无去垢剂法脱细胞化人胰腺以生产可溶性细胞外基质（ECM）

摘要

本论文中描述的方案详细说明了从人胰腺制备可溶性细胞外基质（ECM）的步骤。通过该方案获得的可溶性ECM粉末可用于在体外，以及潜在地在体内环境中模拟胰岛的微环境。

摘要

胰岛移植（ITx）有望成为β细胞替代治疗的标准方案，但其疗效仍不及全胰腺移植。目前用于人胰岛分离的方案正受到质疑，因为这些方法依赖于器官的酶消化过程，导致胰腺结构被破坏，其与机体的连接丧失，且胰岛受到不可逆损伤。胰岛损伤的关键因素之一是细胞外基质（ECM）的破坏，而ECM构成了胰岛微环境的三维结构框架，其缺失与胰岛正常生理功能不相容。研究人员提出使用来源于哺乳动物胰腺的ECM支架来解决这一问题，从而最终改善胰岛的存活率、功能及寿命。目前获取此类支架的方法较为剧烈，主要依赖去垢剂处理。因此，我们提出一种新型无去垢剂方法，可减少ECM损伤并保留胰腺ECM中的关键组分。结果显示，新开发的脱细胞化方案实现了完全的DNA清除，同时保留了ECM成分。所获得的ECM经细胞毒性测试后，包封人胰岛进行实验，在葡萄糖刺激下表现出良好的细胞行为和胰岛素分泌能力。综上所述，我们提出了一种无需使用传统离子型和非离子型化学去垢剂的人胰腺脱细胞化新方法。该方案及其所得ECM可用于体外和体内多种应用。

引言

胰岛的分离是一个精细的过程，通过酶消化胰岛与其细胞外周围支持结构之间的连接来实现。细胞外基质（ECM）的破坏是表征胰岛在分离过程中所受损伤的关键因素之一^1,2,3,4。胰岛周围ECM是内分泌胰腺中重要的无细胞成分，由蛋白质和多糖组成，这些成分相互作用并交联形成三维网络，从结构和生化层面支持生理稳态，并有助于在体外重建这一微环境^2,5,6。胰岛与ECM之间基本信号传导过程的丧失被认为是限制胰岛在体外和体内存活的因素之一^2,7,8,9,10。

动物源性和人源性细胞外基质（ECM）已被广泛用于模拟胰岛微环境^{11,12,13,14,15,16,17,18,19}。自文献²⁰首次报道ECM能够增强大鼠胰岛细胞的黏附、增殖及长期培养的维持能力以来，许多其他研究已提供有力证据，表明恢复人胰岛与天然ECM的相互作用可增强胰岛功能^21,22。例如，近期数据显示，在糖尿病小鼠模型中，用ECM包封的胰岛显著改善了血糖控制，从而在一个新型的基于细胞的胰岛素递送平台中增强了胰岛素的释放并促进了其递送效率²³。此外，研究还表明，将胰腺ECM的关键组分整合入培养体系可显著改善β细胞的内分泌功能^24,25,26,27。

文献中报道的细胞外基质（ECM）制备方案主要基于使用化学去垢剂，例如Triton X-100或十二烷基硫酸钠（SDS）。尽管这些方法在去除DNA方面效果显著，但脱细胞过程中所用的化学试剂具有细胞毒性、成本较高，且残留于脱细胞组织中的化学物质可能对临床应用带来安全隐患。

基于这些观察结果，本研究的目的有三：首先，开发一种对人类胰腺进行脱细胞的方法，尽量减少离子或非离子化学去污剂的使用；其次，制备一种可溶性的细胞外基质（ECM）支架用于组织培养；第三，对胰腺ECM进行表征，以评估其细胞毒性及其对胰岛细胞功能的影响。此类表征对于所有基于细胞培养的应用均至关重要，因为它表明可溶性胰腺ECM可能有助于重建分离胰岛所处的胰腺微环境。本文描述了一种有效且无需去污剂的人类胰腺脱细胞方法、ECM的表征，以及ECM对包封的人类胰岛细胞活力和功能的影响。

方案

本研究已获得维克森林浸信会医学中心人体研究委员会的批准。人类胰腺通过卡罗来纳器官捐赠服务组织从器官捐献者处合乎伦理地获取。根据联合国器官共享网络（UNOS）的规定，对器官捐献者进行了与人类相关的传染病筛查。器官接收时置于无菌保存液中，并在此条件下保存至使用前。送达实验室后，对所有器官进行检查，并采集部分天然胰腺组织用于组织学分析。随后，器官被冷冻并在无菌条件下于 -20 °C 保存，以备后续使用。

1. 人胰腺的手术准备

注意：冷冻的胰腺在 4 °C 下过夜解冻。

1. 在开始人胰腺的手术解剖之前，准备1 L清洗液，包含950 mL去离子水（dH₂O）、50 mL含碘试剂和1%青霉素-链霉素溶液。
2. 手术解剖过程中需佩戴无菌手套和实验服。所有操作均应在细胞培养级生物安全柜中进行，以避免可能的污染。
3. 将胰腺从无菌转运袋中转移至无菌胎盘盘中。确保胰腺的方向为头部在左侧，尾部在右侧。
4. 使用无菌剪刀和无齿镊子小心地从胰腺头部分离十二指肠。注意不要在十二指肠上造成穿孔，因为这会增加污染的风险。
   注意：若胃肠道出现穿孔，应立即夹闭穿孔部位，并继续进行解剖操作。
5. 完成胰腺头部的解剖后，将十二指肠放入适当的生物危害废物袋中，并按照机构规定进行处理。
6. 解剖并清除胰腺头部周围残留的所有胰外组织，包括主要血管和胆总管；这些结构通常在器官获取时已用不可吸收缝线标记。清除的组织应按照机构规定进行处置。
7. 解剖并清除胰腺尾部周围的所有胰外组织及胰周脂肪组织，暴露脾脏血管。
8. 一旦暴露脾脏的血管蒂，移除脾脏，并完整解剖脾脏血管，包括附着于胰腺后表面的部分（脾动脉和脾静脉）。脾脏及所清除组织应按照机构规定进行处置。
9. 仔细解剖并清除所有明显可见的胰外脂肪组织，尤其是胰周脂肪组织。
   注意：在胰腺尾部水平，可能可见腹膜后组织。应用无齿镊子将其提起，使用手术镊子适当移除，并妥善处理。此时胰腺应已完全去除所有胰外组织。
10. 使用手术剪刀、灭菌的组织学刀片或手术刀片将胰腺组织切割成1 cm³的立方体。解剖所得的胰腺组织块将用于脱细胞处理。接受脱细胞处理的胰腺组织块数量取决于器官的内在特性。在本研究中，平均有40–60个胰腺组织块接受了脱细胞处理。
11. 进入步骤2.1

2. 胰腺组织的脱细胞处理

注意：本方案适用于平均重量为 100 g 的胰腺；因此，使用该脱细胞技术时，不建议超过此重量。

1. 将步骤 1.10 中先前解剖的所有胰腺组织放入一个无菌塑料容器（参见材料表）中，并加入洗涤液，在室温（RT）下孵育 15 分钟。
2. 使用无菌镊子取出胰腺组织，转移至一个新的无菌容器中，容器内含有无菌、无内毒素的去离子水。将容器盖紧，置于设定温度为 4 °C、振荡速度为 180–200 rpm 的冷藏轨道摇床上，振荡 24 小时。
3. 取出含有胰腺组织的容器，在将其放入超净台继续操作前，适当清洁容器外表面。
4. 使用手术镊子取出胰腺组织，放入一个新的无菌容器中，加入 1 L 去离子水、50 mg DNase I 和 0.0025% 氯化镁。盖紧容器盖，置于轨道摇床中，在预设温度 37 °C、振荡速度 100 rpm 的条件下振荡 6 小时。
5. 配制 EDTA-Trizma 溶液
   1. 取一个新的无菌 1 L 容器，在将其引入超净台前适当清洁。为配制 1 L EDTA-Trizma 溶液，加入以下成分：985 mL 无菌去离子水、7.5 mL Tris-HCl 缓冲液和 7.5 mL EDTA 溶液。配制完成后于 4 °C 保存，待用。
6. 取出包裹胰腺组织的容器，在将其引入超净台继续操作前，适当清洁容器外表面。
7. 使用手术镊子取出胰腺组织，放入一个新的无菌容器中，加入 1 L 基于 EDTA-Trizma 的溶液。盖紧容器盖，置于轨道摇床中，在预设温度 4 °C、振荡速度 180–200 rpm 的条件下振荡 18 小时。
8. 取出含有胰腺组织的容器，在将其引入超净台进行后续操作前，适当清洁容器外表面。
9. 使用无菌镊子取出胰腺组织，转移至一个新的无菌容器中，容器内含有无菌、无内毒素的去离子水。盖紧容器盖，置于冷藏轨道摇床上，在设定温度 4 °C、振荡速度 180–200 rpm 的条件下振荡 24 小时。
   注意：在此处理过程中，组织颜色将发生明显变化，表现为组织变得更亮。
10. 收集胰腺组织，将其分装至无菌的 50 mL 离心管中，每管最多装 25 mL，用于后续冷冻和冻干处理。离心管数量根据胰腺大小而定。样品于 -80 °C 保存。

3. 胰腺细胞外基质粉末的制备——冻干与低温研磨

1. 将脱细胞材料在 -80 °C 下至少储存 24–40 小时后，将其转移至冷冻干燥机中。
2. 将冷冻的材料转移至冷冻干燥机中，防止材料解冻。
   注意：冻干过程大约需要 3–5 天，具体时间取决于多种因素，例如每管中待处理材料的量以及用于冻干的暴露表面积。建议每管中的脱细胞组织不超过 25 mL，并将试管以 45° 角度冷冻，以便在冻干开始后使更大表面积暴露。移除试管盖。
3. 冻干完成后，将材料转移至细胞培养级生物安全柜中。
4. 使用无菌剪刀将每块干燥的 ECM 切割成原大小的一半。这些干燥的 ECM 片段将接受自动化研磨处理，以制备 ECM 粉末。使用冷冻研磨自动处理器，以避免温度升高导致 ECM 生物特性发生变性。确保调整冷冻研磨机的参数设置，以在研磨后获得细粉末。
   注意：本研究中使用的是 BMI < 30 的供体胰腺。BMI > 30 的供体胰腺倾向于含有更多的实质内脂肪。脂肪含量可能影响冻干过程，使其效果不理想甚至受阻。若在冻干后组织明显呈油性，则必须弃用，因其不适合用于制备 ECM 粉末。

4. 胰腺细胞外基质的溶解

注意：此时，从一个平均大小的胰腺（100 g）中，脱细胞胰腺粉末的产量为 1–2 g。

1. 使用无菌塑料刮勺称取1 g ECM粉末。
2. 按照先前描述的方案进行溶解：将1 g ECM溶于100 mL 0.01 M HCl中，并加入100 mg胃蛋白酶，在室温下持续搅拌48小时²⁸。
3. 48小时后，在冰上放置含有酸性ECM的烧杯以防止凝胶化，同时使用NaOH将酸性ECM的pH值中和至7。
   注意：凝胶动力学受温度、胶原蛋白含量、pH值及中和溶液的影响而变化。在本研究中，使用0.01 M NaOH进行中和，加入的NaOH体积约为100 mL。建议在中和酸性ECM溶液过程中多次测量pH值。
4. 将中和后的ECM溶液转移至无菌的50 mL离心管中。盖紧管盖后放入离心机，在4 °C条件下以最大速度（12,000 x g）离心15分钟。离心完成后，将离心管转移至细胞培养操作台。
   注意：样品离心后，ECM的不溶性成分将沉积于管底，而溶解的ECM溶液则存在于上清液中。
5. 采用无菌操作技术，收集含有溶解ECM溶液的离心管中的上清液，并转移至新的50 mL离心管中，每管最多装25 mL。
6. 将ECM溶液管储存于-80 °C条件下。

5. 胰腺细胞外基质粉末的制备——冻干与保存

1. 将可溶性细胞外基质（ECM）溶液在 -80 °C 下保存至少 24–40 小时后，将试管转移至冷冻干燥机中。
2. 将冻结的材料转移至冷冻干燥机中，确保材料不发生融化。
   注意：冻干过程大约需要 3–5 天，具体时间取决于多种因素，例如每支试管中待处理材料的量以及用于冻干的暴露表面积。建议每支试管中的可溶性 ECM 溶液体积不超过 25 mL，并将试管以 45° 角度冷冻，以便在冻干开始后暴露更大的表面积。在冻干前需取下 Falcon 试管的管盖。
3. 可溶性 ECM 溶液冻干完成后，将材料转移至细胞培养级生物安全柜中。完全冻干后，可见细粉末状的 ECM。
   注意：每 1 g 脱细胞组织可获得约 700 mg 的产物。
4. 储存可溶性 ECM 粉末或用于细胞培养。
   注意：建议将 ECM 在 4 °C 下短期使用，-20 °C 下中期保存，-80 °C 下长期储存。

6. 通过组织学染色对胰腺细胞外基质进行表征

1. 在器官获取后、脱细胞处理前，立即采集一块天然胰腺组织。将其在10%福尔马林中固定24小时。用去离子水清洗样品，随后经梯度酒精脱水，包埋于石蜡中，并切成5 mm切片。
2. 脱细胞过程结束后，取部分脱细胞材料样品，在10%福尔马林中固定24小时。用去离子水清洗样品，经梯度酒精脱水后，包埋于石蜡中，并切成5 mm切片。
3. 为验证脱细胞是否成功，对天然胰腺组织及其对应的脱细胞组织进行H&E染色和DAPI染色。
4. 为进行组织学表征，分别进行Masson三色染色（MT）和阿利新蓝染色（AB），以突出显示胶原结构和糖胺聚糖（GAGs）结构。

7. 可溶性细胞外基质粉末的表征

1. 按照先前所述方法对天然胰腺组织和可溶性细胞外基质粉末进行DNA含量和总胶原蛋白分析²⁹。
2. 根据 commercially available kit 提供的方案定量硫酸化糖胺聚糖（sGAG）含量（参见 材料表）。使用微孔板分光光度计在595 nm波长下测定胰腺细胞外基质中的硫酸化sGAG含量³⁰。
   注意：DNA含量以每毫克干重组织中的ng表示，胶原蛋白和GAGs含量以每毫克干重组织中的μg表示。

8. 人胰岛的ECM包封与培养

注意：人胰腺胰岛购自商业来源（见材料表）。

1. 到达后，将人胰岛置于非组织培养处理的培养皿中，在标准条件下培养24小时，每10 cm培养皿中接种密度约为2,000 IEQ。
2. 对人胰岛进行操作，以测试细胞外基质（ECM）对胰岛功能性和存活率的影响，实验分组如下：游离胰岛、海藻酸盐包封胰岛以及海藻酸盐-ECM包封胰岛。
   注意：上述各组胰岛在体外标准条件下培养最多8天，以评估ECM对胰岛功能性和存活率的影响。
3. 用天平称取海藻酸盐，并用HBSS将其悬浮于离心管中，配制成1.5%（w/v）的溶液。将离心管置于4 ˚C旋转仪上过夜。
   注意：制造商报告所用海藻酸盐的分子量为75–200 kDa，G/M比值≤1。
4. 称取0.1 mg ECM，溶于1 mL先前配制的海藻酸盐溶液中，使ECM终浓度为0.1 mg/mL。
5. 根据先前描述的方案³¹，将人胰岛包封于海藻酸盐和海藻酸盐-ECM中。简要步骤如下：
   1. 轻柔收集并混合3,000 IEQ胰岛与1 mL海藻酸盐溶液，以及3,000 IEQ胰岛与1 mL含0.1 mg/mL ECM浓度的海藻酸盐-ECM溶液（该溶液按步骤8.4预先配制）。
   2. 将所得悬浮液以0.2 mL/min的流速和2.0 Pa的气压，通过微流控包封装置进行泵送。
   3. 包封完成后，将微胶囊收集至含10 mM HEPES的100 mM CaCl₂溶液中，交联反应持续10分钟。
   4. 培养前，在标准条件下用HBSS于37 ˚C洗涤包封胰岛2–3分钟，并维持5% CO₂环境。
   5. 加入培养基（见材料表），每隔一天更换三分之二的培养基，直至实验结束。
      注意：上述步骤需同时应用于海藻酸盐包封胰岛和海藻酸盐-ECM包封胰岛。
6. 包封后第8天，进行葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）实验和DNA分析，分别评估胰岛素产量和胰岛存活率。
7. 获取游离胰岛和包封胰岛的明场图像及活/死细胞染色结果，以评估细胞形态和存活状态。
   注意：通过定性图像分析评估胰岛健康状况，考虑的参数包括胰岛的形状、边界、完整性、直径以及培养中是否存在单个细胞。

9. 葡萄糖刺激的胰岛素释放（GSIS）与DNA含量测定

注意：在封装后的第8天，收集人胰岛并用含有低浓度（2.8 mM）和高浓度（16.8 mM）葡萄糖的Kreb's缓冲液孵育，随后加入KCl去极化溶液（25 mM）。葡萄糖刺激实验参照先前描述的方案稍作修改³²。

1. 将凝胶过滤树脂装入聚丙烯柱中。
2. 将处理组（游离胰岛或包封胰岛）置于聚丙烯柱内凝胶过滤树脂的中段位置。
3. 用移液器将葡萄糖溶液和去极化溶液依次加入上述聚丙烯柱中，并按以下顺序孵育1小时：先用低摩尔浓度葡萄糖溶液进行预孵育，随后按照第9节开头的注释所述，依次进行低浓度、高浓度、低浓度和去极化葡萄糖溶液的系列孵育。
4. 收集每一孵育阶段的培养基，并于-80 °C保存，以备后续分析。
5. 在完成去极化溶液的孵育及收集后，将人胰腺胰岛与1 mL DNA提取缓冲液共同孵育，并保存至进一步分析。
6. 按照制造商说明书，使用胰岛素ELISA试剂盒测定葡萄糖溶液和去极化溶液孵育后样品中的胰岛素含量。
7. 使用DNA检测试剂盒，按照制造商说明书，测定步骤9.5中收集的提取缓冲液中的DNA含量。
8. 根据DNA含量对胰岛素测定结果进行标准化处理。

10. 统计分析

注意：组间比较基于同一批人胰岛，针对本文所述每项检测均进行了 n = 3 次独立评估。数据以均值 ± 标准差表示。

1. 使用统计软件对天然胰腺、脱细胞胰腺和溶解的细胞外基质（ECM）进行脱细胞效果及DNA残留分析的Mann-Whitney检验。
2. 对天然胰腺、脱细胞胰腺和溶解的细胞外基质（ECM）之间的糖胺聚糖和胶原蛋白含量进行非配对t检验。
3. 对第8天胰岛刺激实验中的葡萄糖刺激试验采用双因素方差分析（2-way ANOVA），并进行Tukey多重比较事后检验。
4. 统计学显著性定义为 p < 0.05，以 *p < 0.05、**p<0.01、***p < 0.001 和 ****p < 0.0001 表示显著性水平。

结果

对天然及无细胞胰腺样本进行H&E、MT和AB组织学染色处理。H&E染色显示细胞核物质和细胞完全缺失，证实脱细胞化成功。MT和AB染色分别显示细胞外基质的结构框架，定性突出胶原成分和间质成分（图1）。

该方法能够从人胰腺中稳定地制备出细胞外基质（ECM）粉末。DNA定量检测证实细胞清除效果良好³³。为了评估基本的生物学组成，对天然、去细胞化及可溶性胰腺ECM进行了生化表征。结果显示胰腺ECM已实现去细胞化且无DNA残留（DNA < 50 ng·mg^-1 干组织），胶原蛋白和糖胺聚糖得到了一致性的保留，这与既往报道结果一致^11,15。DNA分析显示，去细胞化和可溶性胰腺ECM中的脱氧核糖核酸均被有效清除（去细胞化胰腺组织中从4.56 μg/mg ± 3.42 μg/mg降至30.05 ng/mg ± 22.89 ng/m...

讨论

本研究的目的是开发一种更温和、无需去污剂的脱细胞化方案，以制备胰腺细胞外基质（ECM）。在脱细胞化过程中，重点关注胰腺实质中细胞外基质成分的保留，并避免组织长时间暴露于传统的离子型或非离子型化学去污剂中。

所开发的脱细胞方法最具创新性的方面在于避免使用传统的离子型和非离子型化学去污剂。我们此前在制备人胰腺细胞外基质（ECM）^{11,12,13,22,34,35}方面的经验为制备无细胞胰腺支持介质奠定了基础。然而，通过胰管、肠系膜上动脉和脾动脉灌注数百升化学去污剂^11,13的方法需...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
带45毫米瓶盖的康宁1升易握聚苯乙烯储存瓶	ThermoFisher	430518	用于脱细胞处理的容器
低温研磨仪	SPEX Certiprep	6870-230
牛胰脱氧核糖核酸酶I	Sigma Aldrich	DN25
蒸馏水	ThermoFisher	15230147
康宁Falcon 50毫升圆锥形离心管	Corning	352070
人胰腺	na	na
胰岛素ELISA试剂盒	Mercodia	10-1113-01
氯化镁，1M，无菌	Bio-World	41320004-1
猪胃黏膜来源胃蛋白酶	Sigma Aldrich	P7012-5G
无盖无菌胎盘盘	DeRoyal	32-881
PolyPre层析管	Bio-rad	731-1500	聚丙烯层析柱
Quant-iT PicoGreen双链DNA检测试剂盒	Invitrogen	P7589	DNA检测试剂盒
SamplePrep大容量冷冻/研磨仪配件	SPEX	6801	大容量研磨罐套装
Sephadex G-10凝胶珠	Cytiva	17001001	凝胶过滤树脂
手术器械包	na	na
UltraPur 0.5M EDTA，pH 8.0	ThermoFisher	15575020
UltraPur 1 M Tris-HCI缓冲液，pH 7.5	ThermoFisher	15567027
UltraPure无DNase/RNase蒸馏水	ThermoFisher	10977023