Method Article

土壤中实验室、无机植物养分和污染物的二维可视化和量化

DOI:

10.3791/61661

⸱

September 1st, 2020

 ,  ,  , 
1Department General, Analytical and Physical Chemistry, Chair of General and Analytical Chemistry, Montanuniversität Leoben, 2Department of Forest and Soil Sciences, Institute of Soil Research, Rhizosphere Ecology and Biogeochemistry Group, University of Natural Resources and Life Sciences, Vienna, 3Department of Crop Sciences, Institute of Agronomy, University of Natural Resources and Life Sciences, Vienna

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

此协议提供了多个阴唇无机养分和污染物溶胶物种的亚毫米 2D 可视化工作流程，使用薄膜 （DGT） 中的扩散梯度与质谱成像相结合。详细描述了在陆地植物的岩石圈中对溶解物进行定量测绘的索卢特采样和高分辨率化学分析。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们描述了一种二维（2D）可视化和量化阴唇分布的方法（即 逆向吸收）无机养分（如P、Fe、Mn）和污染物（如Cd、Pb）以低于毫米（约100微米）的空间分辨率在植物根部（"rhizosphere"）相邻的土壤中溶解物种。该方法结合了薄膜（DGT）技术中扩散梯度的沉基溶胶采样与激光消融感应耦合等离子质谱（LA-ICP-MS）的空间解化学分析。DGT 技术基于具有均匀分布分析器选择性结合相的薄水凝胶。可用绑定阶段的多样性允许在简单的凝胶制造程序后制备不同的 DGT 凝胶类型。对于 Rhizosphere 中的 DGT 凝胶部署，植物生长在平坦、透明的生长容器 （rhizotrons） 中，从而能够以最小的侵入性进入土壤生长的根系。在生长前阶段后，DGT 凝胶应用于某些感兴趣的区域，用于在 rhizospher 中进行原位溶胶采样。之后，使用 LA-ICP-MS 线扫描成像检索并准备随后对绑定溶胶进行化学分析。使用 13C 应用内部规范化，使用矩阵匹配凝胶标准进行外部校准，进一步允许 2D 溶质通量的量化。该方法在土壤植物环境中生成多元素溶质通量的定量、亚毫米比例二维图像的能力方面独树一帜，大大超过了测量日光圈中溶质梯度的其他方法的可实现空间分辨率。我们介绍了在陆地植物的岩石圈中成像多成离子和肛门溶质物种的方法的应用和评价，并强调了将这种方法与补充溶质成像技术相结合的可能性。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作物植物的营养获取是决定作物产量的关键因素。对作物有效吸收养分的过程进行了深入的研究，特别是通过土壤根系（rhizosphere）的植物根控制养分供应和养分内化的机制，因其在作物养分获取中的作用而得到认可。植物养分吸收的重要过程包括:向根部输送营养:溶解在土壤孔隙水中的物种与与固体土壤表面相连的物种之间的动态吸附平衡:微生物对营养物质的竞争;土壤有机物中所含养分的微生物矿化:和营养内化到根部症状。无机微量金属（oid）污染物的吸收在很大程度上由相同的机制控制。

根据养分和污染物的供应、植物需求和土壤中的扩散性，可以观察到岩石圈中的差异养分模式。对于内化率较高的强吸附元素（例如， P，Fe，Mn，Zn，As，Cd，Pb），与散装土壤相比，阴唇（即可逆吸附）元素部分的耗竭，耗竭区宽度通常≤1毫米，而对于更多的移动养分，如NO3-，耗竭区可以延伸至几厘米1。此外，当可用性超过工厂吸收率2、3时，还观察到 Al 和 Cd 等元素的积累。

鉴于 rhizosphere 过程在养分和污染物循环中的重要性，已开发出几种以高空间分辨率测量植物可用元素分数的技术。然而，测量小规模的腹腔溶胶分布已被证明是具有挑战性的，有几个原因。一个主要困难是在与活植物根相邻的固定位置对非常小（低 μL 范围）的土壤和/或孔水进行采样，以解决 rhizosphere 中陡峭的养分梯度。解决这个问题的方法之一是使用微吸杯提取孔隙水样品6。通过这种方法，A. Güttlein、A. Heim 和 E. Matzner7测量了奎尔库斯罗布尔L. 根附近的土壤孔水养分浓度，其空间分辨率为 +1 厘米。分析 μL 土壤或土壤溶液量的一个困难是，这些小样本量与除主要养分物种外的所有低浓度相结合，需要高度敏感的化学分析技术。

另一种系统，能够解决营养梯度在分辨率下降到〜0.5毫米，是种植根垫在土壤块的表面，与薄亲水膜层分离土壤从根8，9。在这种配置中，溶胶可以穿过膜，根可以从土壤中产生养分和污染物，而根渗出物可以扩散到土壤中。建立密集的根层后，可以对土壤块进行取样和切片，以获得土壤样本，以便随后提取元素部分。通过这种方式，可以分析在相对较大的区域（约100厘米2）平均的一维营养素和污染物梯度。

另一个挑战是获得实验室、植物可用元素部分的样本，因为大多数化学土壤提取技术的运作方式与植物获取养分和污染物的机制大相径庭。在许多土壤提取协议中，土壤与萃取溶液混合，目的是在溶解元素和冰激元素部分之间建立（伪）平衡。然而，植物不断内化养分，因此，往往逐渐耗尽了里佐圈的土壤。虽然均衡提取方案已被广泛采用作为土壤测试，因为它们很容易实施，提取的营养成分往往不代表植物可用的营养成分井10，11，12，13。不断耗尽被采样土壤养分的水槽方法已被建议为有利的方法，并可能更类似于潜在的养分吸收机制，模仿根吸收过程10，11，14，15。

除了上述方法外，还开发了能够测量分辨率为≤100μm的连续参数图的真人成像应用，用于特定元素和土壤（生物）化学参数5。自传可以用来成像元素分布在日光圈，只要有合适的放射性同位素16。平面光电图可可视化重要的土壤化学参数，如pH值和pO217、18、19，酶活性或蛋白质总分布可以使用荧光指示器成像技术（如土壤成像20、21、22、23和/或根部印迹方法24）进行映射。虽然酶成像和自传仅限于一次测量单个参数，但使用平面光电图进行 pH 和 pO2成像可以同时完成。更传统的根垫技术仅提供一维信息，而微吸盘提供点测量或低分辨率二维信息，但两种方法都允许多元素分析。最近，P.D. Ilhardt等人提出了一种利用激光诱导分解光谱（LIBS）绘制2D总多元素分布图的新方法，分辨率为+100μm的土壤根芯样品，通过仔细的样品准备保留了自然元素分布。

唯一能够以高空间分辨率对多种营养物质和污染物溶解物进行二维取样的技术是薄膜（DGT）技术中的扩散梯度，这是一种基于水槽的取样方法，可在嵌入在水凝胶层26、27层的结合材料上原位固定可移动的实验室微量金属（loid）物种。DGT作为测量沉积物和水域中腹腔溶解物的化学规格技术被引入，并很快被用于土壤28。它使亚毫米比例的多元素溶胶成像，这是最初在河流沉积物29中演示，并已进一步开发，以应用于植物里佐圈30，31，32，33。

对于 DGT 取样，在土壤块表面层生长的单个植物根上涂上一块大小约为 3 厘米 x 5 厘米的凝胶片，用亲水膜将凝胶与土壤分离。在接触期间，阴唇营养物质和/或污染物扩散到凝胶上，并立即被凝胶中加入的结合材料所束缚。通过这种方式，在采样过程中建立了浓度梯度，从而建立了对凝胶的连续净通量。取样后，可以使用分析化学技术去除和分析水凝胶，从而进行空间解析分析。为此目的，一项高度专业化且常用的技术是激光消融感应耦合等离子体质谱仪 （LA-ICP-MS）。在一些早期研究中，微粒子诱导的X射线发射（PIXE）也被使用29。DGT 采样与 LA-ICP-MS 分析相结合，可实现空间分辨率为 100μm 的多元素化学成像。如果采用高度敏感的 ICP-MS 技术（例如部门领域 ICP-MS），则可以达到极低的检测限制。在一项有关玉米15号对Zn和Cd吸收的影响的研究中，我们能够绘制出未受污染土壤中玉米里佐圈的阴唇CD，每个凝胶面积的检测限量为38 pgcm-2。DGT、平面光学和酶学依赖于目标元素从土壤扩散到凝胶层，这些凝胶层可用于这些方法的联合应用，以便同时或连续地成像与植物养分和污染物吸收相关的大量参数。关于DGT成像分析化学方面的详细信息，关于DGT和其他成像方法相结合的潜力，以及它的应用，在参考第34，35中进行了全面审查。

本文介绍了如何利用DGT技术对不饱和土壤环境中的陆生植物根部进行溶解成像实验，包括植物栽培、凝胶制造、凝胶应用、凝胶分析和图像生成。所有步骤都详细阐述，包括关于关键步骤和实验备选方案的说明。

Protocol

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1. 制造 DGT 凝胶

注:几种DGT凝胶类型可用于高（亚毫米）空间分辨率35的腹腔溶胶物种的二维成像。在这里，简要总结了用于溶解成像应用的三种具有良好特征的高分辨率 （HR） -DGT 绑定凝胶的制造。S1 和 S2 的辅助信息 （SI） 部分描述了微量元素分析的实验室程序，以及所有已呈现的 HR-DGT 凝胶的详细制造程序。

  1. 聚氨酯基混合阴离子和沉着结合凝胶（HR-MBG;SI S2.1）31
    1. 准备聚氨酯凝胶悬浮物与同质分散的硅 （IV） 氢氧化物和二甲基乙酸酯 （IDA） 相。
    2. 将凝胶悬架用薄膜涂在玻璃板上，通过溶剂蒸发启动凝胶形成，以获得 0.1 毫米薄、防撕裂的混合阴离子和 cation 结合凝胶 （HR-MBG）。
  2. 聚丙烯酰胺-氧化锌氨氨结合凝胶（HR-ABG;SI S2.2）36
    1. 按照既定的凝胶铸造程序37（参见 SI S2.4了解 APA 制造的详细协议），制造 0.4 毫米薄的阿加罗斯交叉链接多丙烯酰胺凝胶 （APA）。
    2. 将硅 （IV） 氢氧化物相沉淀到预制 APA 凝胶中，以获得 0.4 毫米薄的阴离子结合凝胶 （HR-ABG）。
  3. 聚丙烯酰胺-伊米诺二乙酸酯 cation 结合凝胶 （HR-CBG;SI S2.3）38
    1. 准备一个聚丙烯酰胺凝胶悬浮与均匀分散的IDA阶段。
    2. 将凝胶铸造在两个玻璃板之间，并启动聚合反应，以获得 0.4 毫米薄的 cation 结合凝胶 （HR-CBG），其中 IDA 相位沉降到凝胶的一侧。

2. 植物栽培

注:实验系统使用rhzotrons4（图1）在不饱和土壤中种植植物，进行溶胶成像。首先，描述rhzotron土壤填充和浇水，然后给出实验植物生长的细节。在填充 Rhizotron 之前，有关 Rhizotron 设计和土壤基板准备的详细信息在SI 部分 S3中呈现。

figure-protocol-1
图1:瑞佐特龙设计（不缩放）。（A） 一个日光生长容器的爆炸视图。（B） 在植物生长过程中组装的龙。 请点击这里查看此数字的较大版本。

  1. 瑞佐特龙土壤填充
    1. 在用预湿润的土壤（重力含水量 figure-protocol-2 ，已知;见 SI S3.2）填充rhhizotron之前，使用胶带关闭河左子后部的浇水孔，并取出前板及其固定轨和螺丝。
    2. 称空的 rhizotron（不包括前板、铁轨和螺丝）、8 个 5 厘米 x 11 厘米丙烯酸板和 16 个夹子（材料表），并记录重量之和。
    3. 在 rhizotron 底部安装一个小丙烯酸板，每侧使用两个夹子，夹子的压力定向到 rhizotron 框架上，因此板不会向内弯曲，体积是恒定的。
    4. 稍微向小塑料板倾斜，并填充预先滋润的土壤，高度可达~4厘米（图2A）。通过用压实工具（图2B）稍微搅拌rhiazotron，轻轻将土壤压缩几毫米（取决于特定的土壤特性），将土壤分布在韵离子体内部。
    5. 重复 2.1.3 - 2.1.4， 直到里佐特龙充满土壤 （图 2c）。在顶部留下一个约3厘米的缝隙，用于随后将幼苗种植到里佐特龙中。
    6. 称量充满土壤的龙（包括8个小板和16个夹子），并记录重量。由此，减去在 2.1.2 中获得的空 rhizotron 重量，并记录重量差异，即湿润土壤的质量 figure-protocol-3 （g），在 rhizotron 中。
    7. 根据 Eq. 1 计算 rhizotron 中的干土质量 figure-protocol-4 （g），然后 figure-protocol-5 根据 Eq. 2 计算在 rhizotron 中的干土散装密度（g cm-3）。
      figure-protocol-6
      figure-protocol-7
      在这里 figure-protocol-8 ，（厘米3）是里佐特龙的总内体积。
      注: figure-protocol-9 在日光器中的典型值在1.0-1.4克厘米-3之间。不要超过1.5克厘米-3， 因为根的生长可能会阻碍超过此值。
    8. 将充满土壤的 rhizotron 放在支撑盒上，从 rhizotron （图 2D）中取出所有夹子和小板。使用纸巾仔细清洁 rhizotron 框架（即边缘），因为框架上剩余的土壤颗粒可能会导致泄漏。
      注:裸露的土壤表面必须是均匀的，并与rhzotron框架平地，没有任何裂缝或缝隙。如果没有，清空的龙和重复2.1.2 - 2.1.8。
    9. 将两块聚四氟乙烯（PTFE）（材料表）箔切割至每片22厘米×13厘米。此外，将一块塑料箔切割到 46 厘米 x 15 厘米。记录 PTFE 和塑料箔重量的总和。将第一块PTFE铝箔放在里佐特龙裸露土壤表面的上半部分，在日子龙顶部的土壤水平上延伸约1厘米。
    10. 使用胶带（图2E）小心地将PTFE铝箔固定到里佐特龙框架上。首先在里佐特龙顶部固定一个角，然后是相反的角，最后是进一步向下的两个角。修复角 2-4 时应用张力，以确保平面箔表面。如果褶皱出现，打开并重新固定胶带在单个角落（不是一次全部），直到所有褶皱被删除，PTFE箔是平坦和毗邻的土壤表面。
    11. 将第二块 PTFE 箔放在 rhizotron 的下端，将上部 PTFE 箔片重叠 ~1 厘米。 重复 2.1.10，用于将第二块 PTFE 箔固定到 rhizotron 上。
    12. 将塑料箔（46 厘米 x 15 厘米）放在 PTFE 箔上。使用 2.1.10 中详细说明的固定程序修复塑料箔。
    13. 将前板放在充满土壤和铝箔覆盖的河图龙上。将一根导轨放在河左子的两侧，用手拧紧螺丝以固定铁轨，从而将前板固定到 rhizotron。螺钉定位在河口的封闭侧，即浇水孔的侧面（图 1A）。

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图2:Rhizotron组装和填充，在土壤中种植植物，在里佐球中进行溶胶成像。（A） 土壤填充到里佐特龙。（B） 使用压实工具压实填充土壤。（C） 充满土壤的石龙与小丙烯酸板和夹子。（D） 土壤填充的石龙与暴露的土壤表面。（E） 土壤填充的里佐特龙部分覆盖着保护性PTFE箔。 请点击这里查看此数字的较大版本。

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图3:瑞佐特龙处理和DGT凝胶应用。（A） 在河水后部的浇水孔中使用 10 mL 移液器尖端浇水。（B） 将幼苗（表示为绿点）种植到土壤填充和封闭的石斑龙中。（C） 瑞佐特龙种植了萨利克斯·史密斯亚纳切口，并拆除了前板和塑料箔盖。（D） 在应用 DGT 凝胶之前，小心地剥下 PTFE 箔盖。（E） 土壤根界面 ROI 的高分辨率照片。（F） 将装有DGT凝胶的前板应用到日子龙上。（G） 在溶胶取样时涂上 DGT 凝胶的 ROI 照片。请点击这里查看此数字的较大版本。

  1. 浇水土壤
    1. 确定日志子实验土壤的蓄水能力（WHC）。为此，制造两个带开底的龙，并按第2.1条的规定填充土壤。完全饱和这些开放的，充满土壤的rhizotrons浸入一个水容器16小时，并排水的rhizotrons 8小时。
    2. 从露天龙的随机位置采集+50克的复合土壤样本，并在105°C处干燥样品 figure-protocol-12 ，根据Eq. S1确定。已确定的对 figure-protocol-13 应于土壤的WHC，因此，表示为 figure-protocol-14 （gg-1）。
    3. 在实验中定义目标 figure-protocol-15 。在生长阶段，设置 figure-protocol-16 60%的WHC（即WHC因子 figure-protocol-17 ），为植物提供足够的水，同时避免在rhizotron的缺氧条件。
    4. 根据 Eq. 3 计算要添加的总水量 figure-protocol-18 （g），以灌溉目标的河口土壤 figure-protocol-19 。说明在河口的土壤中存在的水的质量 figure-protocol-20 ，（g）。
      figure-protocol-21
    5. figure-protocol-22除以里佐特龙浇水孔的数量（此处 14），以获得每个浇水孔中要添加的水量。通过将 10 mL 移液器尖端推入浇水孔并让水通过重力流入土壤（图 3A）来补充水。
  2. 植物生长
    1. 根据特定的种子发芽要求，对实验植物的种子（例如在湿滤纸上）进行预生，直到辐射出现（长达1厘米）。
    2. 如 图3B所示，将多达两株幼苗种植到里佐特龙中。在种植时，直接向幼苗添加约5 mL的水，以支持幼苗的生长。用透明、保湿膜（材料表）覆盖种植后的头~两天。用铝箔包裹瑞佐龙，防止微植物生长。
      注:除了幼苗，植物切口也可以在龙中栽培。
    3. 将种植的 rhizotron 转移到生长室，根据特定的植物要求设置环境条件（即温度、湿度、光强度）。在 25°-35° 时倾斜 rhizotron，以确保根与前板一起通过重力运动进行根部发育。
    4. 在植物生长过程中，通过每 2-4 天定期浇水，使用 2.2.5 中详述的 rhizotron 浇水孔，以重力保持 rhizotron 中的目标含水量。定期添加约 5 mL 水，使顶部开口的土壤表面保持湿润。
      注:如果植物生长时间较长，预计植物生物质将大幅减少建议方法添加到rhhizotron中的水量，则通过在单独的 rhizotron 复制中种植植物以及以规定的时间间隔采集和称量植物组织来考虑植物生物量的重量。
    5. 一旦根沿着前板到达一个合适的位置，优先在日光器的中心，应用DGT凝胶进行采样的日光层溶胶分布。

3. 采样溶胶分布

  1. 凝胶应用程序
    1. figure-protocol-23在凝胶施用前将 rhizotron 从 figure-protocol-24 60% 增加到 80% figure-protocol-25 24 小时，详见 2.2.4.-2.2.5。这确保了良好的土壤凝胶接触，并允许溶胶扩散到凝胶中，同时避免在溶胶采样过程中的氧化土壤条件。
    2. 取一个新的，酸清洗的前板，对齐它用于采样的rhizotron，并标记在板上感兴趣的区域（ROI）。将板转移到层流长凳或任何其他无灰尘和无金属环境，无标记的侧面朝上。
    3. 使用 PTFE 涂层剃须刀刀片，将丙烯酸支线上的 DGT 粘合凝胶切割到与 ROI 对应的矩形尺寸，通常约为 3 厘米× 5 厘米。通过按压而不是滑动剃须刀刀片来切割凝胶，以确保切割清晰。将矩形凝胶片放在板的无标记侧面，放在 ROI 的标记位置。
      注:如果使用 HR-MBG，可以在凝胶下方添加 100μm 薄的隔垫片，以确保凝胶与土壤根系的良好接触。
    4. 切割 10μm 薄聚碳酸酯膜（0.2 μm 孔径; 材料表）将凝胶尺寸每侧扩展≥1厘米，并将膜放置在凝胶上。涂抹一些水来去除堆栈中的气泡。
    5. 使用乙烯基电胶带（材料表）沿所有四个边缘修复膜。在此过程中，使用塑料钳子小心地清除夹在凝胶和膜之间的气泡。胶带必须只与膜接触，而不能与凝胶接触。
      注:如果胶带与凝胶接触，气泡夹在凝胶和膜之间，或最终膜表面显示褶皱，凝胶/膜堆栈需要重新组装，因为流入凝胶的溶胶的扩散通量可能会受损35（ 重复 3.1.3 - 3.1.5）。
    6. 将龙放在支架上，取下铁轨，小心地从前板（图3C）上抬起来。取出塑料箔，切断红石龙边缘的 PTFE 箔，并慢慢剥落 PTFE 箔，以避免干扰土壤根系（图 3D）。
    7. 使用数字单镜头反射 （DSLR） 相机 （材料表） 拍摄 ROI 的正交照片，以方便根据土壤结构和根部形态（图 3E）解释和呈现溶质分布。使用相机支架，如果可用，则使用微距镜头。对齐相机，使照片的中心对应于投资回报率的中心，并且相机的焦点平面与土壤表面平行。照片中包括一个比例栏（例如尺子）。
    8. 将装有凝胶/膜堆栈的板连接到打开的 rhizotron （图3F）。因此，将板的一个边缘与 rhizotron 的边缘对齐，然后轻轻地将板向土壤"弯曲"。这种应用模式有助于避免凝胶/膜堆栈和土壤根系统之间的气泡。使用导轨和螺钉固定前板。
      注:这一步骤至关重要，需要谨慎执行。在凝胶/膜堆栈与土壤根系之间建立接触后，在不取代土壤和根部的情况下，无法移动板材。
    9. 记录凝胶部署的确切开始时间，并拍摄 3.1.7（图 3G）中给出的 ROI 中部署的凝胶的照片。用铝箔包裹rhzotron，并转移到生长室，直到溶胶采样期结束（通常为24小时）。
  2. 凝胶检索
    1. 将 rhizotron 放在支撑盒上，小心地从前板上抬起来，用水冲洗盘子上的凝胶/膜堆，以洗掉粘合颗粒（图4A）。记录凝胶部署的确切结束时间。从 ROI 中抽样土壤，根据 Eq. S1 确定 Rhizotron 中的实际 w土壤 。
    2. 将前板转移到层流长凳中，凝胶/膜层朝上。从前板取回凝胶，首先小心地沿着所有四个边缘去除胶带，然后将覆盖凝胶的聚碳酸酯膜（图 4B）取出。涂抹水，帮助凝胶在薄薄的水膜上自由浮动，与土壤接触侧朝上。
      注意:跟踪凝胶方向至关重要。暴露在土壤和根部的凝胶面必须始终朝上（面向用户）。
  3. 凝胶干燥
    1. 切一张长方形的凝胶印迹纸（材料表），并放置一块稍小的聚乙醚硫氟烃膜（0.45 μm 孔径大小）: 材料表）在上面。
    2. 使用塑料钳子将凝胶从板转移到凝胶印迹纸/膜堆上，土壤接触侧朝上。凝胶必须放松（即不拉伸），完全平坦，凝胶和膜之间没有任何气泡。将一些水涂抹在凝胶印迹纸/膜堆上，以方便凝胶转移和定位。
    3. 用一块塑料箔完全盖住凝胶印迹纸/膜/凝胶堆，并在塑料箔上标记凝胶样品及其方向（图4C）。将凝胶印迹纸/膜/凝胶/塑料箔堆放在真空凝胶烘干机（材料表）中干燥，直到堆栈完全干燥（通常为 48-72 小时）。对于 HR-MBG，将温度设置为 50-55 °C，用于 HR-ABG 和 HR-CBG 在室温下最佳干燥。
    4. 从干燥的堆栈中取出凝胶印迹纸，将凝胶（现在与聚乙醚硫氟烃膜不可分割地合并）转移到拉链袋中。塑料箔盖一直留在凝胶上，直到洛杉矶-ICP-MS分析前不久。
    5. 将原始凝胶片中的凝胶片作为方法空白，不会暴露在土壤中。按照 3.3.2 - 3.3.4 处理与样品凝胶相同的方法空白凝胶。

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图4:DGT凝胶检索和干燥准备后，溶胶采样。（A） 在溶胶取样后直接与 DGT 凝胶和利佐特龙的板。（B） 在层压流动长凳上从盘子中取出DGT凝胶。（C） 凝胶印迹纸堆/聚醚硫氟膜/DGT凝胶/塑料箔盖，用于凝胶干燥。请注意，该凝胶在部署在日光圈土壤上后略有颜色。 请点击这里查看此数字的较大版本。

4. DGT结合凝胶的化学分析

注:在此协议中，LA-ICP-MS使用一个纳秒193 nm ArF切除器LA系统完成对DGT结合凝胶上的溶质分布的分析，该系统配备了一个两卷消融细胞，并耦合到四胞胎ICP-MS（图5）。所有仪器都列在材料表中。或者，纳秒213纳米或266纳米固态LA系统可以应用36，39，40，41，42，43。如果需要增强灵敏度或质量分辨率，则部门领域 ICP-MS 是四足 ICP-MS15、44的替代方案。有关准备 DGT 凝胶标准的外部校准和洛杉矶系统与四足 ICP-MS 耦合的详细信息在SI 部分 S4 和 S5中提供。

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图5:用于DGT凝胶分析的洛杉矶ICP-MS设置。（A） 纳索秒 193 nm ArF 切除器 LA 系统和四足 ICP-MS.（B） 干凝胶安装在玻璃板上，固定在洛杉矶样本台上，准备引入消融细胞。（C） 来自 ICP-MS 的雾化气体 （Ar） 和气溶胶载体气体 （他或 Ar）， 通过双向 Y 分裂器和火炬适配器配件连接到 ICP 的消融细胞。 请点击这里查看此数字的较大版本。

  1. 洛杉矶-ICP-MS的样品准备
    1. 将干凝胶样品、标准和方法空白（与聚乙醚硫氟烃膜支架合并）转移到单件双面胶带（材料表），凝胶侧朝上。裁剪多余的胶带部件，以节省消融细胞中的空间。
    2. 将干凝胶安装到玻璃板上。使用每个凝胶样品、标准系列或方法空白的单独玻璃板，以便在洛杉矶样品阶段灵活排列（典型尺寸为 10 厘米× 10 厘米）。根据需要，使用玻璃切割机调整玻璃板尺寸。使用塑胶（材料表）将玻璃板与LA样品阶段的凝胶（图5B）固定。通过调整阶段地板来平定凝胶表面，并将样品阶段锁定到消融细胞中。
  2. 洛杉矶-ICP-MS 线扫描分析
    1. 将洛杉矶系统与 SI 部分 S5中指定的 ICP-MS 耦合。在洛杉矶软件（材料表）中，设置相机光设置（即"环"、"同轴"和"传输"），照亮消融细胞中的凝胶表面，并通过调整 z 轴距离将焦点对准凝胶表面。移动到整个细胞的随机位置，以确保所有凝胶表面都处于聚焦位置。
    2. 在洛杉矶软件的"激光设置"窗口中设置 LA 参数。在 DGT 凝胶的 LA-ICP-MS 线扫描分析中使用的典型设置是:模式连续:能源产出20-30%:重复率 10-20 Hz;斑点直径 100-200μm;扫描速度 150-250 μm s-1.
      注意:需要针对所使用的凝胶类型进行优化参数，并且可能有所不同。还可以增强参数，以增加信号与噪声比、空间分辨率，或根据实验和工具设置缩短采集时间。使用相对较低的能源输出（≤40%）和重复率（≤25 Hz），以避免穿透通过凝胶到衬里材料39。确保激光扫描速度≤点直径除以 ICP-MS 扫描周期总持续时间（见 4.2.6），以避免压缩数据点，从而在扫描方向45中丢失分辨率。例如，当设置点直径为 200μm 且 ICP-MS 扫描周期总持续时间为 0.25 秒时，扫描速度应为 ≤800μms-1。
    3. 选择线条工具，在凝胶标准上绘制单个~1 毫米长的线条图案。右键单击"扫描模式"窗口中的行模式，并验证 LA 参数设置为 4.2.3。已被采纳。使用"重复扫描"工具复制此行四次，其间联线距离（线中心之间的距离）大于点直径（图 6）。此方法每个凝胶标准总共提供五条平行线（n = 5）。重复此步骤的每个凝胶标准，校准空白和方法空白。
    4. 移动到凝胶样本，沿着矩形区域的顶部边缘绘制一条线进行分析。复制线，为 4.2.3 中指定的整个样本区域创建平行线。使用 300-400μm 的线际距离。确保每个行的每个起始点和终点正确设置对焦（z 轴距离）。
      注:与线际距离相比，分析的空间分辨率在扫描方向上更高。因此，线的起点和终点最好遵循分析梯度的方向。对于红球梯度，这通常是垂直于根轴（图6）。
    5. 在 ICP-MS 软件（材料表）中，在"方法"屏幕上设置一个时间解决的"仅限数据"方法，为每个分析器选择一个或多个合适的同位素（s），并将13C 作为内部规范化标准31、36、40、41、42。验证同位素的检测不会因干扰46而受损。
    6. 将 ICP-MS 方法的总扫描周期持续时间（"Est. 阅读时间"）设置为 ≤0.5 秒，每个同位素的停留时间适当（通常在 10-50 毫秒之间）。将 ICP-MS"读数"设置为 1，并将"读数/复制"值更改为设置每个样本的总测量时间（"Est. 采样时间"），即每个单独的消融线。这取决于在 4.2.2 - 4.2.4 中设置的特定 LA 参数和行距离。
    7. 对于数据报告，使用强度与时间数据收集模式，并将"文件编写选项"设置为"每个样本的新"，为每个消融行创建单个数据文件（此处 。xl）。
    8. 在 ICP-MS"样本"屏幕上设置"批次"样本序列，每个样本条目与单个消融线对应，设置为 4.2.3 - 4.2.4。
    9. 单击"分析批次"以启动 ICP-MS 上的样本序列，该序列将等待数据采集，直到它由第一个激光脉冲触发（有关触发器配置的详细信息，请参阅SI S5）。
    10. 在洛杉矶软件中，选择所有要分析的行，并验证 ICP-MS 方法（"Est. 采样时间"，见 4.2.6.） 是否与单个线条消融的持续时间相匹配，而凝胶样本、标准和方法空白通常不同。重复 4.2.6。必要时调整ICP-MS方法。
    11. 单击"激光能量"窗口中的"发射"以为激光头充电，然后单击"运行"以打开"运行实验"窗口。在这里，选择"仅选择模式"，将"洗掉延迟"设置为 20-30 秒，勾选"扫描期间启用激光"框，并将"激光预热时间"设置为 10 秒。
    12. 单击"运行实验"窗口中的"运行"，开始线扫描分析，并实时监控 ICP-MS 上每个同位素的原始信号强度（cps）。每条线路应开始（"激光预热时间"，10s）和结束（"洗掉延迟"，20-30 s）与气体空白。
    13. 在分析过程中监测激光流畅（Jcm-2），以评估激光的稳定性。如果流体差异很大，请中止分析，并验证激光源和/或其镜像系统是否完全正常。
    14. 分析后，停止ICP-MS等离子体，将洛杉矶系统的载波气体流量设定为0 mL最小-1。将凝胶从消融细胞中取出并存放在拉链袋中以供进一步使用。

figure-protocol-28
图6:DGT LA-ICP-MS实验设计的示意图（不缩放）。该图描绘了基于 DGT 的 rhizosphere 的原位溶胶采样和凝胶表面溶质分布的 LA-ICP-MS 映射，包括显示示范性线扫描尺寸和参数的特写镜头。请注意，DGT 凝胶在从 rhizosphere 土壤转移到玻璃板时水平翻转，如 DGT 凝胶底部角矩形的位置所示。 请点击这里查看此数字的较大版本。

  1. 数据处理和校准
    1. 导入电子表格软件（材料表）中每个消融行的原始数据文件 （.xl）。原始数据表显示了cps中每个同位素的 ICP-MS 读数（数据点）和 s 中的相应时间点。在不同的列中列出彼此之间的所有行。
    2. 评估线扫描数据，以获得内部标准（13C） 的信号稳定性和足够的冲洗时间。
    3. 从线路消融前（即激光预热时间）记录的所有气体空白值中计算每个同位素的平均气体空白，并从每个同位素的相应原始强度中减去平均气体空白，以校正背景信号。
    4. 应用内部规范化，将每个同位素 （cps） 的信号强度除以每个数据点的内部标准 （cps） 的信号强度，以纠正材料消融和工具漂移量的变化。
    5. 在开始之前和结束每个消融线后裁剪数据以删除背景信号。将数据表转换为获取网格矩阵，其中每行对应于一条消融线，每列对应于一个规范化的同位素强度值。将每个同位素的矩阵分离到单独的工作表中。
    6. 计算校准标准和校准空白的每个同位素的平均规范化信号强度比，并使用凝胶标准分析加载（μg cm-2:参见SI S4）的线性回归模型计算校准功能（y = ax + b）。评估每个同位素的校准功能为线性47。
    7. 将校准功能应用于示例数据矩阵。figure-protocol-29 figure-protocol-30 根据 Eq. 4 和 Eq. 5，将规范化的信号强度比（μg cm-2）转换为凝胶分析加载，然后转换为时间平均溶质通量 figure-protocol-31 （pg cm-2 s-1）:
      figure-protocol-32
      figure-protocol-33
      在这里 ，a 是校准线的斜率 ，b 是校准线的截取 ，t （s） 是溶胶采样期间的凝胶部署时间。
    8. 将每个分析的校准样本数据矩阵保存为 txt 文件。
  2. 图像生成
    注意:请确保避免在图像生成的所有步骤中进行任何像素插点操作，因为这可能会导致生成的图像中人为平滑溶质通量梯度。
    1. 将校准的样本数据矩阵（.txt）导入图像分析软件（材料表）中的文本图像。
    2. 通过将激光扫描速度与 ICP-MS 扫描周期总持续时间（例如，假设扫描速度为 200 μms-1，总扫描周期持续时间为 0.25 s，横向分辨率等于 50 μm）乘以，计算每个像素 x 方向（即横向分辨率）的距离。y 方向的每个像素的距离等同于线际距离（图 6）。
    3. 计算图像的纵横比校正因子。因此，以 y 方向（例如，300 μm）将每个像素的距离除以 x 方向的每个像素的距离（例如 50 μm）。在"缩放"下应用获得的 y/x 校正因子（在此示例 6 中）。将每个像素的距离（以 μm 或 mm）应用于 x 方向，以"设置比例"下缩放。
    4. 应用"仰望表"，即伪彩色刻度，以更好地可视化溶解图像中的化学梯度，并调整图像"颜色平衡"以控制显示范围的下/上限。添加一个"校准栏"，并将溶胶图像保存为tiff文件。
    5. 使用图像分析软件中的"复制到系统"命令复制索利特图像，并粘贴到桌面发布软件（材料表）中。比例匹配，将索利特图像与 3.1.7 中获得的 ROI 照片对齐并撰写。
      注:在复制之前，通过应用 10 的"X 刻度"和"设置刻度"下的 10 的"Y 刻度"来调整索利特图像的大小，以确保有足够的像素用于高分辨率发布。
DGT 凝胶制造植物栽培原位溶胶采样LA-ICP-MS溶质通量映射
人力资源-MBG
1 周 		土壤准备
1 周 		凝胶应用程序
每凝胶1小时 		样品制备
每凝胶1小时
人力资源和社会保障部
3 天 		里佐特龙总成
每次复制2小时 		索卢特采样期
可变，通常24小时 		洛杉矶-ICP-MS 分析
每凝胶1天
人力资源和社会保障部
3 天 		植物生长
依赖于学习 		凝胶检索
每凝胶1小时 		数据处理
每凝胶4小时
凝胶干燥
2-3 天 		图像生成
每张图片10分钟

表1:DGT LA-ICP-MS 技术一般步骤的大致时间。

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

为了证明DGT成像方法的能力和数据细节，我们汇编了与法戈皮鲁姆树脂和萨利克斯·史密西亚纳（图7）相邻的土壤中多种阴唇营养素和污染物溶质物种的亚毫米、二维通量分布。协议的一般程序步骤的大致时间在表1中。

图 7中的索卢特图像是在三种不同的研究中使用 HR-MBG 或 HR-CBG 绑定凝胶生成的。化学图像显示沿 x 轴的空间分辨率为 82-120 μm，沿 y 轴的 300-400 μm 的 2D 溶质通量分布，具体取决于所使用的 LA-ICP-MS 参数。由于在图像校准和调整过程中没有应用插点，因此单个像素表示已测量的数据点。将溶胶图像与 ROI 的摄影图像对齐后发现，根据土壤结构和根部形态，不同元素的亚毫米、二维溶质通量分布高度可变。这可以归因于土壤-红球-植物系统中元素的微分生化行为，以及它们与土壤矩阵和植物根的相互作用。

在 图7A 阴唇无机Mg，Al，P，Mn和Fe溶胶通量被可视化周围的一个年轻的 F.埃斯库伦特 根生长在无碳酸盐土壤施肥与NH4NO3.亚毫米溶质分布显示，由于根吸收，Al、P 和 Fe 通量与旧根部分一起减少，由于 F. esculentum 根的局部 P 动员过程，根部顶点的 Mg、Al、P、Mn 和 Fe 通量高度增加。请注意，根尖位于土壤表面后面，因此在照片图像中几乎看不到。 图 7B 显示了在受 Zn、Cd 和 Pb 适度污染的土壤中生长的耐金属 S. Smithiana 根部周围的阴唇微量金属的分布，包括 Mn、Fe、Zn、Cd 和 Pb。溶胶图像可视化了明显的消耗，特别是 Zn、Cd 和 Pb 的直接根部，表明 S. Smithiana 根部充当受污染土壤中腹腔微量金属的局部沉降器。此外，还可以观察到局部 Zn、Cd 和 Pb 通量增加，表明这些微量金属在直接土壤根接口的积累。

除了多元素溶胶成像外，该方法还可以与基于增释的辅助成像技术（如平面光学34）相结合。这一点在图7C中得到了证明，其中在S.史密斯尼亚纳的rhizospher中，阴唇微量金属的分布与pH值的分布是通过结合的单层平面光电-DGT cation结合凝胶33共同本地化的。土壤基板用 （NH4）2SO4施肥，导致与散装土壤相比，根轴沿线的 pH 降低 1 单位。pH 的下降与 Mn、Fe、Co、Ni、Cu 和 Pb 的溶质通量增加共同本地化，表明 pH 引起的金属溶解。

此外，这些示例结果显示了可能获得的一些潜在的成像人工制品。例如，结构土壤的不均匀性，例如，在 图 7A的 ROI 图像的下三分之一中观察到水平线，可导致土壤凝胶接触不连续性，导致此位置的有限扩散到粘合凝胶中。相反，在rhiozotron中过度的土壤压实会导致孔隙性差，导致土壤重氧化状态向厌氧的人工转移。 图 7B中说明了这一点，其中溶质图像中高度升高的 Mn 和 Fe 通量的大面积区域与 ROI 图像中的密集土壤层在视觉上相匹配。这表明，由于土壤压实，土壤重氧化的可能性降低，导致高度重氧化敏感元素的还原溶解和溶解。因此，建议在灌装后直接对土壤表面进行仔细的 rhizotron 填充和目视检查。

figure-results-1
图7:不同土壤根界面的阴唇养分和污染物溶质物种的亚毫米二维分布。（A） 在年轻的F. 埃斯库伦图姆根周围分布的食人性 P 和 cationic Mg、Al、Mn 和 Fe 溶质。在=75%WHC的土壤水饱和度下，使用HR-MBG对阴离子和阴离子溶胶进行了24小时的联合局部取样。Al、P 和 Mn 图像显示为校准fDGT值（pg cm-2 s-1），而 Mg 和 Fe 图像显示13C 规范化强度。比例尺条代表 1 厘米。这个数字是根据参考48改编的。（B） 在中度受Zn、Cd和Pb污染的土壤中生长的S.smithiana根周围分布Mn、Fe、Zn、Cd和Pb。所有图像都显示为校准的 fDGT值 （pg cm-2 s-1）。刻度条代表 0.5 厘米。这个数字是根据参考3改编的。（C） 通过修改HR-MBG协议，实现了在土壤中生长的S.Smithiana根部周围的pH和多个cationiana溶解物的分布，并采用CD.pH和溶胶动力学的联合定位，允许同时进行溶胶采样和平面光电成像33。 Mn、Cu、Zn 和 Cd 图像以校准fDGT值（pg cm-2 s-1）显示，而 Fe、Co、Ni 和 Pb 图像显示13个 C 规范化强度。比例尺条代表 1 厘米。这个数字是根据参考33改编的。所列数字转载自引用的第3条、第33条、第48条，这些条文根据CC BY获得许可。请点击这里查看此数字的较大版本。

补充文件 1.请点击这里下载此文件。

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

此处介绍的溶质成像方案是一种多功能方法，可可视化和量化土壤植物环境中的二维养分和污染物通量。它具有独特的能力，能够产生亚毫米比例的多元素图像的腹腔溶质物种在土壤根界面，超过可实现的空间分辨率的替代方法测量溶质梯度在rhizosphere基本上4。DGT 的定点现场采样方法，结合 LA-ICP-MS 等高度敏感的化学分析方法，有助于详细研究土壤或类似基质中生长的单个植物根部周围的溶质通量动力学。由于基于水槽的取样过程，获得的图像反映了可视化溶解物的易感性，因此估计其植物可用性为10。虽然溶质通量的方法固有的测量具有相当大的优势，如可解释为植物可用的营养成分，但通量测量远不如孔水浓度测量更直接理解。散装土壤应用中的标准 DGT 采样几何形状（特别是该设置中使用的 0.8 毫米厚扩散凝胶）允许通过批量 DGT 测量cDGT和解释这些参数对溶质物种的再补给动力学进行比较实际孔隙水浓度、csoln和时间平均孔水浓度估计值。但是，这种比较不能基于具有非常薄扩散层的成像 DGT 应用程序进行，因为派生的cDGT值是不切实际的小34。因此，DGT成像结果并不总是简单和快速的解释，往往不能直接与更传统的孔隙水浓度测量相提并论。

在应用该方法时，需要仔细考虑一些关键步骤，主要涉及灌装和浇注 rhizotron 生长容器。在将土壤填入 rhizotron 时，避免过多压实土壤非常重要，因为植物根不能穿透强压实的土壤，根的生长将受到抑制。我们观察到根部避免强烈压实的土壤，沿着rhistron生长容器的内缘生长，那里的土壤通常不太紧凑。在这种情况下，位于rhigzotrons中心的单个根，其中DGT凝胶可以方便地应用，可能根本不开发，有效地抑制了成功的凝胶应用。在我们的实验室中，经验表明，1.0-1.4 gcm-3 的干燥土壤散装密度允许不受阻碍的根部发育。此外，过度的土壤压实也是有关氧化物敏感元素和生物地球化学相关物种溶解性的潜在人工来源。由于毛孔总体积减少，毛孔直径分布向高度压实土壤中的低直径转移，因此可用的气填充量较小，从而可能导致局部的还原条件。因此，MnIII/IV- 和 FeIII- 氧化物可能会减少，导致 Mn2+ 和 Fe2+ 通量增加。Fe-oxides的溶解是磷酸盐和微量营养素的重要吸附点，可以解放冰山和/或共同沉淀的物种，从而导致生物地球化学相关物种的人工增高通量。如果生长容器浇水过多，也可能会出现类似的问题。通过生长容器顶部的小土壤表面积蒸发量较低，土壤在种植后可能保持水饱和长达几个星期，这也可能导致重氧化人工制品。

另一个重要考虑因素是制造 HR-DGT 结合凝胶的化学功能。通过遵循协议，获得具有均匀分布的绑定相的薄凝胶。如果凝胶具有不均匀的材料分布区域（例如凝胶或结合相聚合的孔），则需要去除这些区域，或者，如果范围太广，则需要重复凝胶制造协议。如果准备正确，凝胶必须能够结合目标溶胶物种，立即和定量地扩散到凝胶27，这是由分析特异性凝胶结合能力决定的。虽然在未受污染的土壤中，超过凝胶容量的问题较小，但在金属污染土壤和盐碱土壤环境中应予以考虑。凝胶结合相的饱和不仅会损害定量溶胶采样，而且还会导致凝胶中结合相之间的溶解物横向扩散，导致小规模溶胶通量特征的无限期本地化。因此，如果目标土壤环境中预期有大量阴唇养分/污染物物种，则应进行初步测试。对于估计预期的DGT负荷，散装土壤DGT活塞采样，其次是凝胶elution和湿化学分析可以应用15，49。如有必要，可调整 DGT 部署时间以减少凝胶接触时间，从而避免凝胶饱和度超过容量阈值。相反，初步测试也有助于确定所需的凝胶接触时间和/或LA-ICP-MS灵敏度，如果非常低的溶质负荷预期，这可能是重要的映射微量元素溶解物在自然土壤背景水平15。此外，在制定DGT LA-ICP-MS校准标准时，应通过对凝胶的可控加载进行实验应用前验证正确的DGT凝胶功能。凝胶标准提供矩阵匹配的参考凝胶分析加载，可用于评估 LA-ICP-MS 确定的样品凝胶装载是否在预期范围内。如果无法获得与气体和方法空白背景噪声不同的信号，操作员必须确保实施跟踪元素分析的实验室程序，并正确执行所有协议步骤。有时，DGT 凝胶在用土壤暴露的、加载的侧面朝向玻璃板而不是激光束进行溶胶采样后意外翻转，导致最终溶胶通量图像中信号强度低且错误地翻转特征。

在洛杉矶-ICP-MS分析期间，生成了大量数据，这需要相当长的时间进行评估。在我们的实验室中，我们使用针对目标数据输出格式定制的内部数据评估脚本，使用标准电子表格软件。半自动排序和校准后，使用开源、开放访问图像分析工具（ImageJ，斐济50）进行图像绘图。这种方法允许完全控制数据排序、评估和演示，这一点至关重要，因为收集的数据对应于矩形，而不是二次像素，这需要正确地显示在生成的 solute 地图中。此外，在数据处理过程中，应小心避免任何像素插点。像素插点导致化学图像的梯度平滑，导致软化，通常是圆形元素分布特征，因此是原始数据的不良变化。像素插管是许多图像处理软件产品重新缩放和重新格式化操作的标准程序，但通常可以取消选择。

总之，上述方法是了解天然土壤-里佐圈-植物系统中的养分和污染物动力学的重大进展。除了 DGT 专用应用外，该方法还可以与其他基于扩散的成像技术（如平面光学 3、33、42、43、48、51 和 zym 光谱20、21、22、23、24）相结合，并可进一步开发以包括附加元素和土壤参数。

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项研究由奥地利科学基金（FWF）:P30085-N28（托马斯·普罗哈斯卡）和奥地利科学基金（FWF）以及下奥地利联邦州共同资助:P27571-BBL（雅科布·桑特纳）。

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
（NH4）2S2O8（过硫酸铵;APS）VWR21300.260≥98.0%，分析试剂
2-（N-吗啉代）-乙磺酸 （MES）Sigma-AldrichM8250-100G≥99.5%
丙烯酰胺溶液Sigma-AldrichA4058-100ML40%，用于电泳
分析物盐n/an/a使用分析级或更高级别的水溶性分析物盐
Buechner 漏斗VWR511-006513 cm 板直径
化学平衡建模软件KTH 瑞典n/aVisual MINTEQ
Clamp本地仓库n/a
桌面排版软件Adobe Inc.n/aInDesign CS6
DGT 交联剂DGT Research Ltdn/a2%，琼脂糖衍生物
DGT 活塞采样器DGT Research Ltdn/a2 cm 直径曝光窗口
数码单镜头反光 （DSLR） 相机佳能公司n/a佳能 EOS 1000D
分散装置IKA3737000Ultra-Turrax T10 基本
双面胶带Tesa56171
乙醇Sigma-Aldrich34923Puriss. p.a.， 绝对， & ge;99.8%
凝胶印迹纸Whatman10426981印迹纸，GB005 级，20 & 次，1.5 mm 厚度
干燥器UniEquipn/aUNIGELDRYER 3545
高压微波系统Anton Paarn/aMultiwave 3000
HNO3VWR1.00456.2500P65%，ISO 用于分析
摇床GFL305
HydroMed D4AdvanSource Biomaterials Corp.n/a醚基亲水性氨基甲酸酯
ICP-MS 软件Perkin Elmern/aSyngistix
图像分析软件美国国立卫生研究院 （NIH）n/aImageJ 斐济，免费提供 https://fiji.sc/
刀式涂布设备BYK5561单棒 6″，0.5 mils
LA 软件Elemental Scientific 激光器n/aActiveView
LA 系统Elemental Scientific 激光器n/aNWR193
层流工作台Telstar 实验室设备 BVn/aII 类生物安全柜
磁力搅拌器IKA0003582400C-MAG MS 7
防潮膜Bemis Company， Inc.PM999封口膜 M，4" x 250'N，N，N
'，N'-四甲基乙二胺 （TEMED）Sigma-AldrichT9281-50ML生物试剂，适用于电泳，~99%
NaNO3Sigma-Aldrich229938-10G99.995% 痕量金属基础
NaOHSigma-Aldrich1064980500用于分析
的颗粒顶置摇床GFL3040
全氟烷氧基烷烃 （PFA） 样品瓶Savillex200-015-2015 mL 标准样品瓶，圆形内部
pH 计Thermo Scientific13-644-928Orion 3 星台式 pH 计
pH 探头Thermo Scientific8157BNUMDOrion ROSS Ultra pH/ATC 三极管
塑料切割机DGT Research Ltdn/a使用 DGT research Ltd 的空交联剂样品瓶
塑料镊子Semadeni602
橡皮泥当地文具店n/a基于石蜡和膨胀剂的不干燥塑料建模块
聚碳酸酯膜盘Whatman110606Nuclepore 亲水膜，直径 25 毫米，0.2 &微米;m 孔径，10 & micro;m 厚度
聚碳酸酯膜片Whatman113506Nuclepore 亲水膜，8 & 10 英寸，0.2 µm 孔径，10 & micro;m 厚度
聚醚砜膜盘Pall Corporation60172Supor 450 膜盘式过滤器，直径 25 mm，0.45 µm 孔径，0.14 mm 厚
聚醚砜膜片颇尔公司60179Supor 450 膜盘式过滤器，直径 293 mm，0.45 µm 孔径，0.14 mm 厚
PTFE 箔Haberkornn/a50 µm 厚度
PTFE 垫片Haberkornn/a厚度可变
PTFE 涂层剃须刀片Personna GEM62-0178不锈钢单刃刀片（涂层）
PTFE 涂层 Tygon 管S-prep GmbHSP81800.32 cm 内径
四极杆 ICP-MSPerkin ElmerN8150044NexION 2000B
定量滤纸，454VWR516-0854颗粒截留 12-15 µm
电子表格软件Microsoft Corporationn/aMicrosoft Excel 2016 （v16.0）
不锈钢切割机当地锁匠n/a直径 2.5 厘米
悬浮颗粒试剂 - 亚氨基二乙酸酯 （SPR-IDA）Teledyne CETAC Technologiesn/a10 µm 直径的聚苯乙烯微珠，10 % （w/v） 微珠悬浮
晶体管-晶体管逻辑 （TTL） 电缆n/an/a请咨询 ICP-MS 技术人员，以确定适合特定仪器的 TTL 电缆
两体积池Elemental Scientific 激光器n/a双体积池 1
个乙烯基电工胶带3Mn/aScotch Super 33+
水净化系统TermoElectron LED GmbHn/aTKA-GenPure
ZrOCl2 & 8H2OAlfa Aesar86108.3099.9 %， 金属基础
凝胶 水平液

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hinsinger, P., Gobran, G. R., Gregory, P. J., Wenzel, W. W. Rhizosphere geometry and heterogeneity arising from root-mediated physical and chemical processes. New Phytologist. 168 (2), 293-303 (2005).
  2. Jungk, A. Plant Roots: The Hidden Half. , Marcel Dekker. New York. ch35 587-616 (2002).
  3. Hoefer, C., Santner, J., Puschenreiter, M., Wenzel, W. W. Localized metal solubilization in the rhizosphere of Salix smithiana upon sulfur application. Environmental Science & Technology. 49 (7), 4522-4529 (2015).
  4. Luster, J., Göttlein, A., Nowack, B., Sarret, G. Sampling, defining, characterising and modeling the rhizosphere-the soil science tool box. Plant and Soil. 321 (1), 457-482 (2009).
  5. Oburger, E., Schmidt, H. New Methods To Unravel Rhizosphere Processes. Trends in Plant Science. 21 (3), 243-255 (2016).
  6. Göttlein, A., Hell, U., Blasek, R. A system for microscale tensiometry and lysimetry. Geoderma. 69 (1), 147-156 (1996).
  7. Göttlein, A., Heim, A., Matzner, E. Mobilization of aluminium in the rhizosphere soil solution of growing tree roots in an acidic soil. Plant and Soil. 211 (1), 41-49 (1999).
  8. Hinsinger, P., Gilkes, R. J. Dissolution of phosphate rock in the rhizosphere of five plant species grown in an acid, P-fixing mineral substrate. Geoderma. 75 (3), 231-249 (1997).
  9. Wenzel, W. W., Wieshammer, G., Fitz, W. J., Puschenreiter, M. Novel rhizobox design to assess rhizosphere characteristics at high spatial resolution. Plant and Soil. 237 (1), 37-45 (2001).
  10. Degryse, F., Smolders, E., Zhang, H., Davison, W. Predicting availability of mineral elements to plants with the DGT technique: a review of experimental data and interpretation by modelling. Environmental Chemistry. 6 (3), 198-218 (2009).
  11. Mason, S., McNeill, A., McLaughlin, M. J., Zhang, H. Prediction of wheat response to an application of phosphorus under field conditions using diffusive gradients in thin-films (DGT) and extraction methods. Plant and Soil. 337 (1), 243-258 (2010).
  12. Six, L., Smolders, E., Merckx, R. The performance of DGT versus conventional soil phosphorus tests in tropical soils-maize and rice responses to P application. Plant and Soil. 366 (1), 49-66 (2013).
  13. Mason, S. D., McLaughlin, M. J., Johnston, C., McNeill, A. Soil test measures of available P (Colwell, resin and DGT) compared with plant P uptake using isotope dilution. Plant and Soil. 373 (1), 711-722 (2013).
  14. Freese, D., Lookman, R., Merckx, R., van Riemsdijk, W. H. New Method for Assessment of Long-Term Phosphate Desorption from Soils. Soil Science Society of America Journal. 59 (5), 1295-1300 (1995).
  15. Smolders, E., Wagner, S., Prohaska, T., Irrgeher, J., Santner, J. Sub-millimeter distribution of labile trace element fluxes in the rhizosphere explains differential effects of soil liming on cadmium and zinc uptake in maize. Science of The Total Environment. , 738(2020).
  16. Bhat, K. K. S., Nye, P. H. Diffusion of phosphate to plant roots in soil. Plant and Soil. 38 (1), 161-175 (1973).
  17. Glud, R. N., Ramsing, N. B., Gundersen, J. K., Klimant, I. Planar optrodes: a new tool for fine scale measurements of two-dimensional O2 distribution in benthic communities. Marine Ecology Progress Series. 140, 217-226 (1996).
  18. Blossfeld, S., Gansert, D. A novel non-invasive optical method for quantitative visualization of pH dynamics in the rhizosphere of plants. Plant, Cell & Environment. 30 (2), 176-186 (2007).
  19. Larsen, M., Borisov, S. M., Grunwald, B., Klimant, I., Glud, R. N. A simple and inexpensive high resolution color ratiometric planar optode imaging approach: application to oxygen and pH sensing. Limnology and Oceanography: Methods. 9 (9), 348-360 (2011).
  20. Spohn, M., Carminati, A., Kuzyakov, Y. Soil zymography - A novel in situ method for mapping distribution of enzyme activity in soil. Soil Biology and Biochemistry. 58, 275-280 (2013).
  21. Spohn, M., Kuzyakov, Y. Spatial and temporal dynamics of hotspots of enzyme activity in soil as affected by living and dead roots-a soil zymography analysis. Plant and Soil. 379 (1), 67-77 (2014).
  22. Heitkötter, J., Marschner, B. Soil zymography as a powerful tool for exploring hotspots and substrate limitation in undisturbed subsoil. Soil Biology and Biochemistry. 124, 210-217 (2018).
  23. Guber, A. K., Kravchenko, A. N., Razavi, B. S., Blagodatskaya, E., Kuzyakov, Y. Calibration of 2-D soil zymography for correct analysis of enzyme distribution. European Journal of Soil Science. 70 (4), 715-726 (2019).
  24. Lin, V. S., et al. Non-destructive spatial analysis of phosphatase activity and total protein distribution in the rhizosphere using a root blotting method. Soil Biology and Biochemistry. 146, 107820(2020).
  25. Ilhardt, P. D., et al. High-resolution elemental mapping of the root-rhizosphere-soil continuum using laser-induced breakdown spectroscopy (LIBS). Soil Biology and Biochemistry. 131, 119-132 (2019).
  26. Davison, W., Zhang, H. In situ speciation measurements of trace components in natural waters using thin-film gels. Nature. 367 (6463), 546-548 (1994).
  27. Davison, W. Diffusive Gradients in Thin-Films for Environmental Measurements. , Cambridge University Press. (2016).
  28. Zhang, H., Davison, W., Knight, B., McGrath, S. In Situ Measurements of Solution Concentrations and Fluxes of Trace Metals in Soils Using DGT. Environmental Science & Technology. 32 (5), 704-710 (1998).
  29. Davison, W., Fones, G. R., Grime, G. W. Dissolved metals in surface sediment and a microbial mat at 100-μm resolution. Nature. 387 (6636), 885-888 (1997).
  30. Santner, J., et al. High-resolution chemical imaging of labile phosphorus in the rhizosphere of Brassica napus L. cultivars. Environmental and Experimental Botany. 77, 219-226 (2012).
  31. Kreuzeder, A., Santner, J., Prohaska, T., Wenzel, W. W. Gel for simultaneous chemical imaging of anionic and cationic solutes using diffusive gradients in thin films. Analytical Chemistry. 85 (24), 12028-12036 (2013).
  32. Kreuzeder, A., Santner, J., Zhang, H., Prohaska, T., Wenzel, W. W. Uncertainty evaluation of the diffusive gradients in thin films technique. Environmental Science and Technology. 49 (3), 1594-1602 (2015).
  33. Hoefer, C., Santner, J., Borisov, S. M., Wenzel, W. W., Puschenreiter, M. Integrating chemical imaging of cationic trace metal solutes and pH into a single hydrogel layer. Analytica Chimica Acta. 950, 88-97 (2017).
  34. Santner, J., Larsen, M., Kreuzeder, A., Glud, R. N. Two decades of chemical imaging of solutes in sediments and soils--a review. Analytica Chimica Acta. 878, 9-42 (2015).
  35. Santner, J., Williams, P. N. Diffusive Gradients In Thin-Films For Environmental Measurements. Davison, W. , Cambridge University Press. Ch. 8 174-215 (2016).
  36. Guan, D. X., et al. Novel Precipitated Zirconia-Based DGT Technique for High-Resolution Imaging of Oxyanions in Waters and Sediments. Environmental Science & Technology. 49 (6), 3653-3661 (2015).
  37. Zhang, H., Davison, W. Performance Characteristics of Diffusion Gradients in Thin Films for the in Situ Measurement of Trace Metals in Aqueous Solution. Analytical Chemistry. 67 (19), 3391-3400 (1995).
  38. Warnken, K. W., Zhang, H., Davison, W. Performance characteristics of suspended particulate reagent-iminodiacetate as a binding agent for diffusive gradients in thin films. Analytica Chimica Acta. 508 (1), 41-51 (2004).
  39. Warnken, K. W., Zhang, H., Davison, W. Analysis of Polyacrylamide Gels for Trace Metals Using Diffusive Gradients in Thin Films and Laser Ablation Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 76 (20), 6077-6084 (2004).
  40. Gao, Y., Lehto, N. A simple laser ablation ICPMS method for the determination of trace metals in a resin gel. Talanta. 92, Supplement C 78-83 (2012).
  41. Lehto, N. J., Davison, W., Zhang, H. The use of ultra-thin diffusive gradients in thin-films (DGT) devices for the analysis of trace metal dynamics in soils and sediments: a measurement and modelling approach. Environmental Chemistry. 9 (4), 415-423 (2012).
  42. Williams, P. N., et al. Localized flux maxima of arsenic, lead, and iron around root apices in flooded lowland rice. Environmental Science & Technology. 48 (15), 8498-8506 (2014).
  43. Lehto, N. J., Larsen, M., Zhang, H., Glud, R. N., Davison, W. A mesocosm study of oxygen and trace metal dynamics in sediment microniches of reactive organic material. Scientific Reports. 7 (1), 11369(2017).
  44. Zitek, A., Aléon, J., Prohaska, T. Sector Field Mass Spectrometry for Elemental and Isotopic Analysis. , The Royal Society of Chemistry. 152-182 (2015).
  45. Lear, J., Hare, D., Adlard, P., Finkelstein, D., Doble, P. Improving acquisition times of elemental bio-imaging for quadrupole-based LA-ICP-MS. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 27 (1), 159-164 (2012).
  46. May, T. W., Wiedmeyer, R. H. A table of polyatomic interferences in ICP-MS. Atomic Spectroscopy. 19 (5), 150-155 (1998).
  47. Raposo, F. Evaluation of analytical calibration based on least-squares linear regression for instrumental techniques: A tutorial review. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 77, 167-185 (2016).
  48. Kreuzeder, A., et al. In situ observation of localized, sub-mm scale changes of phosphorus biogeochemistry in the rhizosphere. Plant and Soil. 424 (1), 573-589 (2018).
  49. Hooda, P. S., Zhang, H., Davison, W., Edwards, A. C. Measuring bioavailable trace metals by diffusive gradients in thin films (DGT): soil moisture effects on its performance in soils. European Journal of Soil Science. 50 (2), 285-294 (1999).
  50. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  51. Wagner, S., et al. Arsenic redox transformations and cycling in the rhizosphere of Pteris vittata and Pteris quadriaurita. Environmental and Experimental Botany. 177, 104122(2020).

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