利用免疫反应增强技术的超高速蛋白质印迹法

摘要

通过采用循环排空与补充（CDR）技术并结合免疫反应增强剂，改进抗原-抗体结合动力学，从而开发出一种超高速蛋白质印迹技术。

摘要

蛋白质印迹法（又称免疫印迹法）是生物医学研究中的一种经典方法，常用于确定特定蛋白质的相对分子大小、丰度以及翻译后修饰情况。该技术历史悠久，因其操作简便而被广泛使用。然而，蛋白质印迹实验过程耗时较长，通常需要数小时甚至数天才能完成，其中关键瓶颈在于抗体与膜上固定抗原结合所需的长时间孵育。这些孵育步骤之所以必要，是因为抗体从溶液主体扩散至膜上抗原的过程缓慢，导致膜附近的抗体浓度远低于溶液主体浓度。本文介绍了一种创新方法，通过对抗体溶液进行循环排空与补充（CDR），显著改善抗原结合效率，从而大幅缩短孵育时间。同时，我们还采用了免疫反应增强技术，以保持检测的灵敏度。将CDR方法与商用免疫反应增强剂联用，不仅提高了检测信号强度，还显著缩短了抗体孵育时间。由此建立的超高速蛋白质印迹法可在20分钟内完成，且灵敏度无任何损失。该方法适用于化学发光和荧光检测两种模式的蛋白质印迹实验。这一简单高效的实验方案使研究人员能够更高效地对大量样本进行蛋白质表达分析。

引言

Western blot（也称为免疫印迹）是一种在广泛科学与临床学科中强大且基础的技术。该技术用于检测蛋白质的存在、相对丰度、相对分子质量以及翻译后修饰¹。结合数字图像分析，该方法可可靠地分析蛋白质及其修饰的丰度²。尽管Western blot被常规使用，但它是一种耗时且劳动密集型的方法，需要抗体与膜进行长时间孵育。本文中，我们描述了一种改进的孵育方法，可在不牺牲灵敏度的前提下克服这一局限性。

在膜孵育过程中，抗体在溶液中自由移动，而抗原则固定在膜上。由于抗体与抗原具有高亲和力，其结合速率快于抗体从主体溶液向膜表面的扩散速率，从而形成一个低浓度的“耗竭层”（图1）。远处的抗体可能需要数小时才能通过被动扩散到达膜表面，这是导致该技术孵育时间较长的主要因素。这一现象被称为质量传递限制（mass transport limitation, MTL）³。已有研究提出，通过反复排空并更换含抗体的溶液，可破坏耗竭层，从而克服MTL⁴。本文中，我们设计了一种独特技术，将这种循环排空与补充（cyclic draining and replenishing, CDR）的概念应用于传统的蛋白质印迹（western blotting）实验流程，显著减弱了MTL的影响，并大幅缩短了所需的孵育时间。

为了在较短的孵育时间内保持检测灵敏度，我们采用了一种免疫反应增强技术，可加速抗原-抗体反应，从而提高信噪比⁵。目前市面上许多商用的免疫反应增强剂（IRE）由两种组分组成（溶液1和溶液2，参见材料表）。尽管IRE的专有成分或作用机制尚未公开，但我们先前研究发现，在固相结合实验中，IRE可降低抗原与抗体之间的解离常数，表明亲和力的提升至少部分介导了IRE的增强效应⁶。将CDR与IRE结合，可实现一种超高速的蛋白质印迹实验方案，在不牺牲灵敏度的前提下显著缩短整个实验时间。

方案

1. SDS-PAGE 及向 PVDF 膜转印

1. 通过 SDS-PAGE 根据相对分子大小分离蛋白质。
   注意：任何商用或自制凝胶系统均可使用。请遵循制造商提供的方案。
2. 将凝胶中分离的蛋白质转印至 PVDF 膜上。
   注意：常用的转印方法（半干式或湿式转印）均适用。请遵循制造商提供的方案。

2. PVDF 膜的封闭

1. 将膜置于适当的封闭缓冲液中，在室温下振荡孵育1小时。
   注意：应根据一抗和检测系统选择合适的封闭缓冲液。例如，最常见的封闭剂包括BSA、脱脂奶粉、酪蛋白和商用合成聚合物。PBS和/或TBS中添加0.1% Tween20是最常用的缓冲液。此封闭步骤也可在4 ˚C下过夜进行。

3. 一抗孵育

1. 用蒸馏水配制10%免疫反应增强剂-1溶液（IRE-1），充分涡旋混匀。
2. 用10% IRE-1稀释一抗，轻轻且充分混匀。
3. 若使用较大的膜（4 cm × 8 cm – 8 cm × 8 cm），将8 mL抗体溶液加入50 mL锥形离心管中；若使用较小的膜（2 cm × 8 cm – 4 cm × 8 cm），将3 mL抗体溶液加入14 mL圆底聚丙烯管中（材料表）。
4. 用镊子夹取PVDF膜，短暂沥干封闭液。戴手套将PVDF膜放入管中，确保整张膜紧贴管壁。将PVDF膜插入管中时，应使原本与凝胶接触的“蛋白面”朝向管内侧。盖紧管盖。
5. 将50 mL管放入玻璃瓶中，置于杂交炉内。
   注意：若使用14 mL管进行此步孵育，需将14 mL管置于50 mL管内，并使用一对塑料环形支架将内管固定在50 mL管中央。
6. 打开杂交炉。
7. 以6 rpm转速孵育膜，至少5分钟。
   注意：确保膜始终紧贴管壁，且（内）管保持水平，使抗体溶液均匀覆盖膜表面。在正式实验前，需预先优化抗体稀释比例和孵育时间。

4. 膜洗涤

1. 停止旋转。
2. 用镊子小心地将PVDF膜从管中取出，并放入含有50 mL PBS-T的容器中。
3. 用PBS-T短暂漂洗膜。
4. 用蒸馏水在容器中漂洗膜，直至无气泡出现。此步骤旨在去除大部分抗体。
5. 将PVDF膜从容器转移至含有250 mL PBS-T的离心甩干器中。
6. 将滤篮放入甩干器中，并确保盖子已牢固盖好。
7. 启动甩干器，运行约20-30秒。
8. 弃去溶液，并用蒸馏水短暂冲洗甩干器内部。
9. 再次向甩干器中加入250 mL PBS-T。
10. 重复步骤4.6和4.7。

5. 二抗孵育

1. 用蒸馏水配制10%免疫反应增强剂-2溶液（IRE-2），充分涡旋混匀。
2. 用10% IRE-2稀释二抗溶液，轻轻且充分混匀。
3. 按照步骤3.3所述选择抗体溶液的体积和试管。
4. 用镊子夹取PVDF膜，短暂沥干溶液，然后按照步骤3.4所述将PVDF膜放入试管中。
5. 将50 mL试管放入玻璃瓶中，置于杂交炉内。
6. 打开杂交炉电源。
7. 以6 rpm转速孵育膜至少5分钟。确保膜始终贴附于管壁，且（内）管保持水平，使抗体溶液均匀覆盖膜表面。
   注意：在正式实验前应预先校准孵育时间。若二抗为荧光标记，应在避光条件下进行孵育。

6. 膜洗涤

1. 按照步骤 4.1 至 4.10 进行操作。

7. 图像采集

1. 化学发光检测
   1. 将一块半透明柔性膜（10 cm × 15 cm）放置在平坦的表面上。
   2. 在5 mL离心管中混合化学发光底物的两种组分。
   3. 立即将1.5 mL混合后的底物转移至半透明柔性膜上，并将PVDF膜置于其上，随后将剩余的底物溶液转移至膜上。
   4. 在半透明柔性膜上孵育PVDF膜与混合底物1分钟。
   5. 用镊子夹起PVDF膜，短暂沥干底物溶液。
   6. 将膜夹在两张透明膜之间。
   7. 在化学发光模式下采集图像。
2. 荧光检测
   1. 用镊子夹起PVDF膜，短暂沥干 溶液。
   2. 将膜夹在两张透明膜之间。
   3. 在荧光模式下采集图像。
      注意：步骤7.1和7.2应尽量在成像仪附近操作，以确保最大灵敏度。
   4. 当背景信号较高时，在含有80–100 mL PBS-T的容器中进行洗涤：一抗洗涤10分钟，重复3次；二抗洗涤5分钟，重复6次。
      注意：用10% IRE溶液稀释的一抗和二抗均可重复使用8–10次而不会降低灵敏度⁶。该溶液可在4 °C保存最多1个月。

结果

本示例说明了CDR方法结合免疫增强技术在Western印迹中的有效性。静态孵育在半透明柔性膜上进行，将PVDF膜与抗体溶液共同孵育；而CDR孵育则在杂交炉中通过旋转含有膜和抗体溶液的试管完成（视频）。图2分别展示了Western印迹化学发光检测所需的抗原和抗体用量。在静态孵育和CDR孵育中，使用IRE溶液均可提高检测灵敏度：在静态条件下，IRE将检测β-actin所需的最低细胞裂解物（抗原）量从2.2 µg降低至1.1 µg，而在CDR条件下进一步从1.1 µg降低至0.275 µg（图2A）。类似地，抗6x His标签抗体的最低检测浓度在静态条件下由100 ng/mL降至50 ng/mL，在CDR条件下则由100 ng/mL降至12.5 ng/mL（图2B）。与静态孵育（一抗60分钟，二抗30分钟）相比，CDR孵育仅需5分钟或10分钟即可显著降低检测限。最后，CDR与IRE联用即使在如此短暂的孵育时间内，仍表现出更优的Western印迹检测灵敏度（检测β-a...

讨论

Western blot 是一种广泛使用的分析技术，用于检测特定蛋白质，该技术约在40年前开发^7,8。自那时以来，该技术持续发展，后续的创新不断提高了其灵敏度、速度和定量能力^{2,9,10,11,12,13}。本文介绍的增强型超高速 Western blotting 方案对现有技术进行了多项重大改进。我们通过使用 IRE 降低检测阈值，在不牺牲灵敏度的前提下缩短了孵育时间。该方法无需特殊或昂贵的设备：在杂交炉中旋转离心管即可有效克服传质限制（MTL）。关键创新在于，CDR 能有效消除检测过程中的耗尽层。尽管滚筒培养装置常被用于减少溶液...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
14 mL 圆底高透明度聚丙烯试管，带刻度，带 snap cap	Falcon	352059
适用于激光打印机的 Apollo 透明胶片	N/A	N/A	任何类型的激光打印机透明胶片均可。
Azure 成像系统 600	Azure Biosystems	Azure 600	任何类型的图像采集系统均可用于化学发光和/或荧光检测。
Can Get Signal 免疫反应增强溶液	TOYOBO	NKB-101
CARNATION 即溶脱脂奶粉	Carnation	N/A
ECL 抗小鼠 IgG，与辣根过氧化物酶偶联的羊源 F(ab’)2 片段	GE Healthcare	NA9310V
ECL 抗兔 IgG，与辣根过氧化物酶偶联的驴源 F(ab’)2 片段	GE Healthcare	NA9340V
HYBAID Micro-4	N/A	N/A	任何杂交炉均可，只要能将试管在水平位置均匀旋转。
Immobilon-P PVDF 膜，0.45 µm 孔径	Millipore Sigma	IPVH304F0
IRDye 680RD 山羊抗小鼠 IgG 二抗	LICOR	926-68070
IRDye 800CW 山羊抗兔 IgG 二抗	LICOR	926-32211
KPL LumiGLO Reserve 化学发光底物	seracare	5430-0049
小鼠抗-ß 肌动蛋白抗体	Millipore Sigma	A5316
Odyssey 封闭缓冲液（PBS）	LICOR	927-40100	用于荧光检测的封闭缓冲液
OXO 沙拉脱水器	OXO	32480V2B	任何沙拉脱水器均可，只要能对 PVDF 膜进行充分冲洗且不造成撕裂。
Parafilm 密封膜	Bemis	Parafilm M PM996	半透明柔性薄膜
50 mL 圆锥底离心管用聚乙烯平顶螺旋盖	Falcon	352070
用于将 14 ml 试管固定在 50 ml 试管中心的环状支架	N/A	N/A	在机加工车间制备
兔抗 6X His 标签抗体	Abcam	ab9108
Tween20	Millipore Sigma	P2287