小鼠结膜共生菌的分离与鉴定

摘要

本文介绍了一种分离和扩增小鼠结膜共生的好氧菌及兼性厌氧菌的实验方案，该方法采用独特的结膜拭子取样，并结合基于培养的富集步骤，随后通过微生物学方法及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）进行菌种鉴定。

摘要

眼表曾被认为具有免疫豁免性且无菌，但最近的研究表明，眼表存在少量但持续的共生微生物。由于这些微生物丰度较低，且缺乏适用于共生菌生长与鉴定的适当方法，因此对眼黏膜部位细菌种类的鉴定和监测一直具有挑战性。目前有两种标准方法：基于培养的方法或DNA测序方法。第一种方法因可回收的细菌数量有限而存在缺陷，第二种方法则会同时检测到活菌和死菌，从而导致对眼表微生物环境的错误表征。我们在标准微生物培养技术的基础上，开发出一种高效且灵敏的细菌分离方法。该方法基于拭子采样，使用实验室自制的细拭子采集下结膜囊样本，随后进行需氧菌和兼性厌氧菌类群的扩增培养。通过该方案，我们成功分离并鉴定了包括Corynebacterium spp., Coagulase Negative Staphylococcus spp., Streptococcus spp.等在内的结膜共生菌种。该方法适用于在不同疾病状态下定义小鼠眼表共生菌群的多样性。

引言

本实验方案旨在增强从眼结膜中特异性分离出具有活性的稀有需氧菌及兼性厌氧微生物的能力，以表征眼部微生物组。已有大量研究对皮肤、肠道、呼吸道和生殖道等黏膜部位的共生微生物群落进行了分析，并表明这些菌群影响免疫系统的发育及其应答过程^1,2,3。研究表明，某些疾病状态下眼部共生菌群会发生改变，例如干眼病⁴、干燥综合征⁵和糖尿病⁶。然而，由于与其他黏膜部位相比，眼部微生物的丰度相对较低，目前尚难以明确界定典型的眼表共生菌群^6,7,8。这引发了关于是否存在定植性眼部微生物组的争议，以及如果存在，其是否与皮肤微生物组不同，进而影响局部先天免疫系统的发育与应答。本实验方案有助于解答这一问题。

通常，定义眼表共生微环境的方法主要基于测序和培养技术^4,7,

方案

涉及小鼠的所有操作均须遵循机构动物护理与使用委员会的指导原则。在处理微生物和可能被污染的材料时，应遵守实验室安全指南（以机构环境健康与安全部门的指导为准）。在处置可能具有生物危害性的污染材料之前，须使用适当的废弃物容器并执行去污程序。

1. 眼拭子制备、操作区域设置、小鼠眼拭子采集及样本富集

1. 准备无菌眼拭子
   注意：无菌眼拭子为自制，由薄层棉花包裹的细木签制成，棉花层极薄。
   1. 根据需采样的小鼠数量，将适量的棉絮和木签放入高压灭菌器中进行灭菌。
   2. 用拇指和食指夹取约半厘米长的棉絮，通过从边缘拉伸使棉絮展开成一层扁平、多孔的单层结构，注意不要拉散（拉伸后棉絮中散布少量细小棉纤维可接受）。
   3. 将展开的棉絮轻轻缠绕在木签的一端尖头上，同时旋转木签并用拇指和食指轻捏固定，见图1。完成的眼拭子应在尖端覆盖一层极薄的棉层，从尖端向外延伸约0.5至1厘米。
   4. 将“完成”的拭子以棉头朝下的方式插入小烧杯中，盖上盖子后进行高压灭菌。
2. 设置工作区域
   1. 在无菌的50 mL离心管中配制麻醉剂：包含2 mL氯胺酮（100 mg/mL）、400 µL赛拉嗪（100 mg/mL）和27.6 mL无....

结果

眼拭子平板的代表性结果图示了不同的平板接种方法 图3A 显示来自C57BL/6小鼠的形态多样性的分离株。针对每种形态不同的分离株，统计条带中的菌落数量，并计算每眼拭子中独特的菌落形成单位（CFUs）的相对丰度，用于比较分析。为进行微生物学表征，从各小鼠眼拭子平板上挑取细菌，制备主TS平板（通过从每只小鼠眼拭子平板上重复三次挑取形态不同的分离株构建）。在次日或菌落出现后，利用主平板进行额外检测，以表征或鉴定微生物。主平板用于提供足够的接种物以扩增相应的分离株。

采用微生物学技术对菌种进行特征鉴定，随后通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）分析进行鉴定。对主培养板上的每一份分离株均进行过氧化氢酶试验检测。^13,14 并在选择性培养基上培养。由于本研究中的主要微生物是 链球菌属 spp., 葡萄球菌属 和 棒状杆菌属 spp. 甘露醇.......

讨论

由于眼表处于细菌稀少的状态，许多实验室在分离眼表共生菌时遇到困难^7,20，导致培养出菌的样本数量少、菌量低且多样性不足⁸。本方法通过引入富集步骤、重新设计的眼部拭子以及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）鉴定，显著改进了标准培养技术^4,21。富集步骤通过扩增细菌载量，解决了回收率低的问题。从每眼拭子回收的细菌数量由不足100 CFU显著增加至2,500 CFU的相对丰度（野生型雄性小鼠），表明在营养丰富的培养基中孵育可重新激活存活但不可培养的细菌^22,23，从而实现对休眠微生物的回收。近期，基于培养的富集步骤已被整合到微生物组分子测序研究中，以区分宿主与微生物的表达特征²⁴

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.1 至 10 µl 移液器吸头	USA Scientific	1110-300	使用前高压灭菌
0.5 至 10 µl Eppendorf 移液器	Fisher Scientific	13-690-026
1 ml 注射器	Fisher Scientific	BD309623	每组眼拭子使用一支注射器
1.5 ml Eppendorf 离心管	USA Scientific	1615-5500	使用前高压灭菌
1000 µl 移液器吸头	USA Scientific	1111-2021	使用前高压灭菌
200 至 1000 µl Gilson 移液器（P1000）	Fisher Scientific	F123602G
25 G 针头	Fisher Scientific	14-826AA	每组眼拭子使用一个针头
3 % 过氧化氢	Fisher Scientific	S25359
37 °C 培养箱	实验设备
70 % 异丙醇	Fisher Scientific	PX1840-4
Ana-Sed 注射液（赛拉嗪 100 mg/ml）	Santa Cruz Animal Health	SC-362949Rx
BD BBL 革兰染色试剂盒	Fisher Scientific	B12539
本生灯	实验设备
洁净纸巾	实验设备
棉絮/无菌卷棉	CVS
一次性 1 ml 移液管	Fisher Scientific	13-711-9AM	用于革兰染色和触酶试验
E.coli	ATTC	ATCC 8739
载玻片	Fisher Scientific	12-550-A3	用于革兰染色和触酶试验
氯胺酮（100 mg/ml）	Henry Schein	9950001
麦康凯琼脂平板	Fisher Scientific	4321270	4 °C 保存至使用前
甘露醇盐琼脂	Carolina Biological Supply	784641	按制造商说明制备平板，4 °C 保存一周
小鼠	Jackson Labs	C57/BL6J
培养皿	Fisher Scientific	08-757-12	用于甘露醇盐琼脂平板
RPI 脑心浸液培养基	Fisher Scientific	50-488525	按说明配制并高压灭菌
SteriFlip（0.22 µm 孔径聚酯砜滤膜）	EMD/Millipore, Fisher Scientific	SCGP00525	用于麻醉剂的除菌过滤
无菌 Corning 离心管	Fisher Scientific	430829	麻醉剂配制
无菌小鼠笼	实验设备
牙签（圆形竹制）	Kitchen Essentials		使用前高压灭菌，并用于拭子制备
含 5% 羊血的胰蛋白酶大豆琼脂 II 平板	Fisher Scientific	4321261	4 °C 保存至使用前
Vitek 靶板	BioMerieux Inc. Durham,NC
Vitek-MS	BioMerieux Inc. Durham,NC
Vitek-MS CHCA 基质溶液	BioMerieux Inc. Durham, NC	411071
一次性眼药水	CVS Pharmacy		Bausch and Lomb Soothe 润滑眼药水，28 支，每支 0.02 fl oz