土壤中不稳定的无机植物养分与污染物的二维可视化与定量分析

Stefan Wagner; Christoph Hoefer; Thomas Prohaska; Jakob Santner

doi:10.3791/61661

方法文章

土壤中不稳定的无机植物养分与污染物的二维可视化与定量分析

DOI：

10.3791/61661

⸱

2020年9月1日

Stefan Wagner¹ , Christoph Hoefer² , Thomas Prohaska¹ , Jakob Santner¹^,³

¹Department General, Analytical and Physical Chemistry, Chair of General and Analytical Chemistry, Montanuniversität Leoben, ²Department of Forest and Soil Sciences, Institute of Soil Research, Rhizosphere Ecology and Biogeochemistry Group, University of Natural Resources and Life Sciences, Vienna, ³Department of Crop Sciences, Institute of Agronomy, University of Natural Resources and Life Sciences, Vienna

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案介绍了一种利用薄膜扩散梯度（DGT）结合质谱成像技术，对多种不稳定的无机营养元素和污染物溶质进行亚毫米级二维可视化的实验流程。文中详细描述了溶质采样及高分辨率化学分析方法，用于对陆生植物根际溶质进行定量分布图谱绘制。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们介绍一种用于在亚毫米级（约100 µm）空间分辨率下，对植物根系周围土壤（即“根际”）中不稳定态（即可逆吸附的）无机养分（如P、Fe、Mn）和污染物（如As、Cd、Pb）溶质种类的分布进行二维（2D）可视化与定量分析的方法。该方法结合了基于汇效应的溶质采样技术——薄膜扩散梯度法（DGT），以及空间分辨的激光剥蚀电感耦合等离子体质谱（LA-ICP-MS）化学分析技术。DGT技术依赖于含有均匀分布的分析物选择性结合相的薄层水凝胶。多种可用的结合相使得通过简单的凝胶制备流程即可制备不同类型的DGT凝胶。在将DGT凝胶部署于根际时，植物被种植于扁平透明的生长容器（根际盒）中，从而实现对土壤中生长根系的最小侵入性接触。经过一段预培养期后，将DGT凝胶贴附于根际中选定的目标区域，进行原位溶质采样。随后回收DGT凝胶，并制备用于后续LA-ICP-MS线扫描成像对所结合溶质的化学分析。通过使用¹³C进行内部归一化，并利用基质匹配的凝胶标准品进行外部校准，可进一步实现对二维溶质通量的定量分析。该方法的独特之处在于能够生成土壤-植物环境中多元素溶质通量的定量、亚毫米尺度的二维图像，其空间分辨率显著优于其他用于测量根际溶质梯度的方法。本文展示了该方法在陆生植物根际中对多种阳离子和阴离子溶质种类成像的应用与评估，并强调了该方法与其他互补性溶质成像技术联用的可能性。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作物植物对养分的获取是决定其生产力的关键因素。人们已对作物高效吸收养分的过程进行了深入研究，特别是土壤-根际界面（即根际）中调控养分对植物根系有效性和养分进入根系内部的机制，在作物养分获取中具有重要作用。植物养分吸收的重要过程包括：养分向根部的运输；土壤孔隙水中溶解态养分与固相土壤表面结合态养分之间的动态吸附平衡；微生物对养分的竞争；土壤有机质中所含养分的微生物矿化作用；以及养分进入根部共质体的内部化过程。无机痕量金属（类）污染物的吸收在很大程度上也受相同机制的控制。

根据养分和污染物的可利用性、植物需求以及在土壤中的扩散性，可以在根际观察到不同的养分分布模式。对于吸附性强且内部化速率相对较高的元素（如 P、Fe、Mn、Zn、As、Cd、Pb），其根际中可移动态（即可逆吸附态）元素含量较主体土壤降低，耗竭区宽度通常≤1 mm；而对于移动性较强的养分如 NO₃^-，耗竭区可延伸至数厘米¹。此外，当某些元素（如 Al 和 Cd）的可利用性超过植物吸收速率时，已在根际中观察到其积累现象²^,³。

鉴于根际过程在养分和污染物循环中的重要性，目前已开发出多种可在高空间分辨率下测定植物可利用元素形态的技术⁴^,⁵。然而，由于多种原因，小尺度下活性溶质分布的测量仍面临挑战。主要难点在于，需要在活体植物根系周围特定位置采集极小体积（低至 µL 量级）的土壤和/或孔隙水样品，以解析根际中陡峭的养分梯度。解决该问题的一种方法是使用微孔负压抽吸装置提取孔隙水样品⁶。A. Göttlein、A. Heim 和 E. Matzner⁷ 利用该方法，在约 1 cm 的空间分辨率下测定了欧洲栎（Quercus robur L.）根系附近土壤孔隙水中的养分浓度。分析 µL 量级土壤或土壤溶液样品的难点在于，这些微小样品体积，结合除主要营养元素外普遍较低的浓度，要求采用高灵敏度的化学分析技术。

另一种可分辨低至约 0.5 mm 尺度营养梯度的系统，是在土壤块表面培养一层根系垫，根系与土壤之间由一层薄的亲水性膜隔开⁸^,⁹。在此配置中，溶质可穿过该膜，根系可从土壤中吸收养分和污染物，同时根系分泌物也可扩散进入土壤。在致密根层形成后，可对土壤块进行取样并切片，以获取用于后续元素形态提取的土壤样品。通过该方法，可分析在相对较大面积（约 100 cm²）上平均的一维养分和污染物梯度。

另一个挑战是获取不稳定的、植物可利用元素组分的样品，因为大多数化学土壤提取方法与植物吸收养分和污染物的机制存在显著差异。在许多土壤提取方案中，土壤与提取剂溶液混合，旨在建立溶解态与吸附态元素组分之间的（准）平衡状态。然而，植物会持续吸收养分，因此通常会不断耗尽根际土壤中的养分。尽管平衡提取法因其操作简便而被广泛用作土壤检测方法，但所提取的养分组分往往不能很好地代表植物实际可利用的养分部分¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³。相比之下，提出了一类能够持续从土壤中移除养分的“汇式”方法，这类方法被认为具有优势，因其可模拟根系吸收过程，更接近植物养分吸收的真实机制¹⁰^,¹¹^,¹⁴^,¹⁵。

除了上述方法之外，针对特定元素和土壤（生物）化学参数，已开发出能够测量连续参数图谱的真实成像应用，其分辨率可达 ≤100 µm，成像视野可达数 cm²⁵。只要存在合适的放射性同位素，放射自显影技术即可用于成像根际中的元素分布¹⁶。平面光极技术可用于可视化重要的土壤化学参数，如 pH 和 pO₂¹⁷^,¹⁸^,¹⁹，而酶活性或总蛋白分布则可通过荧光指示剂成像技术（如土壤酶谱法²⁰^,²¹^,²²^,²³）和/或根系印迹法²⁴进行绘图。尽管酶谱法和放射自显影技术一次仅能测量单一参数，但利用平面光极技术可同时进行 pH 和 pO₂ 的成像。较为传统的根垫技术仅能提供一维信息，而微型吸管技术则仅能提供点测量或低分辨率的二维信息，但这两种方法均支持多元素分析。最近，P. D. Ilhardt, 等人²⁵ 提出了一种新方法，利用激光诱导击穿光谱技术（LIBS），在经过精细样品制备以保持自然元素分布的土-根芯样品中，以约 100 µm 的分辨率绘制二维多元素总量分布图。

目前唯一能够以高空间分辨率对多种营养物质和污染物溶质进行靶向二维采样的技术是薄膜扩散梯度（diffusive gradients in thin films, DGT）技术，这是一种基于汇的采样方法，可在嵌入水凝胶层中的结合材料上原位固定活性态痕量金属（类）物种²⁶^,²⁷。DGT最初被提出作为一种化学形态分析技术，用于测定沉积物和水体中的活性溶质，随后很快被应用于土壤研究²⁸。该技术可实现亚毫米尺度的多元素溶质成像，最早在河流沉积物中得到验证²⁹，并进一步发展用于植物根际环境的研究³⁰^,³¹^,³²^,³³。

进行DGT采样时，将一块尺寸约为3 cm × 5 cm的凝胶片贴附于生长在土壤块表层的单根植物根系上，凝胶与土壤之间由一层亲水性膜隔开。在接触期间，土壤中活性的养分和/或污染物会扩散进入凝胶，并立即被凝胶中所含的结合材料固定。通过这种方式，在采样期间于凝胶处建立起浓度梯度，从而形成并维持持续向凝胶方向的净扩散通量。采样结束后，可将水凝胶取下，并采用可实现空间分辨分析的分析化学技术进行检测。其中一种高度专业化且常用的技术是激光剥蚀电感耦合等离子体质谱法（LA-ICP-MS）。在一些早期研究中，也曾使用微束粒子诱导X射线发射技术（PIXE）²⁹。DGT采样结合LA-ICP-MS分析可实现空间分辨率达~100 µm的多元素化学成像。若采用高灵敏度的ICP-MS技术（例如扇形磁场ICP-MS），可达到极低的检测限。在一项关于石灰施用对玉米吸收锌和镉影响的研究中¹⁵，我们成功在未受污染的土壤中对玉米根际活性镉进行了成像，其检测限低至每凝胶面积38 pg cm^-2 Cd。DGT、平面光极（planar optodes）和酶谱法（zymography）均依赖目标元素从土壤向凝胶层的扩散过程，这一共性可被用于多种方法的联合应用，以同时或依次成像大量与植物养分及污染物吸收相关的参数。有关DGT成像的分析化学特性、DGT与其他成像方法联用的潜力及其应用的详细信息，已在参考文献³⁴^,³⁵中进行了全面综述。

本文介绍了在非饱和土壤环境中，利用DGT技术对陆生植物根系进行溶质成像实验的操作方法，包括植物培养、凝胶制备、凝胶施用、凝胶分析及图像生成。所有步骤均进行了详细阐述，并包含关键步骤的注意事项和实验替代方案。

方案

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1. DGT 凝胶的制备

注意：目前有多种DGT凝胶可用于在高（亚毫米级）空间分辨率下对活性溶质物种进行二维成像³⁵。本文简要总结了三种在溶质成像应用中已得到充分表征的高分辨率（HR）-DGT结合凝胶的制备方法。痕量元素分析的实验操作流程，以及所提及的所有HR-DGT凝胶的详细制备步骤，详见支持信息（SI）第S1和S2节。

基于聚氨酯的混合阴离子和阳离子结合凝胶（HR-MBG；SI S2.1）³¹
1. 制备含有均匀分散的氢氧化锆(IV)和亚氨基二乙酸（IDA）相的聚氨酯凝胶悬浮液。
2. 将凝胶悬浮液在玻璃板上涂布成一层薄膜，通过溶剂蒸发启动凝胶形成，获得厚度为0.1 mm、耐撕裂的混合阴离子和阳离子结合凝胶（HR-MBG）。
聚丙烯酰胺-氧化锆阴离子结合凝胶（HR-ABG；SI S2.2）³⁶
1. 制备0.4 mm厚的琼脂糖交联聚丙烯酰胺凝胶（APA），遵循既定的凝胶浇铸流程³⁷ (参见 SI S2.4 有关 APA 制备的详细方案）。
2. 将氢氧化锆（IV）沉淀相加入预制的 APA 凝胶中，以制备厚度为 0.4 mm 的阴离子结合凝胶（HR-ABG）。
聚丙烯酰胺-亚氨基二乙酸阳离子结合凝胶（HR-CBG；SI S2.3）³⁸
1. 制备含有均匀分散IDA相的聚丙烯酰胺凝胶悬浮液。
2. 将凝胶浇注于两块玻璃板之间，启动聚合反应，制备厚度为0.4 mm的阳离子结合凝胶（HR-CBG），使IDA相沉积于凝胶的一侧。

2. 植物培养

注意：该实验系统使用根际箱⁴（图1）在非饱和土壤中培育植物，以进行溶质成像。首先描述根际箱的土壤填充与浇水过程，然后介绍实验植物生长的详细步骤。根际箱的设计细节以及填装前土壤基质的制备方法详见SI部分S3。

根际装置组装示意图；显示尼龙螺丝、导轨结构、浇水孔；用于植物生长研究。
图1：根际装置设计（未按比例绘制）。（A）根际生长容器的爆炸图。（B）植物生长期间已组装的根际装置。请点击此处查看此图的放大版本。

根际室土壤填充
1. 在将预湿润土壤（已知重力含水量， $环境研究背景下土壤含水量公式 $ W_{soil} $ 的方程。$ ；参见SI S3.2）填充至根际室之前，使用胶带封闭根际室背面的浇水孔，并取下前板及其固定导轨和螺丝。
2. 称量空根际室（不含前板、导轨和螺丝）、8块5 cm × 11 cm的亚克力板以及16个夹子（材料表），并记录总重量。
3. 在根际室底部使用两个夹子在两侧固定一块小亚克力板，夹子的压力应作用于根际室框架上，以防止该板向内弯曲，从而保持体积恒定。
4. 将根际室略微倾斜朝向小塑料板一侧，填充预湿润土壤至约4 cm高度（图2A）。通过轻微晃动根际室使土壤分布均匀，并使用压实工具轻轻压实数毫米（根据具体土壤特性而定）（图2B）。
5. 重复步骤2.1.3–2.1.4，直至根际室完全填满土壤（图2C）。顶部预留约3 cm空间，以便后续将幼苗种植到根际室中。
6. 称量已填充土壤的根际室（包括8块小板和16个夹子）并记录重量。从中减去步骤2.1.2测得的空根际室重量，记录差值，即根际室中湿润土壤的质量， $用于土壤阻力计算的数学变量 "m_{m,soil rt}"，用于方程中。$ （g）。
7. 根据公式1计算根际室中干土质量，（g），再根据公式2计算根际室中干土容重，（g cm^-3）。
  
  其中，（cm³）为根际室的总内部体积。
  注：根际室中典型的值介于1.0–1.4 g cm^-3之间。不得超过1.5 g cm^-3，因为超过此值可能阻碍根系生长。
8. 将装有土壤的根际室放置在支撑箱上，并从根际室上移除所有夹子和小板（图2D）。使用纸巾小心清洁根际室框架（即边缘），因为残留的土壤颗粒可能导致泄漏。
  注：暴露的土壤表面必须均匀、平整并与根际室框架齐平，不得有任何裂缝或间隙。若不符合要求，则清空根际室并重复步骤2.1.2–2.1.8。
9. 将两片聚四氟乙烯（PTFE）（材料表）箔裁剪为每片22 cm × 13 cm。此外，另裁剪一片塑料箔为46 cm × 15 cm。记录PTFE箔与塑料箔的总重量。将第一片PTFE箔置于根际室中暴露土壤表面的上半部分，使其在根际室顶部超出土壤表面约1 cm。
10. 使用胶带小心地将PTFE箔固定在根际室框架上（图2E）。首先固定根际室顶部的一个角，接着固定其对角，最后固定下方的两个角。在固定第2至第4个角时施加张力，以确保箔片表面平整。若出现褶皱，应逐个角打开并重新固定胶带（不要一次性全部重贴），直至所有褶皱消除，PTFE箔与土壤表面完全贴合且平整。
11. 将第二片PTFE箔放置在根际室的下端，与上方的PTFE箔重叠约1 cm。重复步骤2.1.10，将第二片PTFE箔固定在根际室上。
12. 将塑料箔（46 cm × 15 cm）覆盖在PTFE箔上。按照步骤2.1.10所述方法固定塑料箔。
13. 将前板安装到已填充土壤并覆盖箔片的根际室上。在根际室两侧各安装一条导轨，并用手拧紧螺丝以固定导轨，从而将前板固定在根际室上。螺丝应朝向根际室封闭的一侧，即带有浇水孔的一侧（图1A）。

用于根系研究的土壤、丙烯酸板和夹具的根际室装置。显示组装过程的示意图。
图 2：用于根际溶质成像的土壤植物培养根际室的组装与填充。（A）向根际室中填充土壤。（B）使用压实工具对填充的土壤进行压实。（C）填充土壤后的根际室，带有小型丙烯酸板和夹具。（D）填充土壤后暴露土壤表面的根际室。（E）部分覆盖保护性聚四氟乙烯（PTFE）薄膜的填充土壤根际室。请点击此处查看该图的放大版本。

柳树插条、土-根界面、DGT凝胶、PTFE箔片装置的根系生长实验示意图。
图3：根际箱操作与DGT凝胶应用。（A）使用10 mL移液器吸头通过根际箱背面的注水孔对土壤进行浇水。（B）将幼苗（以绿色斑点表示）种植到已填满土壤并封闭的根际箱中。（C）种植了Salix smithiana插条的根际箱，已移除前板和塑料箔覆盖层。（D）在应用DGT凝胶前小心剥离PTFE箔覆盖层。（E）土-根界面感兴趣区域（ROI）的高分辨率照片。（F）将装有DGT凝胶的前板安装到根际箱上。（G）溶质采样过程中已施加DGT凝胶的感兴趣区域（ROI）照片。请点击此处查看该图的放大版本。

浇灌土壤
1. 测定根际箱中实验土壤的持水能力（WHC）。为此，制作两个底部开放的根际箱，并按照第2.1节所述填充土壤。将这些底部开放且装有土壤的根际箱浸入盛水容器中16小时以完全饱和，随后排水8小时。
2. 从底部开放的根际箱中随机位置采集约50 g的混合土壤样品，在105 °C下烘干，根据公式S1测定 $Soil moisture content formula $ W_{soil} $ equation in an environmental study context.$ 。所测定的 $Soil moisture content formula $ W_{soil} $ equation in an environmental study context.$ 即为土壤的WHC，因此以（g g^-1）表示。
3. 确定实验根际箱中的目标 $Soil moisture content formula $ W_{soil} $ equation in an environmental study context.$ 。在生长阶段，将 $Soil moisture content formula $ W_{soil} $ equation in an environmental study context.$ 设定为WHC的60%（即WHC因子，），以向植物提供充足的水分，同时避免根际箱内出现缺氧条件。
4. 根据公式3计算需添加的总水量（g），以将根际箱中的土壤灌溉至目标 $Soil moisture content formula $ W_{soil} $ equation in an environmental study context.$ 。需计入根际箱土壤中已存在的水的质量（g）。
  $Equation for water content calculation, formula: $ m_{w,add} = f_{WHC} \times W_{WHC} \times m_{d,soil \, rt} - m_{w,soil \, rt} $.$
5. 将除以根际箱浇水孔的数量（此处为14个），得到每个浇水孔需添加的水量。通过将10 mL移液器吸头插入浇水孔，利用重力使水流入土壤（图3A）。
植物生长
1. 根据实验植物种子的特定萌发要求，将其预萌发（例如在湿润滤纸上），直至胚根伸出（长度达1 cm以内）。
2. 如图3B所示，将最多两株幼苗种植到根际箱中。种植时，直接向幼苗添加约5 mL水以支持其生长。种植后最初约两天内，用透明保湿膜覆盖根际箱顶部开口（材料表）。用铝箔包裹根际箱，以防止微生物生长。
  注：除幼苗外，植物插条也可在根际箱中培养。
3. 将种植后的根际箱转移至生长室，环境条件（即温度、湿度、光照强度）应设置为满足特定植物需求。将根际箱倾斜25°–35°，以确保根系通过向重力性沿前板发育。
4. 在植物生长期间，通过每2–4天定期使用根际箱浇水孔进行称重法灌溉，维持根际箱中目标含水量，具体操作见2.2.5节。通过定期添加约5 mL水，保持根际箱顶部开口处土壤表面湿润。
  注：若植物生长周期较长，且预计植物生物量会显著减少按该方法添加至根际箱的水量，则应通过在独立的根际箱重复实验中种植植物，并在规定时间间隔收获并称量植物组织，来校正植物生物量的重量影响。
5. 当根系沿前板到达合适位置时（优先选择根际箱中心区域），应用DGT凝胶采样根际溶质分布。

3. 溶质分布的取样

凝胶施加
1. 在凝胶施加前24小时，将根际室（rhizotron）中的土壤含水量 $环境研究背景下土壤含水量公式 $ W_{soil} $ 的方程。$ 从60% 提高至80% ，具体操作见2.2.4–2.2.5节。此步骤可确保良好的土壤-凝胶接触，促进溶质向凝胶扩散，同时避免取样期间土壤出现缺氧条件。
2. 取一块新的、经酸清洗的前板，将其对准用于取样的根际室，并在板上标记感兴趣区域（ROIs）。将该板转移至超净工作台或其他无尘、无金属污染的环境中，未标记面朝上放置。
3. 使用聚四氟乙烯（PTFE）涂层剃刀片，在丙烯酸支撑板上将DGT结合凝胶切割成与感兴趣区域相对应的矩形尺寸，通常约为3 cm × 5 cm。切割时应通过按压而非滑动刀片的方式进行，以确保切口清晰。将矩形凝胶片放置于前板未标记面的已标记感兴趣区域位置。
  注：若使用高分辨率分子印迹凝胶（HR-MBG），可在凝胶下方添加一层100 µm厚的间隔箔，以确保凝胶与土壤-根系系统良好接触。
4. 将一片10 µm厚的聚碳酸酯膜（孔径0.2 µm；材料表）裁剪至每边比凝胶大≥1 cm的尺寸，并将其覆盖在凝胶上。加入少量水以排除层间气泡。
5. 使用乙烯基电工胶带（材料表）固定膜的四周边缘。在此过程中，使用塑料镊子小心去除凝胶与膜之间的气泡。胶带仅可接触膜，不得接触凝胶。
  注：若胶带接触到凝胶，或凝胶与膜之间残留气泡，或最终膜表面出现褶皱，则溶质向凝胶的扩散通量可能受到影响³⁵，需重新组装凝胶/膜组件（重复步骤3.1.3–3.1.5）。
6. 将根际室置于支架上，移除导轨并小心取下前板（图3C）。去除塑料膜，沿根际室边缘剪除PTFE膜，并缓慢剥离PTFE膜，避免扰动土壤-根系系统（图3D）。
7. 使用数码单反相机（DSLR）（材料表）对感兴趣区域拍摄正交照片，以便基于土壤结构和根系形态解释和展示溶质分布情况（图3E）。建议使用相机支架，如有条件可配备微距镜头。调整相机位置，使照片中心与感兴趣区域中心对齐，且相机焦平面与土壤表面平行。照片中应包含比例尺（例如直尺）。
8. 将装有凝胶/膜组件的前板安装到打开的根际室上（图3F）。操作时，先将板的一边与根际室边缘对齐，然后轻轻将板“弯”向土壤。此种施加方式有助于避免凝胶/膜组件与土壤-根系系统之间产生气泡。使用导轨和螺丝固定前板。
  注：此步骤至关重要，必须谨慎操作。一旦凝胶/膜组件与土壤-根系系统接触后，前板不可再移动，否则会导致土壤和根系位移。
9. 准确记录凝胶布设的起始时间，并按步骤3.1.7所述对感兴趣区域的已布设凝胶拍照（图3G）。用铝箔包裹根际室，转移至生长室直至溶质取样期结束（通常为24小时）。
凝胶回收
1. 将根际室置于支撑盒上，小心取下前板，并用水冲洗板上的凝胶/膜组件，以去除附着颗粒（图4A）。准确记录凝胶布设的结束时间。从感兴趣区域采集土壤样品，根据公式S1测定根际室中实际的 w_soil。
2. 将前板转移至超净工作台，使凝胶/膜组件朝上。使用塑料镊子小心先拆除四周边缘的胶带，再取下覆盖在凝胶上的聚碳酸酯膜（图4B）。加入适量水，使凝胶在板上形成一层薄水膜后自由漂浮，土壤接触面朝上。
  注：必须始终注意凝胶的方向。暴露于土壤和根系的凝胶面必须始终保持朝上（面向操作者）。
凝胶干燥
1. 裁剪一块矩形的凝胶吸水纸（材料表），在其上放置一块略小的聚醚砜膜（孔径0.45 µm；材料表）。
2. 使用塑料镊子将凝胶从板上转移至凝胶吸水纸/膜组件上，土壤接触面朝上。凝胶应处于松弛状态（即未被拉伸），完全平整，且凝胶与膜之间无气泡。可在凝胶吸水纸/膜组件上加少量水，以利于凝胶的转移和定位。
3. 用一片塑料膜完全覆盖凝胶吸水纸/膜/凝胶组件，并在塑料膜上标记凝胶样品编号及其方向（图4C）。将凝胶吸水纸/膜/凝胶/塑料膜组件放入真空凝胶干燥仪（材料表）中干燥，直至组件完全脱水（通常需48–72小时）。对于HR-MBG，设定温度为50–55 °C；对于HR-ABG和HR-CBG，建议在室温下干燥。
4. 从干燥后的组件上移除凝胶吸水纸，将已与聚醚砜膜不可逆结合的凝胶转移至自封袋中。塑料膜覆盖物应保留在凝胶上，直至激光剥蚀电感耦合等离子体质谱（LA-ICP-MS）分析前片刻再移除。
5. 取原始凝胶片中的一小块作为方法空白样，该样品不接触土壤。空白样凝胶应与样品凝胶一样，按照步骤3.3.2–3.3.4进行处理。

开放根际培养装置中DGT凝胶装置、用吸水纸提取的操作、膜覆盖过程。
图4：溶质采样后DGT凝胶的回收及干燥前处理。（A）溶质采样结束后，带有DGT凝胶的平板与根际培养装置。（B）在层流工作台中从平板上取出DGT凝胶。（C）用于凝胶干燥的吸水纸/聚醚砜膜/DGT凝胶/塑料薄膜覆盖的叠层结构。注意：凝胶在根际土壤上使用后略带颜色。请点击此处查看该图的高清版本。

4. DGT 结合凝胶的化学分析

注意：在本方案中，通过配备双体积烧蚀池的纳秒193 nm ArF准分子激光剥蚀系统（LA）与四极杆ICP-MS联用，对DGT结合凝胶上的溶质分布进行分析（图5）。所有仪器均列于材料表中。也可使用纳秒213 nm或266 nm固体激光剥蚀系统³⁶^,³⁹^,⁴⁰^,⁴¹^,⁴²^,⁴³。若需要更高的灵敏度或质量分辨率，可选用扇形磁场ICP-MS替代四极杆ICP-MS¹⁵^,⁴⁴。DGT凝胶标准品的制备用于外部校准，以及激光剥蚀系统与四极杆ICP-MS的联用细节详见支持信息部分S4和S5。

用于元素分析的激光剥蚀ICP-MS装置，包括剥蚀室、LA软件和凝胶样品。
图5：用于DGT凝胶分析的LA-ICP-MS装置。（A）纳秒级193 nm ArF准分子激光剥蚀系统与四极杆ICP-MS。（B）干燥后的凝胶固定在玻璃板上，并安装于激光剥蚀进样台，准备送入剥蚀室。（C）来自ICP-MS的雾化气（Ar）与来自剥蚀室的气溶胶载气（He或Ar）通过一个双向Y型三通接头和炬管适配器连接至ICP。请点击此处查看该图的高清版本。

LA-ICP-MS 样品制备
1. 将干燥的凝胶样品、标准品和方法空白（均与聚醚砜膜支撑体合并）转移至双面胶带的各个独立区域上，凝胶面朝上（材料表）。裁剪多余的胶带部分，以节省烧蚀池内的空间。
2. 将干燥的凝胶固定在玻璃板上。每个凝胶样品、标准品系列或方法空白应使用单独的玻璃板，以便在激光烧蚀（LA）样品台（典型尺寸为 10 cm × 10 cm）上灵活排列。根据需要使用玻璃刀调整玻璃板尺寸。使用黏土（材料表）将带有凝胶的玻璃板固定在 LA 样品台上（图 5B）。通过调节样品台底座使凝胶表面水平，并将样品台锁定至烧蚀池中。
LA-ICP-MS 线扫描分析
1. 按照 SI 第 S5 节 中的说明将 LA 系统与 ICP-MS 耦合。在 LA 软件（材料表）中设置相机光源参数（即“环形”、“同轴”和“透射”），以照亮烧蚀池中的凝胶表面，并通过调节 z 轴距离对凝胶表面进行聚焦。在烧蚀池内移动至多个随机位置，确保所有凝胶表面均处于焦点范围内。
2. 在 LA 软件的“激光设置”窗口中设定 LA 参数。DGT 凝胶 LA-ICP-MS 线扫描分析中常用的典型参数为：连续模式；能量输出 20–30%；重复频率 10–20 Hz；光斑直径 100–200 µm；扫描速度 150–250 µm s^-1。
  注：参数需根据所用凝胶类型进行优化，可能有所不同。也可根据实验和仪器配置，优化参数以提高信噪比、空间分辨率或缩短采集时间。应使用相对较低的能量输出（≤40%）和重复频率（≤25 Hz），以避免激光穿透凝胶进入背衬材料³⁹。确保激光扫描速度 ≤ 光斑直径除以 ICP-MS 总扫描周期时长（见 4.2.6），以避免数据点压缩，从而防止扫描方向分辨率下降⁴⁵。例如，当设定光斑直径为 200 µm，ICP-MS 总扫描周期时长为 0.25 s 时，扫描速度应 ≤800 µm s^-1。
3. 选择线工具，并在凝胶标准品上绘制一条约 1 mm 长的单一线条图案。在“扫描图案”窗口中右键点击该线条图案，确认已采用 4.2.3 中设定的 LA 参数。使用“复制扫描”工具将此线条复制四次，线间距离（线条中心之间的距离）应大于光斑直径（图 6）。该方法可为每个凝胶标准品提供总共五条平行线（n = 5）。对每个凝胶标准品、校准空白和方法空白重复此步骤。
4. 移动至凝胶样品位置，在待分析矩形区域的上边缘绘制一条单线。根据 4.2.3 中的设定，复制该线条以生成整个样品区域的平行线，线间距离设为 300–400 µm。确保每条线的起点和终点处的焦距（z 轴距离）设置正确。
  注：分析的空间分辨率在扫描方向上高于线间方向。因此，线条的起点和终点最好沿分析物梯度方向排列。对于根际梯度，通常应垂直于根轴方向（图 6）。
5. 在 ICP-MS 软件（材料表）的“方法”界面中，设置一个时间分辨的“仅数据”方法，为每种分析物选择一个或多个合适的同位素，并将 ¹³C 作为内标归一化标准³¹^,³⁶^,⁴⁰^,⁴¹^,⁴²。确认同位素检测不受干扰影响⁴⁶。
6. 将 ICP-MS 方法的总扫描周期时长（“预计读取时间”）设置为 ≤0.5 s，并为每个同位素设置适当的驻留时间（通常为 10–50 ms）。将 ICP-MS 的“读数”设为 1，并更改“每重复读数”值以设定每个样品（即每条单独烧蚀线）的总测量时间（“预计采样时间”）。该时间取决于 4.2.2–4.2.4 中设定的具体 LA 参数和线间距。
7. 数据采集采用强度-时间模式，并将“文件写入选项”设为“每样品新建”，以便为每条烧蚀线生成独立的数据文件（此处为 .xl 文件）。
8. 在 ICP-MS 的“样品”界面中设置“批处理”样品序列，每个样品条目对应 4.2.3–4.2.4 中设定的单条烧蚀线。
9. 点击“分析批处理”以启动 ICP-MS 上的样品序列，ICP-MS 将等待数据采集，直至接收到首个激光脉冲触发信号（触发配置详见 SI S5）。
10. 在 LA 软件中选择所有待分析的线条，并确认 ICP-MS 方法（“预计采样时间”，见 4.2.6）与各条烧蚀线的持续时间匹配，凝胶样品、标准品和方法空白的烧蚀时间通常不同。如有必要，重复 4.2.6 步骤以调整 ICP-MS 方法。
11. 在“激光能量”窗口中点击“发射”以重启激光头，然后点击“运行”打开“运行实验”窗口。在此选择“仅选定图案”，将“清洗延迟”设为 20–30 s，勾选“扫描期间启用激光”，并将“激光预热时间”设为 10 s。
12. 在“运行实验”窗口中点击“运行”以启动线扫描分析，并实时监测 ICP-MS 上各同位素的原始信号强度（单位：每秒计数，cps）。每条扫描线应以气体空白开始（“激光预热时间”，10 s）和结束（“清洗延迟”，20–30 s）。
13. 在分析过程中监测激光能量密度（J cm^-2）以评估激光稳定性。若能量密度波动较大，应中止分析，并确认激光源和/或其镜片系统功能正常。
14. 分析结束后，关闭 ICP-MS 等离子体，并将 LA 系统的载气流速设为 0 mL min^-1。从烧蚀池中取出凝胶，装入自封袋中保存以备后续使用。

利用DGT凝胶进行根际溶质取样；LA-ICP-MS成像图；激光装置；土壤分析。
图6：DGT-LA-ICP-MS实验设计示意图（未按比例绘制）。该图示展示了基于DGT技术的根际原位溶质取样过程，以及通过LA-ICP-MS对凝胶表面溶质分布进行成像分析的方法，其中包含一个放大图，显示典型的线扫描尺寸与参数。需注意，当DGT凝胶从根际土壤转移至玻璃载片时，其方向为水平翻转，这一点可通过DGT凝胶右下角矩形标记的位置加以识别。请点击此处查看此图的放大版本。

数据处理与校准
1. 在电子表格软件中导入每条烧蚀线的原始数据文件（.xl）（材料表）。原始数据表显示每个同位素的ICP-MS读数（数据点），单位为cps，以及对应的时间点，单位为s。将所有线条的数据并列列于不同的列中。
2. 评估线扫描数据中内标（¹³C）的信号稳定性以及充分的冲洗时间。
3. 根据每条线烧蚀前记录的所有气体空白值（即激光预热期间）计算每个同位素的平均气体空白值，并从每个同位素的原始强度中减去该平均气体空白值，以校正背景信号。
4. 通过将每个数据点中各同位素的信号强度（cps）除以内标信号强度（cps），进行内标归一化，以校正烧蚀物质数量的变化及仪器漂移。
5. 裁剪每条烧蚀线开始前和结束后的时间段数据，以去除背景信号。转置数据表，得到一个网格矩阵，其中每一行对应一条烧蚀线，每一列对应一个归一化的同位素强度值。将每个同位素的矩阵分别保存至独立的工作表中。
6. 计算校准标准品和校准空白样品中每个同位素的平均归一化信号强度比，并使用线性回归模型计算校准函数（y = ax + b），以凝胶标准品的分析物负载量（µg cm^-2；见SI S4）作为x值。评估每个同位素校准函数的线性度⁴⁷。
7. 将校准函数应用于样品数据矩阵。根据公式4和公式5，将归一化信号强度比转换为凝胶分析物负载量（µg cm^-2），再进一步转换为时间平均溶质通量（pg cm^-2 s^-1），针对每个同位素和每个数据点：
  
  $DGT通量计算方程，$ f_{DGT} = \frac{\Gamma_{DGT}}{t} \times 10^6 $，化学分析$
  其中，a 为校准曲线的斜率，b 为校准曲线的截距，t（s）为溶质采样期间凝胶的部署时间。
8. 将每个分析物的校准后样品数据矩阵保存为txt文件。
图像生成
注意：在图像生成的所有步骤中，应避免任何像素插值操作，因为这可能导致最终图像中溶质通量梯度出现人为平滑现象。
1. 在图像分析软件中将校准后的样品数据矩阵（.txt）作为文本图像导入（材料表）。
2. 通过将激光扫描速度乘以ICP-MS总扫描周期持续时间，计算x方向上每个像素的距离（即横向分辨率）（例如，假设扫描速度为200 µm s^-1，总扫描周期持续时间为0.25 s，则横向分辨率为50 µm）。y方向上每个像素的距离等于线间距（图6）。
3. 计算图像的纵横比校正因子。为此，将y方向上每个像素的距离（例如300 µm）除以x方向上每个像素的距离（例如50 µm）。在“Scale”中应用所得的y/x校正因子（本例中为6）。在“Set scale”中将x方向上每个像素的距离（以µm或mm为单位）作为缩放比例应用。
4. 应用“查找表”（即伪彩色标尺），以更好地可视化溶质图像中的化学梯度，并调整图像的“色彩平衡”以控制显示范围的上下限。添加“标尺栏”，并将溶质图像保存为tiff文件。
5. 使用图像分析软件中的“Copy to System”命令复制溶质图像，并粘贴至桌面排版软件中（材料表）。将溶质图像与3.1.7步骤中获得的ROI照片进行比例匹配、对齐和组合。
  注意：在复制前，可通过在“Set scale”中设置“X Scale”和“Y Scale”均为10，将溶质图像放大例如10倍，以确保获得足够像素用于高分辨率出版。

DGT 凝胶制备	植物培养	原位溶质采样	LA-ICP-MS 溶质通量成像
HR-MBG 1 周	土壤准备 1 周	凝胶应用每片凝胶 1 小时	样品制备每片凝胶 1 小时
HR-ABG 3 天	根际盒组装每个重复 2 小时	溶质采样周期可变，通常为 24 小时	LA-ICP-MS 分析每片凝胶 1 天
HR-CBG 3 天	植物生长取决于研究需求	凝胶回收每片凝胶 1 小时	数据处理每片凝胶 4 小时
		凝胶干燥 2–3 天	图像生成每幅图像 10 分钟

表1：DGT LA-ICP-MS 技术各常规步骤的近似耗时。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

为了展示DGT成像方法的能力和数据细节，我们汇总了荞麦（Fagopyrum esculentum）和柳树（Salix smithiana）根际土壤中多种活性营养元素和污染物溶质的亚毫米级二维通量分布（图7）。本方案各主要操作步骤的参考耗时见Table 1。

溶质图像在图7 在三项不同的研究中，分别使用HR-MBG或HR-CBG结合凝胶生成了这些数据。化学成像显示了溶质通量的二维分布，其空间分辨率沿x轴为82–120 µm，沿y轴为300–400 µm，具体数值取决于所采用的LA-ICP-MS参数。由于在图像校准和重定尺寸过程中未应用插值处理，单个像素代表实际测量的数据点。将溶质图像与感兴趣区域（ROI）的摄影图像对齐后发现，不同元素的亚毫米级二维溶质通量分布随土壤结构和根系形态表现出高度变异性。这可归因于这些元素在土壤-根际-植物系统中的不同生物地球化学行为，以及它们与土壤基质和植物根系的相互作用。

在图7A中，展示了在用NH₄NO₃施肥且不含碳酸盐的土壤中生长的幼嫩F. esculentum根周围不稳定的无机镁（Mg）、铝（Al）、磷（P）、锰（Mn）和铁（Fe）溶质通量的分布情况。亚毫米级的溶质分布显示，在较老的根段区域，由于根系吸收，Al、P和Fe的通量降低；而在根尖区域，由于F. esculentum根局部的磷活化过程，Mg、Al、P、Mn和Fe的通量显著升高。需要注意的是，根尖位于土壤表面稍下方，因此在照片图像中几乎不可见。图7B展示了在中度受到Zn、Cd和Pb污染的土壤中生长的耐金属植物S. smithiana根周围不稳定微量元素（包括Mn、Fe、Zn、Cd和Pb）的分布情况。溶质图像显示，在紧邻根部的位置，Zn、Cd和Pb明显减少，表明S. smithiana根系在污染土壤中作为不稳定微量元素的局部汇。此外，还可观察到局部Zn、Cd和Pb通量的增加，表明这些微量元素在土壤-根界面处发生局部积累。

除了多元素溶质成像外，本方法还可与基于扩散的互补成像技术（如平面光极）相结合³⁴。这一点在图7C中得到展示，其中利用一种结合式的单层平面光极-DGT阳离子结合凝胶³³，将S. smithiana根际中活性微量元素的分布与pH分布进行了共定位。土壤基质施加了(NH₄)₂SO₄肥料，导致根轴周围pH值相比主体土壤降低约1个单位。pH值的降低区域与Mn、Fe、Co、Ni、Cu和Pb的溶质通量增加区域共定位，表明金属的溶解是由pH变化所诱导的。

此外，这些示例结果展示了一些可能出现的成像伪影。例如，土壤结构的非均一性（如 图7A 中 ROI 图像下三分之一处观察到的水平线）可能导致土壤与凝胶接触不连续，从而限制该位置溶质向结合凝胶中的扩散。相反，根箱中土壤过度压实会导致孔隙度降低，进而人为地使土壤氧化还原状态向缺氧方向偏移。这一点在 图7B 中有所体现，溶质图像中大范围显著升高的锰（Mn）和铁（Fe）通量在视觉上与 ROI 图像中的致密土壤层相对应。这表明由于土壤过度压实导致土壤氧化还原电位降低，从而引起对氧化还原状态高度敏感的元素发生还原性溶解和溶出。因此，建议在填充根箱时应谨慎操作，并在填充后立即对土壤表面进行目视检查。

植物组织中的元素分布图；图示为 Mg、Al、Mn、Fe、Zn、Cd、Pb 的分析结果。
图 7：不同土-根界面中不稳定态养分与污染物溶质的亚毫米级二维分布。（A）幼嫩 F. esculentum 根周围阴离子态磷（P）和阳离子态 Mg、Al、Mn 与 Fe 溶质的分布。在土壤含水量约为 75% WHC 的条件下，使用 HR-MBG 技术连续采样 24 小时，实现了阴离子与阳离子溶质的共定位采样。Al、P 和 Mn 图像以校准后的 f_DGT 值（pg cm^-2 s^-1）表示，而 Mg 和 Fe 图像则显示为 ¹³C 标准化强度。比例尺为 1 cm。本图改编自参考文献⁴⁸。（B）在中度 Zn、Cd 和 Pb 污染土壤中生长的 S. smithiana 根周围 Mn、Fe、Zn、Cd 和 Pb 的分布。在土壤含水量约为 80% WHC 的条件下，使用 HR-CBG 技术连续采样 20 小时，采集阳离子痕量金属溶质。所有图像均以校准后的 f_DGT 值（pg cm^-2 s^-1）表示。比例尺为 0.5 cm。本图改编自参考文献³。（C）在添加 Cd 的土壤中生长的 S. smithiana 根周围 pH 值及多种阳离子溶质的分布。通过改进 HR-MBG 方法，实现了 pH 与溶质动态的共定位分析，从而可同时进行溶质采样和平面光极成像³³。Mn、Cu、Zn 和 Cd 图像以校准后的 f_DGT 值（pg cm^-2 s^-1）表示，而 Fe、Co、Ni 和 Pb 图像则显示为 ¹³C 标准化强度。比例尺为 1 cm。本图改编自参考文献³³。所展示的图像均根据 CC BY 许可协议从引用文献³^,³³^,⁴⁸ 中复制而来。请点击此处查看该图的放大版本。

补充文件 1。请点击此处下载该文件。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍的溶质成像方法是一种多功能技术，可用于可视化和量化土壤-植物环境中的二维养分和污染物通量。该方法的独特之处在于能够生成土壤-根界面处可移动溶质种类的亚毫米尺度多元素图像，其空间分辨率显著高于其他测定根际溶质梯度的方法⁴。结合高灵敏度的化学分析方法（如激光剥蚀电感耦合等离子体质谱法，LA-ICP-MS），扩散梯度薄膜技术（DGT）的靶向原位采样策略可实现对生长于土壤或类似基质中单根植物周围溶质通量动态的详细研究。由于DGT采用基于“汇”的采样过程，所获得的图像反映了被成像溶质的可移动性，因而可作为其植物有效性的估计值¹⁰。尽管该方法本身对溶质通量的测量具有显著优势（例如可解释为植物可利用的养分组分），但通量测量结果远不如孔隙水浓度测量结果直观易懂。在大体积土壤应用中，标准DGT采样几何结构（特别是该设置中使用的0.8 mm厚扩散凝胶）允许将实际孔隙水浓度c_soln与通过整体DGT测量得到的时间平均孔隙水浓度估计值c_DGT进行比较，并据此参数解释某一溶质种类的补充动力学。然而，在使用极薄扩散层的成像型DGT应用中，无法进行此类比较，因为由此推导出的c_DGT值极小，不符合实际情况³⁴。因此，DGT成像结果并不总是易于快速解读，且通常无法与更传统的孔隙水浓度测量结果直接比较。

在应用该方法时，有几个关键步骤需要仔细考虑，主要涉及根际盒生长容器的填土和浇水过程。在将土壤填入根际盒的过程中，必须避免过度压实土壤，因为植物根系无法穿透高度压实的土壤，根系生长将受到抑制。我们观察到根系会避开高度压实的土壤，转而沿着根际盒生长容器的内边缘生长，因为这些区域的土壤通常压实程度较低。在这种情况下，位于根际盒中心区域的单个根系（该区域便于放置DGT凝胶）可能完全不发育，从而实质性地阻碍凝胶的成功应用。在本实验室的经验表明，当土壤干容重为1.0–1.4 g cm^-3时，可实现根系的无障碍发育。此外，过度压实土壤还可能引起与氧化还原敏感性元素及其地球化学相关物种溶解度有关的假象。由于高度压实的土壤总孔隙体积减少，且孔径分布向更小孔径偏移，可供空气填充的大孔隙体积减少，可能导致局部出现还原条件。因此，Mn^III/IV-和Fe^III-氧化物可能被还原，导致Mn²⁺和Fe²⁺通量增加。而铁氧化物的溶解（其为磷酸盐和微量元素的重要吸附位点）可能释放被吸附和/或共沉淀的物质，从而导致地球化学相关物种的通量人为升高。如果生长容器浇水过多，也可能出现类似问题。由于生长容器顶部的土壤表面积较小，蒸发量低，种植后土壤可能持续处于水分饱和状态长达数周，这也可能引发氧化还原假象。

另一个重要的考虑因素是所制备的高分辨率扩散梯度（HR-DGT）结合凝胶的化学功能特性。按照本方案操作，可获得结合相分布均匀的薄凝胶。如果凝胶存在材料分布不均的区域（例如凝胶中的孔洞或结合相的团聚物），则需要去除这些区域；若不均匀范围过大，则必须重复凝胶制备流程。若制备得当，凝胶必须能够立即且定量地结合扩散进入凝胶的目标溶质种类²⁷，这取决于分析物特异性的凝胶结合容量。在未受污染的土壤中，超过凝胶容量的问题较小，但在重金属污染土壤和盐渍土壤环境中应予以考虑。凝胶结合相的饱和不仅会损害溶质定量采样的准确性，还会导致溶质在凝胶内不同结合相之间发生侧向扩散，从而模糊小尺度溶质通量特征的空间定位。因此，若预期目标土壤环境中存在极高浓度的活性营养元素/污染物种类，应先进行预实验测试。为估算预期的DGT负载量，可采用整体土壤DGT活塞采样，随后进行凝胶洗脱及湿化学分析¹⁵^,⁴⁹。如有必要，可通过调整DGT部署时间来缩短凝胶接触时间，从而避免超过凝胶容量阈值导致的饱和。相反地，若预期溶质负载量极低，预实验也有助于确定所需的凝胶接触时间及/或激光剥蚀电感耦合等离子体质谱（LA-ICP-MS）检测灵敏度，这对于在自然土壤背景水平下绘制痕量元素溶质分布图尤为重要¹⁵。此外，在将DGT凝胶投入实验应用之前，应通过在制备DGT LA-ICP-MS校准标准品过程中对凝胶进行受控加标，验证其功能是否正常。该凝胶标准品提供了一种基质匹配的参考分析物负载量，可用于评估LA-ICP-MS测定的样品凝胶负载量是否处于预期范围内。若无法获得明显区别于气体空白和方法空白背景噪声的信号，操作人员必须确认已正确执行痕量元素分析的实验室操作程序，并准确完成所有方案步骤。有时，在溶质采样后，DGT凝胶可能被意外翻转，使暴露于土壤并已负载溶质的一面朝向玻璃板而非激光束，这将导致信号强度降低，并在最终的溶质通量图像中出现错误翻转的特征。

在进行激光剥蚀电感耦合等离子体质谱（LA-ICP-MS）分析时，会产生大量数据，评估这些数据需要耗费相当长的时间。在本实验室中，我们使用自行开发的数据处理脚本，结合标准电子表格软件，针对目标数据输出格式进行定制化处理。经过半自动化的数据排序与校准后，采用开源、开放获取的图像分析工具（ImageJ、Fiji⁵⁰）进行图像绘制。该方法能够全面控制数据的排序、分析与呈现过程，这一点至关重要，因为所采集的数据对应的是矩形而非正方形像素，必须在生成的溶质分布图中准确显示。此外，在数据处理过程中，应谨慎避免任何像素插值操作。像素插值会导致化学图像中出现平滑的梯度，使元素分布特征变得模糊，通常呈现为圆形，从而对原始数据造成不期望的改变。尽管像素插值是许多图像处理软件中重缩放和重格式化操作的标准步骤，但通常可以选择关闭此功能。

总之，所述方法对于理解自然土壤-根际-植物系统中养分和污染物的动态过程具有重要意义。该方法不仅可以单独用于DGT分析，还可与其他基于扩散的成像技术结合使用，例如平面光极技术³^,³³^,⁴²^,⁴³^,⁴⁸^,⁵¹和酶谱法²⁰^,²¹^,²²^,²³^,²⁴，并有望进一步发展以纳入更多元素和土壤参数。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究由奥地利科学基金（FWF）：P30085-N28（Thomas Prohaska）以及奥地利科学基金（FWF）与下奥地利州联邦州共同资助：P27571-BBL（Jakob Santner）。

材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号	评论
(NH₄)₂S₂O₈（过硫酸铵；APS）	VWR	21300.260	≥98.0%，分析纯
2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）	Sigma-Aldrich	M8250-100G	≥99.5%
丙烯酰胺溶液	Sigma-Aldrich	A4058-100ML	40%，用于电泳
分析物盐	n/a	n/a	使用分析纯或更高纯度的水溶性分析物盐
布氏漏斗	VWR	511-0065	13 cm 板直径
化学平衡模拟软件	KTH 瑞典	n/a	Visual MINTEQ
夹具	本地仓库	n/a
桌面排版软件	Adobe 公司	n/a	InDesign CS6
DGT 交联剂	DGT Research Ltd	n/a	2%，琼脂糖衍生物
DGT 活塞式采样器	DGT Research Ltd	n/a	2 cm 直径暴露窗口
数码单反（DSLR）相机	佳能公司	n/a	Canon EOS 1000D
分散装置	IKA	3737000	Ultra-Turrax T10 Basic
双面胶带	Tesa	56171
乙醇	Sigma-Aldrich	34923	优级纯，无水，≥99.8%
凝胶转印纸	Whatman	10426981	转印纸，Grade GB005，20 × 20 cm，厚度 1.5 mm
凝胶干燥仪	UniEquip	n/a	UNIGELDRYER 3545
高压微波系统	Anton Paar	n/a	Multiwave 3000
HNO₃	VWR	1.00456.2500P	65%，ISO 分析级
水平摇床	GFL	305
HydroMed D4	AdvanSource Biomaterials Corp.	n/a	醚类亲水性聚氨酯
ICP-MS 软件	Perkin Elmer	n/a	Syngistix
图像分析软件	美国国立卫生研究院（NIH）	n/a	ImageJ Fiji，可从 https://fiji.sc/ 免费获取
刮刀涂布装置	BYK	5561	单棒 6″，0.5 mils
LA 软件	Elemental Scientific Lasers	n/a	ActiveView
LA 系统	Elemental Scientific Lasers	n/a	NWR193
层流操作台	Telstar Laboratory Equipment B.V.	n/a	II 级生物安全柜
磁力搅拌器	IKA	0003582400	C-MAG MS 7
保湿膜	Bemis Company, Inc.	PM999	Parafilm M，4" × 250'
N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）	Sigma-Aldrich	T9281-50ML	生物试剂，适用于电泳，~99%
NaNO₃	Sigma-Aldrich	229938-10G	99.995%，痕量金属基准
NaOH	Sigma-Aldrich	1064980500	分析用颗粒
顶置式摇床	GFL	3040
全氟烷氧基烷烃（PFA）瓶	Savillex	200-015-20	15 mL 标准瓶，圆底内腔
pH 计	Thermo Scientific	13-644-928	Orion 3-Star 台式 pH 计
pH 探头	Thermo Scientific	8157BNUMD	Orion ROSS Ultra pH/ATC 三合一电极
塑料切割器	DGT Research Ltd	n/a	使用 DGT Research Ltd 提供的空交联剂瓶
塑料镊子	Semadeni	602
油灰	本地文具店	n/a	基于石蜡和填充剂的不干型塑性建模材料
聚碳酸酯膜圆片	Whatman	110606	Nuclepore 亲水膜，直径 25 mm，孔径 0.2 µm，厚度 10 µm
聚碳酸酯膜片	Whatman	113506	Nuclepore 亲水膜，8 × 10 英寸，孔径 0.2 µm，厚度 10 µm
聚醚砜膜圆片	Pall Corporation	60172	Supor 450 膜圆片滤器，直径 25 mm，孔径 0.45 µm，厚度 0.14 mm
聚醚砜膜片	Pall Corporation	60179	Supor 450 膜圆片滤器，直径 293 mm，孔径 0.45 µm，厚度 0.14 mm
PTFE 薄膜	Haberkorn	n/a	厚度 50 µm
PTFE 间隔片	Haberkorn	n/a	可提供不同厚度
PTFE 涂层剃须刀片	Personna GEM	62-0178	不锈钢单边刀片（涂层）
PTFE 涂层 Tygon 管	S-prep GmbH	SP8180	内径 0.32 cm
四极杆 ICP-MS	Perkin Elmer	N8150044	NexION 2000B
定量滤纸，454	VWR	516-0854	颗粒截留能力 12–15 µm
电子表格软件	微软公司	n/a	Microsoft Excel 2016 (v16.0)
不锈钢切割器	本地锁具店	n/a	直径 2.5 cm
悬浮颗粒试剂-亚氨基二乙酸（SPR-IDA）	Teledyne CETAC Technologies	n/a	直径 10 µm 的聚苯乙烯微珠，10% (w/v) 微珠悬浮液
晶体管-晶体管逻辑（TTL）电缆	n/a	n/a	请咨询 ICP-MS 技术人员以确定适用于特定仪器的合适 TTL 电缆
双室池	Elemental Scientific Lasers	n/a	Two-volume cell 1
乙烯基电工胶带	3M	n/a	Scotch Super 33+
水纯化系统	Thermo Electron LED GmbH	n/a	TKA-GenPure
ZrOCl₂ × 8H₂O	Alfa Aesar	86108.30	99.9%，金属基准

参考文献

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Hinsinger, P., Gobran, G. R., Gregory, P. J., Wenzel, W. W. Rhizosphere geometry and heterogeneity arising from root-mediated physical and chemical processes. New Phytologist. 168 (2), 293-303 (2005).
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