使用紫光激发的细胞通透性DNA结合染料分离小鼠生精细胞

摘要

本文介绍一种简单高效的方法，用于从成年小鼠睾丸中分离存活的减数分裂期及减数分裂后生殖细胞。通过使用低细胞毒性、紫光激发的DNA结合染料结合荧光激活细胞分选技术，可获得高度富集的生精细胞群体，适用于多种下游应用。

摘要

分离减数分裂期的精母细胞对于研究减数分裂和精子发生过程中的分子机制至关重要。尽管已有采用Hoechst 33342染色结合荧光激活细胞分选技术的成熟细胞分离方案，但该方法需要配备紫外激光器的细胞分选仪。本文介绍一种使用DyeCycle Violet（DCV）染料的细胞分离方案，DCV是一种细胞毒性较低的DNA结合染料，其结构与Hoechst 33342相似。DCV可被紫外光和紫光激光激发，从而提高了仪器选择的灵活性，包括可使用未配备紫外激光器的细胞分选仪。利用本方案，可分离出减数第一次分裂前期的三种活细胞亚群，包括细线期/偶线期、粗线期和双线期精母细胞，以及减数分裂后的圆形精子细胞。我们还描述了从小鼠睾丸制备单细胞悬液的方案。总体而言，该流程耗时较短（根据所需细胞数量而定，约需4–5小时），有利于开展多种后续实验应用。

引言

精子发生是一个复杂的过程，在此过程中，少量精原干细胞在整个成年期持续产生大量精子^1,2。在精子发生过程中，当生精细胞经历减数分裂形成单倍体的精子细胞时，会发生动态的染色质重塑^3,4,5。减数分裂期精母细胞的分离对于分子水平的研究至关重要，目前已建立多种分离减数分裂期精母细胞的方法，包括基于沉降的分离法^6,7和荧光激活细胞分选（FACS）^{8,9,10,11,12,13,14,15,16,17}。然而，这些方法存在技术上的局限性。基于沉降的分离法虽然可以获得大量细胞^5,6,7，但操作过程劳动强度大。现有的基于FACS的方法利用Hoechst 33342（Ho342）染料根据DNA含量和光散射特性来分离减数分裂期精母细胞，且需要配备紫外（UV）激光器的FACS细胞分选仪^8,9,10,11。其他基于FACS的替代方法则需要表达荧光蛋白的转基因小鼠品系¹²、同步化处理精子发生过程，或采用细胞固定和抗体标记，而后者无法用于活细胞的分离¹³。尽管还有一种替代方法使用可穿透细胞膜的DNA结合染料DyeCycle Green染色^14,15,16,17，但该方法推荐用于从幼年睾丸中分离生精细胞。因此，迫切需要建立一种简单且可靠的活体减数分裂期精母细胞分离方法，该方法应适用于任意年龄的任何小鼠品系，并可在任何FACS细胞分选仪上操作。

本文介绍了一种长期寻求的基于DyeCycle Violet（DCV）染料的细胞分离方案。DCV是一种细胞毒性低、可穿透细胞膜的DNA结合染料，其结构与Ho342相似，但激发光谱向紫光范围偏移¹⁸。此外，与DCG相比，DCV具有更宽的发射光谱，因此可被紫外光和紫光激光共同激发，提高了设备使用的灵活性，使得无需配备紫外激光器的FACS细胞分选仪也可使用。本文所述的DCV方案采用DCV蓝色和DCV红色进行二维分离，模拟了Ho342方案的优势。利用这一优势，我们的DCV方案能够从成年睾丸中分离出高度富集的生殖细胞。我们提供了一套详细的门控策略，用于从一只小鼠（两个睾丸）的成年小鼠睾丸中分离活的生精细胞。同时，我们还描述了一种高效且快速的小鼠睾丸单细胞悬液制备方案，可用于上述细胞分离。整个操作耗时较短（单细胞悬液制备约1小时，染料染色30分钟，细胞分选2–3小时；总计约4–5小时，具体时间取决于所需细胞数量）；图1）。在完成细胞分离后，可进行多种下游应用，包括RNA-seq、ATAC-seq、ChIP-seq以及细胞培养等。

方案

本方案遵循辛辛那提儿童医院医疗中心机构动物照护与使用委员会的指南（方案编号：IACUC2018-0040）。

1. 睾丸细胞悬液制备所需的仪器与试剂准备

1. 用1×Hanks平衡盐溶液（HBSS）配制每种酶的储备液，并于-20 °C保存。（表1）。
   注意：可在实验前任意时间配制。
2. 实验前一天：用胎牛血清（FBS）在4 °C条件下对收集管（1.5 mL离心管）进行过夜包被。
3. 实验当天：将水浴锅预热至37 °C。
4. 将杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）预热至37 °C，并在使用前于15 mL离心管中为每个样品现配2 mL 1×解离缓冲液（表1）。
   注意：每两个睾丸组织使用2 mL解离缓冲液。解离缓冲液配方请参见表1。

2. 动物解剖及睾丸细胞悬液的制备

1. 将一只8周龄的雄性小鼠置于二氧化碳箱中至少10分钟，以处死。
2. 取出双侧睾丸，并置于含有2 mL冰浴磷酸盐缓冲液（PBS）的60 mm培养皿中。
3. 剥离睾丸的白膜，用镊子轻轻分离，使曲细精管略微散开。
4. 将曲细精管转移至一个新的100 mm培养皿中的冰浴PBS液滴中，用镊子轻轻解离缠结的曲细精管。重复此洗涤步骤3次，以尽可能去除间质细胞。
5. 将解离后的曲细精管放入含有2 mL消化缓冲液的15 mL离心管中，于37 °C孵育20分钟。
6. 使用1000 µL移液器轻轻吹打管内组织20次。
7. 继续孵育6分钟，再次轻轻吹打20次。
8. 再孵育3分钟，重复轻轻吹打10次，直至无可见组织块残留。
9. 向细胞悬液中加入10 mL FACS缓冲液，室温下以300 x g离心5分钟，弃去上清液。
10. 重复步骤2.9两次，以去除精子和尽可能多的碎片。

3. 细胞染色

1. 用 3 mL FACS 缓冲液（表 1）重悬细胞沉淀，并通过 70 µm 尼龙细胞滤网将细胞悬液过滤至 50 mL 离心管中。
   注意：预期细胞产量约为每两个睾丸 1 亿个细胞（来自 8 周龄 B6 野生型小鼠）。
2. 计数细胞数量，取 10% 的细胞分装至新离心管中作为未染色阴性对照，置于冰上保存。
3. 向剩余的细胞悬液中加入 6 µL DCV 染料（原始浓度为 5 mM），充分混匀。终浓度为 10 µM，细胞总量约为 1 亿个。
4. 在 37 °C 避光孵育 30 分钟，每 10 分钟轻轻振荡细胞悬液一次。
5. 孵育结束后，无需洗涤，直接向细胞悬液中加入 5 µL DNase I（储存浓度为 10 mg/mL），并通过 35 µm 尼龙滤网帽将细胞过滤至 5 mL FACS 管中。样品在分选前始终置于冰上保存。

4. 流式细胞术与实验门控

1. 准备流式细胞分选仪。确保流式细胞分选仪配备以下光学组件：激发光路：紫色（405 nm）激光；检测光路：450/50 带通滤光片（与4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）检测相同的滤光片组，用于DCV-blue检测）和665/30带通滤光片（与别藻蓝蛋白（APC）检测相同的滤光片组，用于DCV-red检测）。本实验以Sony SH800S细胞分选仪为例。
2. 创建新实验并设置以下用于显示待优化参数的工作图：点击“新密度”在“工作表工具”菜单栏，以线性刻度创建前向散射-面积（FSC-A）与侧向散射-面积（BSC-A）的密度图。点击“新直方图”在对数尺度上创建 DCV-蓝色直方图。
3. 短暂涡旋振荡未染色的阴性对照（来自步骤 3.2），并上样。
4. 点击“开始” 和 “记录”以开始处理未染色的样本。在样本运行的同时，点击“检测器 & 阈值设置通过上下调整光电倍增管（PMT）电压，优化前向散射光（FSC）和侧向散射光（BSC）电压，使未染色细胞位于FSC/BSC图的坐标尺度范围内。
5. 调节“PMT 电压”上下FL1：DAPI” 在样品运行时，通过DCV-blue直方图对数图的第一数量级来确定DCV阴性群体的位置（图2A）。完成 PMT 电压调节后，点击“停止”以卸载未染色的样品。
6. 短暂涡旋振荡样品（来自步骤 3.5），然后上样。
7. 点击“下一个试管”为DCV染色样本创建一个新的工作表；然后单击“开始” 和 “记录”以获取经DCV染色的样本，记录 ≥ 1 × 10⁶ 事件。添加以下工作图：单击“新密度”在“工作表工具”菜单栏，以线性刻度创建FSC-H（高度）对FSC-W（宽度）的密度图；点击“新密度”以在线性刻度上生成DCV-blue与DCV-red的密度图。在记录≥ 1 x 10⁶ 事件，点击“停止”并卸下样品。
8. 在FSC-A与BSC-A密度图上，点击“多边形”在“绘图工具” 菜单栏中绘制一个大型门控区域 “细胞”以包含大多数细胞并排除微小碎片（图2B）。应用门控“细胞”至FSC-H与FSC-W密度图。点击“矩形”以绘制“单细胞”门控以排除非单细胞（图2C).
9. 应用“单细胞门控至DCV-blue与DCV-red密度图，并调整比例以捕获扩展轮廓，如图所示 图 2D. 点击“多边形”在“绘图工具”菜单栏以绘制一个“DCV”门以排除未染色细胞和侧群（图 2D).
10. 应用“DCV”在对数线性刻度上对DCV-蓝色直方图进行门控。三个主要峰代表不同的DNA含量：1C、2C和4C（图2E).
11. 点击“新密度”以创建线性刻度下的DCV-blue与DCV-red密度图，并应用“DCV”栅极用于执行背栅调控 图2E 以定位1C和4C细胞群（图 2F）。点击“椭圆”在1C细胞群上绘制门控区域，该区域位于一个密集区域（门控1C）。点击“多边形”在4C群体上绘制一个连续曲线门控（门控4C）。
12. 点击“新密度”创建 DCV-blue 与 DCV-red 的密度图（线性刻度），并应用“4C”门控；调整刻度以放大显示，然后点击“多边形”以绘制“4C_1”门控图，实现更精确的筛选（图2G).
13. 点击“新密度”创建一个新的FSC-A与BSC-A密度图，设置为线性刻度，并应用“4C_1”门；此时将出现三个按细胞大小分离的富集群体，分别对应细线期（L）/偶线期（Z）、粗线期（P）和双线期（D）的精母细胞。点击“多边形” 或 “椭圆”以细胞大小递增为依据绘制3个门：“L/Z”、“P”和“D”图 2H).
14. 点击“新的点图”在“4C_1”门内以线性刻度创建DCV-blue与DCV-red颜色点图，用于设门并确保三个细胞群呈连续排列顺序图 2I).
15. 同样，对于1C群体，点击“新密度”创建FSC-A与BSC-A的线性密度图，并应用“1C”门，选择统一大小的细胞作为纯圆形精子细胞群体，然后单击“椭圆”以绘制“RS”门控（图2J).

5. 分选雄性生殖细胞亚群

1. 准备含有 500 μL 50% FBS 的 1.5 mL 离心管用于细胞收集，将收集管放入收集器中，然后点击“加载收集”。
2. 点击“下一管”、“开始”、“记录”和“开始分选”。若使用允许同时将两个目标细胞群分选至收集装置的双向系统，请按以下成对组合进行：基于 L/Z 反向门控的细线期（L）/偶线期（Z）和粗线期（P）精母细胞；基于 RS 和 D 反向门控的圆形精子细胞（RS）和双线期（D）精母细胞。
3. 在样本运行过程中，将流速调节至约 3000 事件/秒，以获得最高效的分选效果。

6. 分选细胞的纯度分析

1. 收集每种细胞群体 ≥ 10,000 个细胞。进行细胞免疫染色以确认减数分裂亚阶段。
2. 在 4 °C 条件下以 300 x g 离心 5 分钟，小心弃去上清液，保留约 110 µL 液体于管底。
3. 取 10 µL 细胞悬液滴加至载玻片，于显微镜下观察，评估细胞形态及数量概况。
4. 将 100 µL 细胞悬液分别加入各样品腔载玻片（参见材料表），并将腔室装入细胞离心涂片机。
5. 在室温下以 30 x g 离心 5 分钟。用疏水笔在载玻片上围绕细胞区域画圈，随后将载玻片置于实验台面上于室温干燥数分钟。
6. 在载玻片的圈内滴加 50 µL PBS，轻敲去除。
7. 在载玻片的圈内加入一抗溶液（将一抗用含 0.02% Polysorbate 20 的 PBS 配制的 5% 驴血清稀释），于 4 °C 过夜孵育。
   注意：为判断减数分裂期精母细胞的亚阶段，检测了 SYCP3（减数分裂染色体轴的标志物）和 γH2AX（DNA 损伤应答的标志物）。（一抗工作浓度请参见材料表）。
8. 轻敲去除载玻片上的一抗溶液。
9. 在载玻片的圈内滴加 50 µL PBS，轻敲去除。重复一次。
10. 在载玻片的圈内加入二抗溶液（将二抗用含 0.02% Polysorbate 20 的 PBS 稀释），于室温避光孵育 1 小时。
11. 在载玻片的圈内滴加 50 µL PBS，轻敲去除。重复一次。
12. 加入 50 µL DAPI 染液（储存浓度为 0.1 μg/mL），染色 5 分钟后轻敲去除。
13. 在载玻片上滴加 1–2 滴封片剂，小心盖上盖玻片，轻轻按压以去除多余封片剂和气泡。载玻片即可用于显微镜观察。

结果

该分选方案的代表性结果如图3所示。两个睾丸（一只小鼠）的总分选时间通常约为3小时，具体时长取决于细胞悬液浓度和分选速度。分选后，通过SYCP3和γH2AX的免疫荧光染色确认精母细胞的纯度（图3A）。分选得到的L/Z期、P期和D期精母细胞组分的代表性纯度分别约为80.4%、90.6%和87.6%（图3C）。我们依据此前发表的标准¹⁹确定了各亚阶段。简而言之，在细线期和偶线期，同源染色体之间的联会尚未完成，表现为SYCP3染色呈细丝状结构；由于程序性DNA双链断裂的存在，γH2AX在整个核染色质中呈现广泛的信号分布。在粗线期，同源染色体已完全联会，γH2AX特异性地富集于性染色体上。在双线期，同源染色体逐步发生去联会。通过DCV对细胞核染色确认RS的纯度（图3B）。RS可通过DNA染色精确判断：其特征为一个DAPI强荧光的染色中心被常染色质包围；也可结合特异...

讨论

本文介绍一种从单只成年雄性小鼠中分离精母细胞和精子细胞亚群的实用且简便的实验方案。为确保本方案的可重复性，需特别注意一些关键步骤。在酶消化前，洗涤步骤旨在去除间质细胞；消化后，该步骤有助于去除精子和碎片。洗涤/离心3次至关重要。在我们的解离缓冲液配方中，多种不同酶的组合可有效将睾丸组织解离为单细胞悬液，同时避免细胞过度损伤。轻柔吹打以避免产生气泡，也有助于保护细胞完整性。解离后请在显微镜下检查细胞悬液，确保达到单细胞水平。解离不完全或因过度消化导致的碎片污染会影响分选细胞的纯度；如图S2所示，直立的细胞群中含有碎片及精子细胞四聚体。DCV染色需避光孵育，之后无需洗涤。

为解决精母细胞亚群门控及反向门控过程中可能出现的困难，作为优化的可选方案，我们建议使用同步化的野生型小鼠，以帮助定位特定阶段的精母细胞^22,23,24。还需注意的是，某些具有生精障碍表型的基因敲除小...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 ml 离心管	Watson	131-7155C
100 mm 培养皿	Corning, Falcon	351029
15 mL 离心管	Watson	1332-015S
5 ml 聚苯乙烯管，带细胞滤网 snap cap（35 µm 尼龙滤膜）	Corning, Falcon	352235
50 mL 离心管	Watson	1342-050S
60 mm 培养皿	Corning, Falcon	351007
70 µm 尼龙滤膜	Corning, Falcon	352350
细胞分选仪	Sony	SH800S
离心机
胶原酶，重组型，无动物源成分	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	036-23141
胶原酶 I 型	Worthington	LS004196
盖玻片	Fisher	12-544-G
Cytospin 3 细胞离心涂片机	Shandon
DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐）	Fisher	D1306	工作浓度：0.1 μg/mL
脱氧核糖核酸酶 I（DNase I）	Sigma	D5025-150KU
驴血清	Sigma	S30-M
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液（DPBS）	Gibco	14190144
杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）	Gibco	11885076
胎牛血清（FBS）	Gibco	16000044
组蛋白 H1t 抗体	由 Mary Ann Handel 惠赠		稀释比例：1/2000
Hank’s 平衡盐溶液（HBSS）	Gibco	14175095
牛睾丸透明质酸酶	Sigma	H3506-1G
磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma	P5493-4L
移液器
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂	Fisher	P36930
rH2AX 抗体	Millipore	05-635	工作浓度：2 μg/mL
精子受精蛋白 56（Sp56）抗体	QED Bioscience	55101	工作浓度：0.5 μg/mL
灭菌镊子和剪刀
Superfrost /Plus 显微载玻片	Fisher	12-550-15
SYCP3 抗体	Abcam	ab205846	工作浓度：5 μg/mL
TWEEN 20（聚山梨酯 20）	Sigma	P9416
Vybrant DyeCycle Violet 染色剂（DCV）	Invitrogen	V35003
水浴锅