农杆菌介导的遗传转化、转基因植株创制及其在水稻雄性生殖发育研究中的应用

摘要

本研究描述了利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术敲除内源性基因的方法 OsABCG15 随后进行改良的 农杆菌-通过介导转化方案培育水稻稳定雄性不育系

摘要

雄性不育是杂交种子生产中重要的农艺性状，通常表现为雄性生殖器官或配子的功能缺陷。近年来，CRISPR-Cas9基因组编辑技术的进步使得在特定位点对内源候选基因进行高效编辑和快速敲除突变成为可能。此外， 农杆菌介导的水稻遗传转化也是基因修饰的一种关键方法，已被众多公共和私人实验室广泛采用。在本研究中，我们应用了CRISPR-Cas9基因组编辑工具，通过靶向基因组编辑成功获得了三个雄性不育突变系 OsABCG15 在一个 japonica 品种。我们采用了一种改良的 农杆菌介导的水稻转化方法，可为水稻杂交种子生产提供优良的遗传雄性不育手段。在2–3个月内即可获得转基因植株，并通过PCR扩增和Sanger测序进行基因分型以筛选纯合转化子。对雄性不育纯合系的基本表型特征分析，通过显微镜观察水稻雄性生殖器官，并利用碘化钾碘溶液（I₂-KI染色发育中花药的半薄横切片。

引言

水稻是最重要的粮食作物，尤其是在发展中国家，全球超过一半人口以水稻为主食。总体而言，稻米的需求量正在不断增长，预计到2030年将增加50%，到2050年将翻倍^1,2。未来水稻产量的提升需要充分利用多种分子和遗传资源，这些资源使水稻成为单子叶植物研究的理想模式作物。这些资源包括高效的遗传转化系统、先进的分子遗传图谱，以及多年来积累并公开可获取的表达序列标签数据库^3,4。提高作物产量的一种策略是杂交种子生产⁵，其核心在于对雄性育性的调控能力。深入了解谷类作物雄性育性的分子调控机制，有助于将关键科学知识转化为实用技术，从而改进杂交种子生产并提高作物产量^6,7。

遗传转化是基础研究和商业农业中的关键技术，因为它能够将外源基因导入作物植物或对内源基因进行改造，从而获得转基因品系。合适的转化方案有助于加速遗传学和分子生物学研究，促进对基因调控机制的深入理解⁸在细菌中，遗传转化是自然发生的；然而，在植物中，该过程需通过分子生物学技术进行人工实现。<....

方案

1. sgRNA-CAS9 植物表达载体构建与 农杆菌介导的转化

1. 根据已发表的文献²⁸，靶向水稻中的雄性不育基因 OsABCG15。
2. 设计针对 OsABCG15 第二个外显子中位于 106–125 bp 区域的靶位点的 sgRNA（图 1）。
3. 使用 T4 多核苷酸激酶合成 sgRNA 寡核苷酸（sgR-OsABCG15-F：5’TGGCAAGCACATCCTCAAGGGGAT3’ 和 5’sgR-OsABCG15-R：AAACATCCCCTTGAGGATGTGCTT’）。
4. 使用内切酶 BbsI 消化 psgR-Cas9 骨架载体²⁹。
5. 按照制造商的说明，使用 T4 连接酶将合成的 sgRNA 寡核苷酸与线性化的 psgR-Cas9 骨架进行连接。
6. 使用 HindIII/EcoRI 从步骤 1.5 中消化出 sgRNA 表达盒，并将其亚克隆至 pCAMBIA1300 双元载体的 HindIII/EcoRI 位点，用于稳定转化²⁹。
7. 通过酶切和测序验证构建的质粒。随后，将该双元载体转化至农杆菌 Agrobacterium tumef....

结果

此处展示的是利用基因编辑技术创建雄性不育系，以用于后续研究 农杆菌介导的水稻遗传转化。以创建水稻雄性不育系 osabcg15CRISPR-Cas9介导的诱变用于双元载体构建。sgRNA由OsU3启动子驱动，hSpCas9表达盒由双35S启动子驱动，中间载体被组装至单一双元载体中 pCAMBIA1300 专为 农杆菌介导的水稻稳定转化。文中提供了用于CRISPR/Cas9介导水稻突变的载体构建图示。 图1A.

图2 和 图3 代表水稻转基因生产的完整流程。选择幼嫩的花序作为外植体（图2）并在接种到NBD2培养基后14天内诱导出松脆的胚性愈伤组织（FEC）图3A）。将胚性愈伤组织直接用于 农杆菌介导的转.......

讨论

人工基因雄性不育突变体传统上通过随机的物理、化学或生物诱变方法产生。尽管这些技术十分有效，但其随机性无法充分利用现代基因组学知识，而这些知识具有在分子育种中实现定制化改良的潜力³²。CRISPR-Cas9 系统因其操作简便且成本低廉，已被广泛应用于植物中以实现DNA的操控与编辑^29,33；与传统诱变方法相比，该系统有望节省大量时间。

在此，我们开发了一种简便的方法 农杆菌以幼穗作为外植体的介导转化体系用于愈伤组织诱导。在转基因流程中，某些步骤可以省略以节省时间。与使用种子作为外植体相比，采用幼穗作为起始材料能够显著缩短愈伤组织诱导的整体周期。此外，由幼穗获得的愈伤组织具有很强的细胞分化和再生能力。在此过程中可避免水稻愈伤组织的继代培养，从而进一步节约时间，并降低细菌和真菌污染的风险。此外，本实验使用替米汀（timentin）作为抗生素，替代羧苄青霉素（carbenicillin），其对细菌的抑制效果更.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1-萘乙酸	Sigma-Aldrich	N0640
2,4-二氯苯氧乙酸	Sigma-Aldrich	D7299
6-苄氨基嘌呤（6-BA）	Sigma-Aldrich	B3408
乙酰丁香酮	Sigma-Aldrich	D134406
琼脂	国药集团化学试剂有限公司	10000561
硫酸铵	国药集团化学试剂有限公司	10002918
盐酸硫胺素	Sigma-Aldrich	T4625
无水乙醇	国药集团化学试剂有限公司	10009218
细菌性蛋白胨	生工生物工程（上海）股份有限公司	A100636
牛肉浸膏	生工生物工程（上海）股份有限公司	A600114
硼酸	国药集团化学试剂有限公司	10004808
二水氯化钙	国药集团化学试剂有限公司	20011160
酪蛋白酸水解物	北京西美杰科技有限公司	C184
六水合氯化钴(II)	国药集团化学试剂有限公司	10007216
五水合硫酸铜(II)	国药集团化学试剂有限公司	10008218
无水D-(+)-葡萄糖	国药集团化学试剂有限公司	63005518
D-山梨醇	国药集团化学试剂有限公司	63011037
EDTA二钠盐二水合物	Sigma-Aldrich	E5134
EOS数码单反及微单相机	佳能	EOS 700D
甲醛	国药集团化学试剂有限公司	10010018
全自动旋转切片机	徕卡生物系统公司	Leica RM 2265
冰乙酸	国药集团化学试剂有限公司	10000208
甘氨酸	国药集团化学试剂有限公司	62011516
潮霉素	北京西美杰科技有限公司	H370
肌醇	国药集团化学试剂有限公司	63007738
碘	国药集团化学试剂有限公司	10011517
七水合硫酸亚铁	国药集团化学试剂有限公司	10012116
卡那霉素	北京西美杰科技有限公司	K378
激动素	Sigma-Aldrich	K0753
L-精氨酸	国药集团化学试剂有限公司	62004034
L-天冬氨酸	国药集团化学试剂有限公司	62004736
L-谷氨酰胺	北京西美杰科技有限公司	G229
L-脯氨酸	北京西美杰科技有限公司	P698
七水合硫酸镁	国药集团化学试剂有限公司	10013018
一水合硫酸锰	国药集团化学试剂有限公司	10013418
显微镜	尼康	Eclipse 80i
MS培养基	Phytotech	M519
烟酸	Sigma-Aldrich	N0765
植物凝胶	Sigma-Aldrich	P8169
氯化钾	国药集团化学试剂有限公司	10016308
磷酸二氢钾	国药集团化学试剂有限公司	10017608
碘化钾	国药集团化学试剂有限公司	10017160
硝酸钾	国药集团化学试剂有限公司	1001721933
盐酸吡哆醇（B6）	Sigma-Aldrich	47862
利福平	北京西美杰科技有限公司	R501
氢氧化钠	国药集团化学试剂有限公司	10019718
二水合钼酸钠	国药集团化学试剂有限公司	10019816
体视显微镜	徕卡显微系统公司	Leica M205 A
蔗糖	国药集团化学试剂有限公司	10021418
Technovit包埋试剂盒7100	Heraeus Teknovi, 德国	14653
特美汀	北京西美杰科技有限公司	T869
甲苯胺蓝O	Sigma-Aldrich	T3260
石蜡切片水浴锅	徕卡生物系统公司	Leica HI1210
酵母提取物	生工生物工程（上海）股份有限公司	A515245
七水合硫酸锌	国药集团化学试剂有限公司	10024018