼠、猪和人）皮肤活检组织，长度约为 2–5 cm，并将其置于含 2% 抗生素-抗真菌溶液的杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）中。于 +4 °C 保存至使用。
注意：活检组织的采集必须在获得伦理委员会批准并符合既定指南的前提下进行。 - 用新鲜无菌 PBS（含 2% 抗生素-抗真菌溶液）对采集的活检组织进行充分清洗，共清洗三次。
- 收集最后一次清洗后的活检组织，放入无菌 100 ....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
本方案描述了从成体体细胞生成并稳定维持哺乳动物多能性细胞所需执行的全部步骤。该方法已成功应用于分离自不同哺乳动物物种（即小鼠、猪和人）的成纤维细胞。此处报告的代表性结果来自所有细胞系，而不论其物种来源。
形态学分析显示，在与去甲基化试剂5-aza-CR共孵育18小时后，封装于PTFE微型生物反应器中的成纤维细胞（3D Post 5-aza-CR）发生聚集，并在所研究的三个物种中均形成了尺寸均一的三维球状结构。（图2A-C，3D Post 5-aza-CR）。高达86.31 ± 4.13%的封装细胞显著改变了其表型，表现出通常与高可塑性表型相关的特征8。相比之下，在二维标准条件下培养的5-aza-CR处理后细胞，尽管其典型的成纤维细胞细长形态被圆形或椭圆形所取代，但细胞体积明显更小，细胞核更大且呈颗粒状，并保持单层分布状态（图2）。这些形态学变化伴随着多能性相关基因在3D和2D Pos.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
在过去的几十年中，多项研究致力于开发策略，将终末分化的细胞逆转至更低分化程度且更具可塑性的状态。本文所述方案能够从成体成熟的终末分化细胞出发，生成并长期维持多能性细胞。该方法结合了两个独立步骤：首先通过化学表观遗传重置诱导出高度可塑的状态，随后利用三维培养系统维持该状态。
在聚四氟乙烯（PTFE）封装的细胞中观察到的三维球状结构形成（图2）与其他研究结果一致，这些研究证明了PTFE能够有效促进细胞聚集，从而有助于嗅鞘细胞（OEC）球状结构的建立25或三维环状聚集体的形成26。这些形态学变化伴随着多能性相关基因表达的启动（图3、图4、图5），在3D Post 5-aza-CR细胞中，其表达水平显著高于2D Post 5-aza-CR细胞（
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由Carraresi基金会和MiND FoodS枢纽（ID：1176436）资助。所有作者均为COST行动CA16119体外三维全细胞引导与功能（CellFit）的成员 。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-巯基乙醇 | Sigma-Aldrich | M7522 | ESC 培养基组分 |
| 5-氮杂胞苷 | Sigma-Aldrich | A2385 | 5-aza-CR，用于成纤维细胞表观遗传重置 |
| 腺苷 | Sigma-Aldrich | A4036 | ESC 培养基核苷混合物组分 |
| 抗生素-抗真菌素溶液（100×） | Sigma-Aldrich | A5955 | 成纤维细胞和 ESC 培养基组分 |
| CFX96 实时 PCR 仪 | Bio-Rad Laboratories | NA | 用于定量 PCR 的热循环仪 |
| 胞苷 | Sigma-Aldrich | C4654 | ESC 培养基核苷混合物组分 |
| DMEM，高糖，含丙酮酸 | Thermo Fisher Scientific | 41966052 | 用于成纤维细胞分离和培养 |
| DMEM，低糖，含丙酮酸 | Thermo Fisher Scientific | 31885023 | 用于 ESC 培养基 |
| Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液 | Sigma-Aldrich | D5652 | PBS；用于活检、细胞洗涤及溶液配制 |
| Dynabeads mRNA DIRECT 微量纯化试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 61021 | mRNA 提取 |
| ESGRO 重组小鼠 LIF 蛋白 | Sigma-Aldrich | ESG1106 | ESC 培养基组分 |
| 胎牛血清，经鉴定，热灭活 | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | 成纤维细胞和 ESC 培养基组分 |
| FGF-Basic（AA10-155）重组人蛋白 | Thermo Fisher Scientific | PHG0024 | ESC 培养基组分 |
| 猪皮明胶 | Sigma-Aldrich | G1890 | 用于培养皿包被 |
| GeneAmp PCR System 2700 | Applied Biosystems | NA | 用于定性 PCR 的热循环仪 |
| Global DNA 甲基化 ELISA 试剂盒 | CELL BIOLABS | STA-380 | 甲基化研究 |
| GoTaq G2 Flexi DNA 聚合酶 | Promega | M7801 | 定性 PCR |
| 鸟苷 | Sigma-Aldrich | G6264 | ESC 培养基核苷混合物组分 |
| Ham's F-10 营养混合物 | Thermo Fisher Scientific | 31550031 | 用于 ESC 培养基 |
| KnockOut 血清替代物 | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | ESC 培养基组分 |
| KOVA glasstic 计数板（带网格，10 孔） | Hycor Biomedical | 87144 | 用于细胞计数 |
| Leica MZ APO 体视显微镜 | Leica | NA | 用于类器官观察 |
| L-谷氨酰胺溶液 | Sigma-Aldrich | G7513 | 成纤维细胞和 ESC 培养基组分 |
| MEM 非必需氨基酸溶液（100X） | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | ESC 培养基组分 |
| Millex-GS 0.22 µm 孔径滤器 | Millipore | SLGS033SB | 用于溶液灭菌 |
| M-MLV 逆转录酶，RNase H 缺陷型，定点突变体 | Promega | M3681 | mRNA 逆转录 |
| Multiskan FC 微孔板光度计 | Thermo Fisher Scientific | 51119000 | 用于 ELISA 板读数 |
| Nikon Eclipse TE300 倒置相差显微镜 | Nikon | NA | 用于细胞观察 |
| Perkin Elmer Thermal Cycler 480 | Perkin Elmer | NA | 用于逆转录的热循环仪 |
| 聚四氟乙烯微粒，粒径 1 μm | Sigma-Aldrich | 430935 | 用于构建微型生物反应器 |
| PureLink 基因组 DNA 小量提取试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | K182001 | 基因组 DNA 提取 |
| TaqMan 基因表达 Cells-to-CT 试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | AM1728 | 定量 PCR |
| 胸苷 | Sigma-Aldrich | T1895 | ESC 培养基核苷混合物组分 |
| 组织培养皿，100×20 mm，标准型 | Sarstedt | 833902 | 用于成纤维细胞分离 |
| 组织培养皿，35×10 mm，标准型 | Sarstedt | 833900 | 用于成纤维细胞分离 |
| 组织培养皿，35×10 mm，悬浮型 | Sarstedt | 833900500 | 细菌培养用培养皿，用于液态弹珠培养 |
| 组织培养板，96 孔，标准型，F | Sarstedt | 833924005 | 用于液态弹珠培养 |
| 胰蛋白酶-EDTA 溶液 | Sigma-Aldrich | T3924 | 用于成纤维细胞解离 |
| 离心管，15 ml，120×17 mm，聚苯乙烯材质 | Sarstedt | 62553041 | 用于细胞悬液离心 |
| 尿苷 | Sigma-Aldrich | U3003 | ESC 培养基核苷混合物组分 |
参考文献
- Pennarossa, G., et al. Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8948-8953 (2013).
- Pennarossa, G., et al.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
