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方法文章

农杆菌介导的遗传转化、转基因植株创制及其在水稻雄性生殖发育研究中的应用

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DOI：

10.3791/61665

⸱

2020年10月6日

 ,  ,  ,  , 
1Joint International Research Laboratory of Metabolic and Developmental Sciences, Shanghai Jiao Tong University-University of Adelaide Joint Centre for Agriculture and Health, School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, 2College of Agronomy, Anhui Agricultural University, Heifei, China, 3School of Agriculture, Food and Wine, University of Adelaide

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究描述了利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术敲除内源性基因的方法 OsABCG15 随后进行改良的 农杆菌-通过介导转化方案培育水稻稳定雄性不育系

摘要

雄性不育是杂交种子生产中重要的农艺性状，通常表现为雄性生殖器官或配子的功能缺陷。近年来，CRISPR-Cas9基因组编辑技术的进步使得在特定位点对内源候选基因进行高效编辑和快速敲除突变成为可能。此外， 农杆菌介导的水稻遗传转化也是基因修饰的一种关键方法，已被众多公共和私人实验室广泛采用。在本研究中，我们应用了CRISPR-Cas9基因组编辑工具，通过靶向基因组编辑成功获得了三个雄性不育突变系 OsABCG15 在一个 japonica 品种。我们采用了一种改良的 农杆菌介导的水稻转化方法，可为水稻杂交种子生产提供优良的遗传雄性不育手段。在2–3个月内即可获得转基因植株，并通过PCR扩增和Sanger测序进行基因分型以筛选纯合转化子。对雄性不育纯合系的基本表型特征分析，通过显微镜观察水稻雄性生殖器官，并利用碘化钾碘溶液（I2-KI染色发育中花药的半薄横切片。

引言

水稻是最重要的粮食作物，尤其是在发展中国家，全球超过一半人口以水稻为主食。总体而言，稻米的需求量正在不断增长，预计到2030年将增加50%，到2050年将翻倍1,2。未来水稻产量的提升需要充分利用多种分子和遗传资源，这些资源使水稻成为单子叶植物研究的理想模式作物。这些资源包括高效的遗传转化系统、先进的分子遗传图谱，以及多年来积累并公开可获取的表达序列标签数据库3,4。提高作物产量的一种策略是杂交种子生产5，其核心在于对雄性育性的调控能力。深入了解谷类作物雄性育性的分子调控机制，有助于将关键科学知识转化为实用技术，从而改进杂交种子生产并提高作物产量6,7。

遗传转化是基础研究和商业农业中的关键技术，因为它能够将外源基因导入作物植物或对内源基因进行改造，从而获得转基因品系。合适的转化方案有助于加速遗传学和分子生物学研究，促进对基因调控机制的深入理解8在细菌中，遗传转化是自然发生的；然而，在植物中，该过程需通过分子生物学技术进行人工实现。9,10. 根癌农杆菌 是一种土传的革兰氏阴性细菌，通过IV型分泌系统将其Ti质粒上的T-DNA区域转入植物细胞，从而引起植物根癌病11,12在植物中， A. tumefaciens介导的转化被认为是一种广泛应用的基因修饰方法，因为它能够实现T-DNA在宿主基因组中的稳定整合，并且拷贝数较低。13转基因水稻最初是通过 农杆菌-介导的基因转化在20世纪90年代中期的粳稻品种中14通过该方案，在4个月内获得了多个转基因株系，转化效率为10%–30%。研究结果表明，成功转化的关键步骤有两个：一是从成熟种子诱导胚性愈伤组织，二是在共培养期间向细菌培养物中添加乙酰丁香酮（一种酚类化合物），这有助于提高植物的转化效率。14,15该方案已被广泛使用，仅做了细微修改 japonica16,17,18,19 以及其他品种，例如 indica20,21,22,23 和热带 japonica24,25事实上，超过80%描述水稻转化的文章采用了 农杆菌介导的基因转化作为一种工具13迄今为止，已有多种遗传转化方案被开发出来，以水稻种子作为起始材料诱导愈伤组织16,17,18,19然而，关于以幼嫩花序作为外植体进行愈伤组织诱导的研究还非常有限。总体而言，建立一种快速、可重复且高效的基因转化与再生体系，对于功能基因组学研究及作物改良具有重要意义。

近年来，CRISPR-Cas9 技术的进步为理解基因功能以及实现农艺学上重要的植物育种改良提供了一种精确的基因组编辑机制26,27。CRISPR 技术在调控雄性生殖发育和杂交制种方面也展现出巨大潜力。在本研究中，我们采用基于 CRISPR-Cas9 技术的基因敲除系统，并结合以幼嫩穗状花序作为外植体的高效水稻基因转化方法，成功创制了稳定的雄性不育系，用于生殖发育研究。

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方案

1. sgRNA-CAS9 植物表达载体构建与 农杆菌介导的转化

  1. 根据已发表的文献28，靶向水稻中的雄性不育基因 OsABCG15。
  2. 设计针对 OsABCG15 第二个外显子中位于 106–125 bp 区域的靶位点的 sgRNA（图 1）。
  3. 使用 T4 多核苷酸激酶合成 sgRNA 寡核苷酸（sgR-OsABCG15-F：5’TGGCAAGCACATCCTCAAGGGGAT3’ 和 5’sgR-OsABCG15-R：AAACATCCCCTTGAGGATGTGCTT’）。
  4. 使用内切酶 BbsI 消化 psgR-Cas9 骨架载体29。
  5. 按照制造商的说明，使用 T4 连接酶将合成的 sgRNA 寡核苷酸与线性化的 psgR-Cas9 骨架进行连接。
  6. 使用 HindIII/EcoRI 从步骤 1.5 中消化出 sgRNA 表达盒，并将其亚克隆至 pCAMBIA1300 双元载体的 HindIII/EcoRI 位点，用于稳定转化29。
  7. 通过酶切和测序验证构建的质粒。随后，将该双元载体转化至农杆菌 Agrobacterium tumefaciens 菌株 EHA105 中，并在 28 °C 下于 Kan/Rif 筛选平板上培养 2–3 天。

2. 水稻遗传转化与植物组织培养

  1. 愈伤组织诱导与再生
    注意：使用新鲜的幼嫩水稻花序作为诱导愈伤组织的起始材料图2).
    1. 从稻田或温室中采集处于减数分裂期的幼嫩花序，该时期可根据小花长度为1.6–4.8 mm来确定（图2A)29确保水稻花序被叶鞘包裹。用70%酒精棉签擦拭每个花序，待其干燥后再进行切割。
    2. 将花序移至洁净的无菌操作台，用灭菌的剪刀将其剪成小片段（越小越好），然后将片段转移至含有NBD2培养基的培养皿中图2B, 表1).
    3. 在26℃避光培养 °C 培养约 10–14 天以诱导愈伤组织（图3A).
      注意：使用新形成的愈伤组织 农杆菌 浸润（步骤2.2.7）可直接进行，或在新鲜NBD2培养基中再次预处理一次以获得更多愈伤组织。每隔8–10天将愈伤组织转移至新的NBD2培养基中。
  2. 转化与共培养
    1. 使用 A. tumefaciens 含有步骤1.6中用于转化的双元质粒的细菌。储存 A. tumefaciens YEB 培养基中的菌株（表1) 与50%甘油于-80℃保存 °C 以供后续使用。
    2. 划线 A. tumefaciens 从 -80 °C 甘油菌种接种至含有选择性抗生素的 YEB 琼脂培养基表1）并在25–28℃下培养 ˚在48–72小时内于C条件下培养，以使菌落显现。
    3. 从含有选择性抗生素的YEB平板上挑取单菌落，接种于5 mL含有相同选择性抗生素的液体YEB培养基中（表1)，置于50 mL锥形无菌试管中，在250 rpm的摇床中振荡 x g，于25–28 °C，直至细菌生长至 OD600 0.5
    4. 将1 mL细菌悬液加入100 mL YEB培养基中（表1）置于250 mL锥形瓶中，加入相同的筛选抗生素，在摇床中以250 rpm振荡培养 x g，于28 °4小时，4°C
    5. 在 4,000 离心 x g 室温下离心10分钟以收集菌体，弃去上清液。
    6. 用 AAM-AS 培养基重悬菌体沉淀（表1）并将悬浮液稀释至 OD600 = 0.4.
      注意：细菌悬浮液的OD值至关重要，以实现高效的转化，并有助于消除愈伤组织上过量的细菌生长。
    7. 从步骤2.1.3中选取约150个生长良好、呈浅黄色且质地脆弱的胚性愈伤组织，收集至一个150 mL无菌三角瓶中。将步骤2.2.6中制备的50–75 mL农杆菌悬浮液加入该无菌瓶中，随后添加10–25 mL新鲜的AAM-AS培养基，浸没愈伤组织，振荡孵育10–20分钟，期间偶尔摇动。
    8. 小心地将烧瓶中的菌液倒出，用无菌滤纸#1或纸巾吸去愈伤组织表面多余的菌液，然后将其转移至含有NBD-AS培养基的培养皿中表1）上覆盖无菌滤纸#1，在25–28℃下培养 °在黑暗中于 C 培养 3 天，并检查细菌是否过度生长。
  3. 抗性愈伤组织筛选
    1. 共培养3天后，将愈伤组织转移至含有无菌滤纸的无菌培养皿中。
    2. 在洁净工作台上将愈伤组织风干2小时。确保愈伤组织未粘附在滤纸上。
    3. 使用无菌镊子将愈伤组织均匀转移至初筛培养基 NBD2（含 40 mg/L 潮霉素和 250 mg/L 替门汀）中表1）。将愈伤组织在25–28℃下培养2周 °黑暗中孵育。
    4. 2 周后，将愈伤组织均匀转移至含有新鲜选择培养基 NBD2（含 40 mg/L 潮霉素和 250 mg/L 替门汀）的新培养皿中表1）。将愈伤组织在25–28℃下继续培养2周 °在黑暗中
  4. 愈伤组织分化
    1. 将愈伤组织转移到新鲜的MS培养基（含25 mg/L潮霉素和150 mg/L替门汀）上表1）。在25–28℃光照条件下培养 °约 2 周
    2. 重复步骤 2.4.1 一次。
    3. 将茎芽转移至新的MS培养基（含10 mg/L潮霉素）以增殖更多茎芽。
  5. 根诱导
    1. 将新萌发的芽转移至 ½ MS培养基（表1）。在25℃光照条件下培养 °C - 28 °C. 转化植株在2周内产生根。
    2. 1 周后，将植株转移至洁净的花盆中，并覆盖植株以防止脱水。

3. 基因型鉴定

  1. 采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法，从新生成的植株中采集幼嫩叶片以提取总DNA31。
  2. 以基因组DNA为模板，选用位于潮霉素抗性基因区域的引物（Hygromycin-F: 5’ GATGTTGGCGACCTCGTATT 3’ 和 Hygromycin-R: 5’ CGAAGAATCTCGTGCTTTCA 3’）进行聚合酶链式反应（PCR），以验证外源基因的整合情况及转化频率（图4）。PCR反应条件如下：94 °C 预变性5 min；36个循环（94 °C 变性30 s，56 °C 退火30 s，72 °C 延伸1 min）；最后72 °C 延伸7 min。成功扩增的PCR产物片段大小为604 bp。
  3. 使用特异性引物（OsABCG15-ID-F: 5’ GTCTCATTGCTCAACAGTTTCT 3’ 和 OsABCG15-ID-R: 5’ TTGGTGTTTAAAACATTGCTAT 3’）对CRISPR靶位点周围的基因组区域进行另一轮PCR扩增，以鉴定转化植株的基因型。PCR反应条件与步骤3.2相同。
  4. 将步骤3.3获得的PCR产物直接用于Sanger测序，以鉴定突变类型。

4. 观察突变体的基本表型

  1. 配制 I2-KI 溶液：将 2 g KI（碘化钾）溶解于 10 mL 蒸馏水中，然后加入 0.2 g I2（重升华碘）。混合后，用蒸馏水定容至 100 mL。
  2. 配制 FAA 溶液（63% 无水乙醇、5% 冰醋酸、5% 甲醛和 27% 水），使用前混合均匀。
  3. 配制 0.5% 甲苯胺蓝染色液：将 0.5 g 甲苯胺蓝溶解于 100 mL 蒸馏水中。
  4. 进行营养生长表型观察，使用数码相机拍摄整株植物图像。
  5. 进行生殖表型观察，去除小花的外稃和内稃，然后在体视显微镜下拍摄花药整体照片。
  6. 通过碘染色法观察花粉活力。
    1. 在水稻开花前采集成熟的颖花，去除外稃和内稃以释放花药。
    2. 取 6 个花药置于载玻片上，加入 1 滴蒸馏水，用镊子充分碾压花药以释放花粉粒，然后加入 2–3 滴 I2-KI 溶液，盖上盖玻片。
    3. 在低倍显微镜下观察。被染成黑色的花粉粒表明活力较强，无色或呈黄褐色的花粉粒则为发育不良或退化。
  7. 进行水稻花药半薄切片分析。
    1. 将处于不同发育阶段的水稻花固定于 FAA 溶液中，在 4 °C 下抽真空（通常为 15 分钟），使固定液充分渗透组织，直至材料沉入收集瓶底部。
    2. 次日更换新鲜 FAA 溶液。待材料完全下沉后，替换为 70% 乙醇，并于 4 °C 下长期保存。
    3. 依次使用不同浓度梯度的乙醇进行脱水处理（70%、80%、95% 各 30 分钟，100% 乙醇 2 小时，含少量番红染料的 100% 乙醇 2 小时）。
      注：在第二次 100% 乙醇中加入少量番红染料，以便对花药染色，利于后续切片操作。
    4. 按照制造商说明进行包埋（见材料表）。然后在 60 °C 烤箱中烘烤 48 小时后再进行切片。
    5. 使用切片机将样品切成 2 μm 厚的切片。在载玻片上滴加一滴水，用镊子夹取含有花药组织块的切片，将其转移至载玻片的水滴表面。
    6. 将载玻片置于 50 °C 水浴台上，使切片充分展开并牢固附着于载玻片上。
    7. 用 0.5% 甲苯胺蓝溶液染色 30 分钟，随后用水冲洗并在通风橱中干燥。用中性树胶封片，轻轻盖上盖玻片后置于通风橱中干燥。
    8. 在显微镜下观察并拍照记录样品。

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结果

此处展示的是利用基因编辑技术创建雄性不育系，以用于后续研究 农杆菌介导的水稻遗传转化。以创建水稻雄性不育系 osabcg15CRISPR-Cas9介导的诱变用于双元载体构建。sgRNA由OsU3启动子驱动，hSpCas9表达盒由双35S启动子驱动，中间载体被组装至单一双元载体中 pCAMBIA1300 专为 农杆菌介导的水稻稳定转化。文中提供了用于CRISPR/Cas9介导水稻突变的载体构建图示。 图1A.

图2 和 图3 代表水稻转基因生产的完整流程。选择幼嫩的花序作为外植体（图2）并在接种到NBD2培养基后14天内诱导出松脆的胚性愈伤组织（FEC）图3A）。将胚性愈伤组织直接用于 农杆菌介导的转...

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讨论

人工基因雄性不育突变体传统上通过随机的物理、化学或生物诱变方法产生。尽管这些技术十分有效，但其随机性无法充分利用现代基因组学知识，而这些知识具有在分子育种中实现定制化改良的潜力32。CRISPR-Cas9 系统因其操作简便且成本低廉，已被广泛应用于植物中以实现DNA的操控与编辑29,33；与传统诱变方法相比，该系统有望节省大量时间。

在此，我们开发了一种简便的方法 农杆菌以幼穗作为外植体的介导转化体系用于愈伤组织诱导。在转基因流程中，某些步骤可以省略以节省时间。与使用种子作为外植体相比，采用幼穗作为起始材料能够显著缩短愈伤组织诱导的整体周期。此外，由幼穗获得的愈伤组织具有很强的细胞分化和再生能力。在此过程中可避免水稻愈伤组织的继代培养，从而进一步节约时间，并降低细菌和真菌污染的风险。此外，本实验使用替米汀（timentin）作为抗生素，替代羧苄青霉素（carbenicillin），其对细菌的抑制效果更...

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致谢

作者感谢陈晓飞提供水稻幼穗并协助配制水稻组织培养基。本工作受到国家自然科学基金（31900611）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1-萘乙酸Sigma-AldrichN0640
2,4-二氯苯氧乙酸Sigma-AldrichD7299
6-苄氨基嘌呤（6-BA）Sigma-AldrichB3408
乙酰丁香酮Sigma-AldrichD134406
琼脂国药集团化学试剂有限公司10000561
硫酸铵国药集团化学试剂有限公司10002918
盐酸硫胺素Sigma-AldrichT4625
无水乙醇国药集团化学试剂有限公司10009218
细菌性蛋白胨生工生物工程（上海）股份有限公司A100636
牛肉浸膏生工生物工程（上海）股份有限公司A600114
硼酸国药集团化学试剂有限公司10004808
二水氯化钙国药集团化学试剂有限公司20011160
酪蛋白酸水解物北京西美杰科技有限公司C184
六水合氯化钴(II)国药集团化学试剂有限公司10007216
五水合硫酸铜(II)国药集团化学试剂有限公司10008218
无水D-(+)-葡萄糖国药集团化学试剂有限公司63005518
D-山梨醇国药集团化学试剂有限公司63011037
EDTA二钠盐二水合物Sigma-AldrichE5134
EOS数码单反及微单相机佳能EOS 700D
甲醛国药集团化学试剂有限公司10010018
全自动旋转切片机徕卡生物系统公司Leica RM 2265
冰乙酸国药集团化学试剂有限公司10000208
甘氨酸国药集团化学试剂有限公司62011516
潮霉素北京西美杰科技有限公司H370
肌醇国药集团化学试剂有限公司63007738
碘国药集团化学试剂有限公司10011517
七水合硫酸亚铁国药集团化学试剂有限公司10012116
卡那霉素北京西美杰科技有限公司K378
激动素Sigma-AldrichK0753
L-精氨酸国药集团化学试剂有限公司62004034
L-天冬氨酸国药集团化学试剂有限公司62004736
L-谷氨酰胺北京西美杰科技有限公司G229
L-脯氨酸北京西美杰科技有限公司P698
七水合硫酸镁国药集团化学试剂有限公司10013018
一水合硫酸锰国药集团化学试剂有限公司10013418
显微镜尼康Eclipse 80i
MS培养基PhytotechM519
烟酸Sigma-AldrichN0765
植物凝胶Sigma-AldrichP8169
氯化钾国药集团化学试剂有限公司10016308
磷酸二氢钾国药集团化学试剂有限公司10017608
碘化钾国药集团化学试剂有限公司10017160
硝酸钾国药集团化学试剂有限公司1001721933
盐酸吡哆醇（B6）Sigma-Aldrich47862
利福平北京西美杰科技有限公司R501
氢氧化钠国药集团化学试剂有限公司10019718
二水合钼酸钠国药集团化学试剂有限公司10019816
体视显微镜徕卡显微系统公司Leica M205 A
蔗糖国药集团化学试剂有限公司10021418
Technovit包埋试剂盒7100Heraeus Teknovi, 德国14653
特美汀北京西美杰科技有限公司T869
甲苯胺蓝OSigma-AldrichT3260
石蜡切片水浴锅徕卡生物系统公司Leica HI1210
酵母提取物生工生物工程（上海）股份有限公司A515245
七水合硫酸锌国药集团化学试剂有限公司10024018

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