使用紫光激发的细胞通透性DNA结合染料分离小鼠生精细胞

摘要

本文介绍一种简单高效的方法，用于从成年小鼠睾丸中分离存活的减数分裂期及减数分裂后生殖细胞。通过使用低细胞毒性、紫光激发的DNA结合染料结合荧光激活细胞分选技术，可获得高度富集的生精细胞群体，适用于多种下游应用。

摘要

分离减数分裂期的精母细胞对于研究减数分裂和精子发生过程中的分子机制至关重要。尽管已有采用Hoechst 33342染色结合荧光激活细胞分选技术的成熟细胞分离方案，但该方法需要配备紫外激光器的细胞分选仪。本文介绍一种使用DyeCycle Violet（DCV）染料的细胞分离方案，DCV是一种细胞毒性较低的DNA结合染料，其结构与Hoechst 33342相似。DCV可被紫外光和紫光激光激发，从而提高了仪器选择的灵活性，包括可使用未配备紫外激光器的细胞分选仪。利用本方案，可分离出减数第一次分裂前期的三种活细胞亚群，包括细线期/偶线期、粗线期和双线期精母细胞，以及减数分裂后的圆形精子细胞。我们还描述了从小鼠睾丸制备单细胞悬液的方案。总体而言，该流程耗时较短（根据所需细胞数量而定，约需4–5小时），有利于开展多种后续实验应用。

引言

精子发生是一个复杂的过程，在此过程中，少量精原干细胞在整个成年期持续产生大量精子^1,2。在精子发生过程中，当生精细胞经历减数分裂形成单倍体的精子细胞时，会发生动态的染色质重塑^3,4,5。减数分裂期精母细胞的分离对于分子水平的研究至关重要，目前已建立多种分离减数分裂期精母细胞的方法，包括基于沉降的分离法^6,7和荧光激活细胞分选（FACS）^{8,9,10,11,12,13,14,15....}

方案

本方案遵循辛辛那提儿童医院医疗中心机构动物照护与使用委员会的指南（方案编号：IACUC2018-0040）。

1. 睾丸细胞悬液制备所需的仪器与试剂准备

1. 用1×Hanks平衡盐溶液（HBSS）配制每种酶的储备液，并于-20 °C保存。（表1）。
   注意：可在实验前任意时间配制。
2. 实验前一天：用胎牛血清（FBS）在4 °C条件下对收集管（1.5 mL离心管）进行过夜包被。
3. 实验当天：将水浴锅预热至37 °C。
4. 将杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）预热至37 °C，并在使用前于15 mL离心管中为每个样品现配2 mL 1×解离缓冲液（表1）。
   注意：每两个睾丸组织使用2 mL解离缓冲液。解离缓冲液配方请参见表1。

2. 动物解剖及睾丸细胞悬液的制备

1. 将一只8周龄的雄性小鼠置于二氧化碳箱中至少10分钟，以处死。
2. 取出双侧睾丸，并置于含有2 mL冰浴磷酸盐缓冲液（PBS）的60 mm培养皿中。
3. 剥离睾丸的白膜，用镊子轻轻分离，使曲细精管略微散开。
4. 将曲细精管转移至一个新的100 mm培养皿中的冰浴PBS液滴中，用镊子轻轻解离缠....

结果

该分选方案的代表性结果如图3所示。两个睾丸（一只小鼠）的总分选时间通常约为3小时，具体时长取决于细胞悬液浓度和分选速度。分选后，通过SYCP3和γH2AX免疫荧光染色确认精母细胞的纯度（图3A）。分选得到的L/Z期、P期和D期精母细胞组分的代表性纯度分别约为80.4%、90.6%和87.6%（图3C）。我们依据此前发表的标准¹⁹确定了各亚阶段。简而言之，在细线期和偶线期，同源染色体之间的联会尚未完成，表现为SYCP3染色呈细丝状结构；由于程序性DNA双链断裂的存在，γH2AX在整个核染色质中呈现广泛的信号分布。在粗线期，同源染色体已完全联会，γH2AX特异性地富集于性染色体区域。在双线期，同源染色体逐步发生去联会。通过DCV对细胞核染色确认RS的纯度（图3B）。RS可通过DNA染色精确识别：即一个DAPI强荧光的染色中心被常染色质包围；也可结合特异性标志.......

讨论

本文介绍一种从单只成年雄性小鼠中分离精母细胞和精子细胞亚群的实用且简便的实验方案。为确保本方案的可重复性，需特别注意一些关键步骤。在酶消化前，洗涤步骤旨在去除间质细胞；消化后，该步骤有助于去除精子和碎片。洗涤/离心3次至关重要。在我们的解离缓冲液配方中，多种不同酶的组合可有效将睾丸组织解离为单细胞悬液，同时避免细胞过度损伤。轻柔吹打以避免产生气泡，也有助于保护细胞完整性。解离后请在显微镜下检查细胞悬液，确保达到单细胞水平。解离不完全或因过度消化导致的碎片污染会影响分选细胞的纯度；如图S2所示，直立的细胞群中含有碎片及精子细胞四聚体。DCV染色需避光孵育，之后无需洗涤。

为解决精母细胞亚群门控及反向门控过程中可能出现的困难，作为优化的可选方案，我们建议使用同步化的野生型小鼠，以帮助定位特定阶段的精母细胞^22,23,24。还需注意的是，某些具有生精障碍表型的基因敲除小.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 ml 离心管	Watson	131-7155C
100 mm 培养皿	Corning, Falcon	351029
15 mL 离心管	Watson	1332-015S
5 ml 聚苯乙烯管，带细胞滤网 snap cap（35 µm 尼龙滤膜）	Corning, Falcon	352235
50 mL 离心管	Watson	1342-050S
60 mm 培养皿	Corning, Falcon	351007
70 µm 尼龙滤膜	Corning, Falcon	352350
细胞分选仪	Sony	SH800S
离心机
胶原酶，重组型，无动物源成分	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	036-23141
胶原酶 I 型	Worthington	LS004196
盖玻片	Fisher	12-544-G
Cytospin 3 细胞离心涂片机	Shandon
DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐）	Fisher	D1306	工作浓度：0.1 μg/mL
脱氧核糖核酸酶 I（DNase I）	Sigma	D5025-150KU
驴血清	Sigma	S30-M
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液（DPBS）	Gibco	14190144
杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）	Gibco	11885076
胎牛血清（FBS）	Gibco	16000044
组蛋白 H1t 抗体	由 Mary Ann Handel 惠赠		稀释比例：1/2000
Hank’s 平衡盐溶液（HBSS）	Gibco	14175095
牛睾丸透明质酸酶	Sigma	H3506-1G
磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma	P5493-4L
移液器
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂	Fisher	P36930
rH2AX 抗体	Millipore	05-635	工作浓度：2 μg/mL
精子受精蛋白 56（Sp56）抗体	QED Bioscience	55101	工作浓度：0.5 μg/mL
灭菌镊子和剪刀
Superfrost /Plus 显微载玻片	Fisher	12-550-15
SYCP3 抗体	Abcam	ab205846	工作浓度：5 μg/mL
TWEEN 20（聚山梨酯 20）	Sigma	P9416
Vybrant DyeCycle Violet 染色剂（DCV）	Invitrogen	V35003
水浴锅