结合表观遗传修饰和生物力学线索的两步策略，以产生哺乳动物多能细胞

摘要

我们在这里提出了一种将化学表观遗传擦除与机械检测相关线索相结合的方法，以有效地产生哺乳动物多能细胞，而无需基因转染或逆转录病毒载体。因此，这种策略对转化医学很有希望，并且代表了干细胞类器官技术的显着进步。

摘要

细胞表型可以用不同的方法逆转或修饰，具有每种技术特有的优点和局限性。在这里，我们描述了一种新策略，该策略将化学表观遗传擦除与机械检测相关线索相结合，以产生哺乳动物多能细胞。需要两个主要步骤。在第一步中，成体成熟（终末分化）细胞暴露于表观遗传橡皮擦5-氮杂胞苷以驱动它们进入多能状态。该方案的这一部分是基于对控制细胞命运和分化的表观遗传机制的日益了解而开发的，并且涉及使用表观遗传修饰剂来消除细胞分化状态，然后驱动进入瞬时高可塑性窗口。

在第二步中，将擦除的细胞封装在聚四氟乙烯（PTFE）微生物反应器（也称为Liquid Marbles）中，以促进3D细胞重排以扩展并稳定地保持获得的高可塑性。PTFE是一种非反应性疏水性合成化合物，其使用允许产生细胞微环境，这在传统的2D培养系统中无法实现。该系统通过生物机械检测相关线索鼓励和促进多能性的维持。

这里描述的技术程序是允许在成人体细胞中诱导和维持高可塑性状态的简单策略。该协议允许在所有测试的哺乳动物物种中衍生出高可塑性细胞。由于它不涉及基因转染的使用，并且没有病毒载体，因此它可能代表了转化医学应用的显着技术进步。此外，微生物反应器系统通过体外重新创建特定的微环境，允许长期培养高可塑性细胞，即ESC，iPSCs，表观遗传擦除细胞和MSC，从而为干细胞类器官技术提供了显着的进步。

引言

在过去的几十年里，被广泛接受的单向进展到细胞承诺和分化的概念被完全修改。已经证明，细胞规格可以颠倒过来，并且使用不同的方法可以将终末分化的细胞推向不那么投入和更高的宽容状态。

在提出的几种方法中，最有前途的方法之一涉及使用化合物诱导细胞进入所谓的化学诱导多能性。这种方法中使用的小分子能够相互作用并修饰成年成熟细胞的表观遗传特征，从而避免了对任何转基因和/或病毒载体^1，2，^{3，4，5，6，7，8，9，10}的需求。.最近的许多研究表明，通过提供诱导高甲基化基因^{11，12，13，14，15}再激活的特定生化和生物刺激^，可以将细胞从一种表型切换到另一种表型。这些去甲基化事件允许将终末分化的细胞转化为原始祖细胞，多能或高可塑性/多能细胞^1，2，^{3，4，5，6，7，8，9，10}。

同时，许多研究最近都集中在理解机械检测相关线索上，更具体地说，是使用机械力直接影响细胞可塑性和/或分化的可能性^{16，17，18，19}。事实上，已经清楚地表明，细胞外基质（ECM）在控制细胞命运中起着关键作用。特别是，ECM产生的生物力学和生物物理信号直接调节分子机制和信号通路，影响细胞行为和功能^20，21。这些最近的数据为开发新型3D培养系统铺平了道路，这些系统更接近于模仿体内细胞微环境，复制驱动细胞行为的机械和物理刺激。

我们在这里描述了一个两步方案，它将化学表观遗传擦除与机械衰老相关线索相结合，以产生哺乳动物多能细胞。在第一步中，将细胞与去甲基化分子5-氮杂胞苷（5-氮杂-CR）一起孵育。该试剂能够通过直接的10-11易位2（TET2）介导的作用^8，10 和间接抑制DNA甲基转移酶（DNMT）^22，23的组合作用来诱导显着的全局DNA去甲基化。该步骤诱导表观遗传阻滞的去除，随后重新激活多能性相关基因表达，因此产生高可塑性细胞^{1，2，3，8，10}，以下称为"表观遗传擦除细胞"。在第二步中，将细胞封装在3D培养系统中。为此，将非反应性疏水性合成化合物聚四氟乙烯（PTFE;粒径为1μm）用作微生物反应器，其允许创建通过使用传统2D培养系统无法实现的细胞微环境¹⁰。PTFE粉末颗粒粘附在液滴的表面，其中细胞被重新悬浮并将液核与支撑表面隔离开来，同时允许内部液体和周围环境²⁴之间的气体交换。由此获得的"PTFE微生物反应器"，也称为"液体大理石"，鼓励细胞彼此自由相互作用，促进3D细胞^{重排25，26，27}，并通过生物机械测量相关线索¹⁰延伸并稳定地维持获得的高可塑性状态。

方案

所有研究均由米兰大学伦理委员会审查和批准。所有动物实验均按照美国国立卫生研究院（NIH）发布的《实验动物护理和使用指南》进行。从健康的成年个体中分离人类细胞已获得米兰Ospedale Maggiore Policlinico伦理委员会的批准。我们研究中的所有方法都是根据批准的指南进行的。

1. 皮肤成纤维细胞分离

注意:下面描述的所有程序都可以应用于从不同哺乳动物物种（包括小鼠，猪和人类）中分离的成纤维细胞。从7周龄的雄性小鼠中分离出鼠细胞，并在当地屠宰场收集猪皮组织。在书面知情同意后，从成年患者中分离出人类细胞。

1. 准备0.1%猪明胶溶液。
   1. 称取0.1克猪明胶，将其溶解在100毫升水中。使用前通过高压灭菌对明胶溶液进行灭菌。
   2. 通过加入1.5mL制备的溶液，用0.1%猪明胶涂覆35mm培养皿。在室温下孵育2小时。
2. 切下长约2-5厘米的哺乳动物（小鼠，猪和人类）皮肤活检，并将其置于含有2%抗生素抗真菌溶液的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。储存在+ 4°C直至使用。
   注意:活检收集必须在同意的情况下进行，并在伦理委员会批准后，根据既定指南进行。
3. 在含有2%抗生素抗真菌剂溶液的新鲜无菌PBS中广泛洗涤收集的活检液三次。
4. 收集最后一次洗涤的活检，并将其放入无菌的100毫米培养皿中。使用无菌手术刀将它们切成约2毫米³ 大小的碎片。
5. 在2小时孵育结束时，从35mm培养皿中除去多余的明胶溶液（在步骤1.1.2中描述），并使用无菌手术镊子立即将5-6个皮肤碎片放入每个预涂的培养皿中。
6. 通过在每个片段上加入100μL成纤维细胞分离培养基液滴（表1）来润湿片段。在37°C下在5%CO₂ 培养箱中培养。
   注意:为防止培养基蒸发，请将35 mm培养皿置于含有无菌水的100 mm或更大的培养皿中。确保盖上两个培养皿。
7. 培养24小时后，检查35mm培养皿中培养基的量。如果需要，加入500μL成纤维细胞分离培养基以保持碎片湿润。
8. 小心地取出培养基，并使用移液器至少每2天培养一次。
9. 当成纤维细胞开始从放置在35mm培养皿（在步骤1.5中描述）的皮肤碎片中生长出来并开始形成细胞单层（通常为6天）时。使用无菌手术镊子去除皮片，并在2 mL成纤维细胞分离培养基中培养。
10. 继续在37°C下在5%CO₂ 培养箱中培养细胞单层，直到80%汇合，每隔一天刷新培养基。

2. 成纤维细胞原代细胞系培养

1. 当成纤维细胞达到80%汇合时，小心地取出成纤维细胞分离培养基，并用含有1%抗生素抗真菌溶液的3mLPBS洗涤细胞三次。
2. 对于细胞分离，在培养皿中加入600μL0.25%胰蛋白酶- EDTA溶液，并在37°C下孵育3-5分钟。
3. 当细胞开始从培养皿中分离时，加入5.4mL成纤维细胞培养基以中和胰蛋白酶（表1）。
4. 通过重复和温和的移液去除细胞。在新培养皿（不含明胶）中培养细胞，将传代比保持在1:2和1:4之间（取决于生长速率）。
   注:无需离心。
5. 将细胞保持在培养物中，每2天更换一次培养基，直到它们达到80%汇合并传代。
   注意:每周繁殖两次成纤维细胞，以保持剧烈生长。

3. 成纤维细胞暴露于5-氮杂-CR

1. 准备新鲜的1 mM 5-氮杂-CR储备溶液。
   1. 称取2.44毫克5-氮杂-CR并将其溶解在10毫升DMEM高血糖中。通过涡旋重悬粉末。用0.22μm过滤器对溶液进行灭菌。
      注意:5-氮杂-CR储备溶液必须在使用前立即制备。
   2. 通过在1mL成纤维细胞培养基中稀释1μL5-氮杂-CR储备溶液（3.1.1.）来制备5-氮杂-CR工作溶液。
      注:5-氮杂-CR工作溶液的浓度为1μM^{1，2，3，8，9}。
2. 胰蛋白酶消化细胞如前所述（2.1.-2.3.）并通过重复和轻柔的移液来移出细胞。
3. 收集细胞悬浮液并将其转移到锥形管中。
4. 在室温下，在光学显微镜下使用计数室对细胞进行计数。计算重新悬浮细胞所需的培养基体积，以在补充有1μM 5-氮杂-CR的30μL成纤维细胞培养基中获得4×10⁴ 细胞（参见步骤3.1.2）。
   注意:要使用的配方取决于腔室的具体类型。
   
5. 在室温下以150 ×g 离心细胞悬浮液5分钟。除去上清液并用补充有1μM 5-氮杂-CR的成纤维细胞培养基重悬沉淀（参见步骤3.1.2）。对于要使用的成纤维细胞培养基的体积，请参见步骤3.4。
   注意:作为阴性对照，将细胞重悬于不含5-氮杂-CR的成纤维细胞培养基中相同浓度，并在PTFE粉末中进行细胞包封（步骤4.1.-4.13）。

4. PTFE微生物反应器中的成纤维细胞封装

1. 用聚四氟乙烯（PTFE）粉末填充35毫米培养皿以产生床（图1A）。
   注意:使用35毫米细菌培养皿，以避免液体大理石粘附。为了获得薄的疏水性和多孔外壳，使用平均粒径为1μm的PTFE粉末，并以最大研磨量为2.0 NPIRI生产。这允许创建透气的液体大理石。此外，半透明涂层有助于实时观察细胞聚集过程 较大的粒径导致高多分散性，从而导致蒸发升高，变形和球形损失，以及微生物反应器的过早溶解。
2. 将含有4 x 10^4个细胞 的30μL单滴（参见步骤3.4.- 3.5.）分配到粉末床上（图1B）。
3. 以圆周运动轻轻旋转35毫米培养皿，以确保PFTE粉末完全覆盖液滴表面，形成液体大理石微生物反应器（图1C）。
4. 使用1，000μL移液器吸头拾取液体大理石微生物反应器，在边缘切割，以适应大理石的直径（图1D，E）。将液体大理石微生物反应器板到干净的细菌培养皿上以稳定其（图1F）。
   注意:要产生摩擦力以抓住吸头内的大理石，请切割直径约略小于液体大理石直径的移液器吸头。
5. 将液体大理石微生物反应器从培养皿转移到96孔板（一个大理石/孔）中（图1G）。
6. 从孔的边缘慢慢加入100μL培养基。微生物反应器开始漂浮在培养基顶部（图1H）。
   注:由于PTFE疏水性的破坏，微生物反应器在直接液体接触时破裂。作为替代方法，液体大理石微生物反应器可以单独放置在35mm细菌培养皿中。在这种情况下，为了防止液体大理石蒸发，必须将含有微生物反应器的35毫米培养皿插入100毫米培养皿中，事先用无菌水等分
7. 将液体大理石微生物反应器在37°C下在5%CO₂培养箱中孵育^{18小时，2，3，8，9}。
   注意:1μm的PTFE粒径可以确保内部液体与周围环境之间的最佳气体交换。
8. 在5-aza-CR孵育18小时后，使用在边缘切割的1，000μL移液器尖端收集液体大理石微生物反应器（参见步骤4.5）。
9. 将微生物反应器置于新的35mm细菌培养皿中（图1D-F）。
10. 用针刺穿液体大理石并打破它。
11. 在立体显微镜下，用200μL移液器尖端回收形成的球体，在边缘切割（图1I，J）。
    注意:包裹在PTFE中的表观遗传擦除的细胞形成3D球形结构（每个液体大理石中都有一个聚集体）。
12. 为了评估对5-aza-CR响应的多能态的获得，通过定性PCR检查多能性相关基因表达OCT4，NANOG，REX1和SOX2的发作（表2）。
13. 继续执行协议的第二步，如下所述。

5. 在表观遗传学擦除细胞的PTFE微生物反应器中培养

1. 准备新鲜的ESC培养基（表1）。
2. 在含有ESC培养基的培养皿中转移类器官以洗涤5-氮杂-CR残留物（参见步骤5.1.-5.2）。
3. 准备含有PTFE粉末床的新的35毫米细菌培养皿（另见步骤4.1.
4. 使用200μL移液器吸头将单个类器官在30μL ESC培养基的液滴中分配到粉末床上，在边缘切割（参见步骤4.9）。5.3.).
5. 以圆周运动轻轻旋转35mm培养皿以形成新的液体大理石微生物反应器，使用1，000μL移液器尖端拾取它，在边缘切割，并将新形成的微生物反应器放入96孔板（一个大理石/孔）的孔中（参见步骤4.3.-4.6）。
6. 要漂浮微生物反应器，从孔的边缘加入100μL培养基以缓慢沐浴大理石（见注4.7）。
7. 将液体大理石微生物反应器在37°C下在5%CO₂ 培养箱中培养所需的时间。按照5.3.-5.7中描述的步骤，每隔一天更换一次培养基。
   注意:在本手稿中，提供了28天的类器官培养获得的结果。但是，如果需要，可以进行更长的培养期。

结果

本方案描述了从成体细胞生成和稳定维持哺乳动物多能细胞的所有步骤。这种方法已经成功地从不同的哺乳动物物种（即小鼠，猪和人类）中分离出成纤维细胞。这里报道的代表性结果是从所有细胞系获得的，无论来源物种如何。

形态学分析表明，在与去甲基化剂5-氮杂-CR孵育18小时后，成纤维细胞封装在PTFE微生物反应器（3D Post 5-aza-CR）聚集体中并形成3D球形结构，显示出均匀的尺寸几何形状，在所有三个物种中都考虑。（图2A-C，3D Post 5-aza-CR）。86.31±4.13%的包封细胞显着修饰其表型，显示出通常与高可塑性表型^{相关的特征8}。相比之下，培养到2D标准条件下的5-aza-CR细胞后，尽管用圆形或椭圆形取代了典型的成纤维细胞细长形状，但尺寸要小得多，具有较大的颗粒状细胞核，保留了单层分布（图2）。形态学变化伴随着3D和2D后5-氮杂-CR细胞中多能性相关基因表达的开始。...

讨论

在过去的几十年里，一些研究的重点是制定策略，使终末分化的细胞恢复到不那么投入和更高的宽容状态。这里描述的方案允许从成体成熟的终末分化细胞开始产生和长期维持多能细胞。该方法结合了两个独立的步骤，涉及诱导高允许状态，这是通过化学表观遗传擦除实现的，并使用3D培养系统确保其后续维护。

在PTFE包封的细胞中观察到的3D球体结构的形成（图2）与其他研究一致，表明PTFE能够有效地促进细胞聚集，促进嗅鞘细胞（OEC）球体结构²⁵ 的建立或3D环形聚集体²⁶的形成。这些形态学变化与多能性相关基因表达的开始平行（图3， 图4， 图5），与2D后5-aza-CR细胞相比，3D后5-aza-CR细胞中的水平显着更高（图3

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-巯基乙醇	Sigma-Aldrich	M7522	ESC 培养基的成分
5-氮杂胞苷	Sigma-Aldrich	A2385	5-氮杂-CR，用于成纤维细胞表观遗传擦除
腺苷	Sigma-Aldrich	A4036	ESC 培养基的核苷混合物成分
抗生素抗真菌溶液（100 次;	Sigma-Aldrich	A5955	成纤维细胞和 ESC 培养基组分
CFX96 实时荧光	PCR Bio-Rad Laboratories	NA	用于定量 PCR
胞苷	Sigma-Aldrich	C4654	用于 ESC 培养基的核苷混合物组分
DMEM、高葡萄糖、丙酮酸	Thermo Fisher Scientific	41966052	用于成纤维细胞分离和培养基
DMEM、低葡萄糖、丙酮酸	Fisher Scientific	31885023	用于 ESC 培养基
Dulbecco'磷酸盐缓冲盐水	Sigma-Aldrich	D5652	PBS;用于活检和细胞洗涤以及溶液制备
Dynabeads mRNA DIRECT 微量纯化试剂盒	Thermo Fisher Scientific	61021	mRNA 牵引
ESGRO 重组小鼠 LIF 蛋白	Sigma-Aldrich	ESG1106	ESC 培养基的组分
胎牛血清，合格，热灭活	Thermo Fisher Scientific	10500064	成纤维细胞和 ESC 培养基的成分
FGF-Basic （AA10-155） 重组人蛋白	Thermo Fisher Scientific	PHG0024	ESC 培养基的成分
猪皮明胶	Sigma-Aldrich	G1890	用于培养皿包衣
GeneAmp PCR 系统 2700	Applied Biosystems	NA	热循环仪，用于定性 PCR
全球 DNA 甲基化 ELISA试剂盒	CELL BIOLABS	STA-380	甲基化研究
GoTaq G2 Flexi DNA 聚合酶	Promega	M7801	定性 PCR
鸟苷	Sigma-Aldrich	G6264	用于 ESC 培养基的核苷混合物组分
Ham's F-10 营养混合物	Thermo Fisher Scientific	31550031	用于 ESC 培养基
KnockOut 血清替代物	Thermo Fisher科学	10828028	ESC 培养基的成分
KOVA 玻璃载玻片 10 带网格	Hycor Biomedical	87144	用于细胞计数
Leica MZ APO 体视显微镜	Leica	NA	用于类器官观察
L-谷氨酰胺溶液	Sigma-Aldrich	G7513	成纤维细胞和 ESC 培养基的成分
MEM 非必需氨基酸溶液 （100X）	Thermo Fisher Scientific	11140035	ESC 培养基
Millex-GS 0.22 µ 的成分;m 孔过滤器	Millipore	SLGS033SB	用于溶液灭菌
M-MLV 逆转录酶、RNase H Minus、点突变体	Promega	M3681	mRNA 逆转录
Multiskan FC 微孔板光度计	Thermo Fisher Scientific	51119000	用于 ELISA 板读数
Nikon Eclipse TE300 倒置相差显微镜	Nikon	NA	用于细胞观察
Perkin Elmer 热循环仪 480	Perkin Elmer	NA	逆转录
（四氟乙烯） 1 &μ 热循环仪;m 粒径	Sigma-Aldrich	430935	用于生成微型生物反应器
PureLink 基因组 DNA 小量试剂盒	Thermo Fisher Scientific	K182001	基因组 DNA 牵引
TaqMan 基因表达 Cells-to-CT 试剂盒	Thermo Fisher Scientific	AM1728	定量 PCR
胸苷	Sigma-Aldrich	T1895	用于 ESC 培养基的核苷混合物组分
组织培养皿 100X20 mm，标准	Sarstedt	833902	用于成纤维细胞分离
组织培养皿 35X10 mm，标准	Sarstedt	833900	用于成纤维细胞分离
组织培养皿 35X10 mm，悬浮	Sarstedt	833900500	用于液体大理石培养的细菌培养皿
组织培养板 96 孔，标准，F	Sarstedt	833924005	用于液体大理石培养
胰蛋白酶-EDTA 溶液	Sigma-Aldrich	T3924	用于成纤维细胞解离
管 15ml，120x17mm，PS	Sarstedt	62553041	用于细胞悬浮离心
尿苷	Sigma-Aldrich	U3003	用于 ESC 培养基的核苷混合物组分