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方法文章

小鼠结膜共生菌的分离与鉴定

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DOI：

10.3791/61672

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2021年5月1日

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1Department of Medicine, Division of Infectious Diseases, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 2Massachusetts Host-Microbiome Center, Department of Pathology, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 3Clinical Microbiology Laboratory, Department of Pathology, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School

本文内容

摘要

本文介绍了一种分离和扩增小鼠结膜共生的好氧菌及兼性厌氧菌的实验方案，该方法采用独特的结膜拭子取样，并结合基于培养的富集步骤，随后通过微生物学方法及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）进行菌种鉴定。

摘要

眼表曾被认为具有免疫豁免性且无菌，但最近的研究表明，眼表存在少量但持续的共生微生物。由于这些微生物丰度较低，且缺乏适用于共生菌生长与鉴定的适当方法，因此对眼黏膜部位细菌种类的鉴定和监测一直具有挑战性。目前有两种标准方法：基于培养的方法或DNA测序方法。第一种方法因可回收的细菌数量有限而存在缺陷，第二种方法则会同时检测到活菌和死菌，从而导致对眼表微生物环境的错误表征。我们在标准微生物培养技术的基础上，开发出一种高效且灵敏的细菌分离方法。该方法基于拭子采样，使用实验室自制的细拭子采集下结膜囊样本，随后进行需氧菌和兼性厌氧菌类群的扩增培养。通过该方案，我们成功分离并鉴定了包括Corynebacterium spp., Coagulase Negative Staphylococcus spp., Streptococcus spp.等在内的结膜共生菌种。该方法适用于在不同疾病状态下定义小鼠眼表共生菌群的多样性。

引言

本实验方案旨在增强从眼结膜中特异性分离出具有活性的稀有需氧菌及兼性厌氧微生物的能力，以表征眼部微生物组。已有大量研究对皮肤、肠道、呼吸道和生殖道等黏膜部位的共生微生物群落进行了分析，并表明这些菌群影响免疫系统的发育及其应答过程1,2,3。研究表明，某些疾病状态下眼部共生菌群会发生改变，例如干眼病4、干燥综合征5和糖尿病6。然而，由于与其他黏膜部位相比，眼部微生物的丰度相对较低，目前尚难以明确界定典型的眼表共生菌群6,7,8。这引发了关于是否存在定植性眼部微生物组的争议，以及如果存在，其是否与皮肤微生物组不同，进而影响局部先天免疫系统的发育与应答。本实验方案有助于解答这一问题。

通常，定义眼表共生微环境的方法主要基于测序和培养技术4,7,9。16S rDNA测序和BRISK分析7所揭示的微生物多样性高于基于培养的技术，但无法区分活菌与死菌。由于泪膜具有抗菌特性4，对许多微生物而言眼表环境具有较强杀伤性，从而产生大量游离DNA片段；基于DNA的方法会检测到这些残留物，可能导致将已死亡的细菌误判为常驻共生菌而非污染源。这会导致对共生菌的错误识别，并使眼表微环境被误认为具有更高的微生物丰度和多样性10。因此，通过基于DNA的方法准确界定眼表常驻微生物组十分困难。而传统的培养技术则因微生物载量过低而难以检出共生菌11。本方法在常规技术基础上进行了改进：采用细小拭子精准采集结膜样本，避免邻近皮肤的污染；同时引入短时间富集培养策略，使用营养丰富的培养基促进可存活但不可培养（viable but non-culturable）的微生物复苏，并富集稀有的可存活微生物。

每份眼拭子样本中眼部共生菌的相对丰度结果，可表征结膜定植微生物组，对于比较分析具有重要意义。我们的数据显示，皮肤与结膜微生物群之间存在差异，且随着年龄增长微生物多样性增加，同时不同性别的共生菌丰度也存在特异性差异。此外，该方法已可重复地发现无特定基因小鼠中存在共生菌群的差异12。本方案可用于描述可能因饲养条件、地理环境或疾病状态而变化的眼部微生物组，以及共生菌代谢物及其产物对免疫系统发育和应答的局部影响。

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方案

涉及小鼠的所有操作均须遵循机构动物护理与使用委员会的指导原则。在处理微生物和可能被污染的材料时，应遵守实验室安全指南（以机构环境健康与安全部门的指导为准）。在处置可能具有生物危害性的污染材料之前，须使用适当的废弃物容器并执行去污程序。

1. 眼拭子制备、操作区域设置、小鼠眼拭子采集及样本富集

  1. 准备无菌眼拭子
    注意：无菌眼拭子为自制，由薄层棉花包裹的细木签制成，棉花层极薄。
    1. 根据需采样的小鼠数量，将适量的棉絮和木签放入高压灭菌器中进行灭菌。
    2. 用拇指和食指夹取约半厘米长的棉絮，通过从边缘拉伸使棉絮展开成一层扁平、多孔的单层结构，注意不要拉散（拉伸后棉絮中散布少量细小棉纤维可接受）。
    3. 将展开的棉絮轻轻缠绕在木签的一端尖头上，同时旋转木签并用拇指和食指轻捏固定，见图1。完成的眼拭子应在尖端覆盖一层极薄的棉层，从尖端向外延伸约0.5至1厘米。
    4. 将“完成”的拭子以棉头朝下的方式插入小烧杯中，盖上盖子后进行高压灭菌。
  2. 设置工作区域
    1. 在无菌的50 mL离心管中配制麻醉剂：包含2 mL氯胺酮（100 mg/mL）、400 µL赛拉嗪（100 mg/mL）和27.6 mL无菌生理盐水（dH2O中0.9% NaCl）。过滤除菌后分装，供立即使用（可于4 °C保存1个月；使用前务必恢复至室温）。
    2. 用消毒剂清洁工作区域，以减少污染风险。
    3. 将0.5 mL无菌脑心浸出液培养基（BHI）分装至已标记的1.5 mL无菌微量离心管中（每只小鼠及对照各一管），并置于微量离心管架上，将管架置于冰上。
    4. 按以下顺序布置工作流程（从左到右）：小鼠麻醉区（含实验小鼠的笼子、空的无菌笼子、室温麻醉剂、25 G针头和1 mL注射器）、眼拭子采样区（分装好的BHI置于冰上、灭菌眼拭子、 干净纸巾、70%异丙醇喷雾）和接种区（室温血液琼脂平板、10 µL移液器、10 µL无菌一次性吸头、生物危害废物容器）。
  3. 眼拭子采样
    1. 对每只成年小鼠按每克体重10 µL剂量腹腔注射氯胺酮和赛拉嗪麻醉剂，并将小鼠放入已灭菌的笼子中。通过轻捏 后肢足垫测试麻醉效果；无反应表明麻醉充分。
    2. 指定一只手仅用于处理麻醉后的小鼠，另一只手仅用于操作眼拭子和培养管。采样时，将完全麻醉的小鼠从笼中取出，置于干净的工作台面上 ，侧放，使左眼暴露。用异丙醇喷洒戴手套的手，再用干净纸巾擦干。
    3. 用专用于处理培养基的手打开对应标记的BHI微量离心管盖。将管子放回冰上的微量离心管架。 将眼拭子的棉头浸入BHI培养基中，然后从管中取出，将拭子头在管内壁旋转2次以去除多余液体。 
    4. 用处理小鼠的手轻轻抓住小鼠颈背部皮肤固定。另一只手将眼拭子头接触左眼内侧结膜区域，见图2A。轻压眼球，并在下眼睑与眼球之间以“擦窗”方式来回移动拭子10次（图2B），保持压力恒定。
    5. 避免接触毛发，将拭子头垂直于插入方向轻轻抽出，立即将棉头朝下直接放入含有BHI培养基的已标记微量离心管中。 在采样后的眼部滴加润滑性眼药水。
    6. 将小鼠放回笼中。
    7. 让拭子在冰上静置10至15分钟，然后用已灭菌的手套取出眼拭子，将拭子头在培养基中混合旋转10圈。再将拭子头沿微量离心管内壁旋转5圈后取出。将用过的拭子丢弃至生物危害废物容器中。
    8. 对每只小鼠及对照样本（皮肤或毛发拭子）重复步骤1.3.2至1.3.7。每次采样之间应适当消毒手套。
  4. 增菌培养
    1. 将样品管在37 °C静置培养1小时以进行增菌。
    2. 在培养期间，为每只小鼠准备一个室温的含5%绵羊血的胰蛋白胨大豆琼脂平板（TSA平板），并将平板分为两半。
    3. 眼拭子培养物增菌结束后，从培养箱中取出样品并立即置于冰上。
    4. 短暂涡旋混匀样品，然后按照图3A所示示意图进行接种。取10 µL样品滴加到TSA平板上，倾斜平板形成条带，重复2次。
    5. 在平板分界线的另一侧，将10 µL样品点样于琼脂表面，重复9次。
    6. 将平板在37 °C培养18小时、2天和4天（置于防止琼脂干燥的洁净环境中）。计数条带中的菌落，记录形态特征，并计算形态相似菌落的每拭子菌落形成单位（CFUs）。观察点样区域以发现条带中未捕获的独特微生物。

2. 眼部微生物的主培养板、表征与鉴定

  1. 主培养板
    1. 在TSA平板背面画上网格图3B用无菌牙签从每只小鼠眼拭子平板上挑取单个菌落，在主平板方格（网格）上划线，用菌落编号和小鼠信息标记网格。对每种形态学上不同的菌落，分别挑取并接种三个不同的单菌落。
    2. 在37 °C条件下将培养板孵育过夜。继续孵育96小时，每天观察是否有新的分离菌出现。
      注意：共生菌群的组成会因小鼠年龄、营养状况、疾病状态和饲养条件的不同而有所差异。本实验室所进行的分离株特征鉴定主要基于其中占主导地位的需氧菌和兼性厌氧菌。
  2. 表征
    1. 重复13 在甘露醇盐琼脂（MSA）和麦康凯（MAC）平板上接种微生物，于37 °C培养过夜。记录每种分离物的生长情况，以及在MSA上是否存在蜡样菌落或带晕圈的黄色菌落。
    2. 对于革兰氏阳性球菌，使用过氧化氢酶试验进行检测13,14. 在洁净的玻璃载玻片上滴加一滴3%过氧化氢。使用无菌牙签从眼拭子培养平板上挑取相应的微生物。无气泡产生表明 链球菌属，轻微的气泡形成表明 棒状杆菌属 spp. 及可能的气球菌属 spp. 快速气泡形成表明 葡萄球菌属
  3. 鉴定：MALDI-TOF MS 分析
    注意：细菌鉴定采用MALDI-TOF及软件数据库进行。该系统利用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱技术（MALDI-TOF MS）生成谱图特征，并与已知细菌的谱图进行比对以实现鉴定。 大肠杆菌，ATCC 8739，用于系统校准。
    1. 将细菌分离物接种于含5%羊血的TSA平板上，于37 ˚C、5%二氧化碳条件下培养过夜。
    2. 使用1 µL的取样环，将纯化的细菌均匀涂布于MALDI-TOF靶板上；随后覆盖1 µL MALDI-TOF MS CHCA基质溶液（α-氰基-4-羟基肉桂酸），待其完全自然干燥后，将靶板装入MALDI-TOF仪器中。
    3. 每个分离株均设置两个重复点样。
    4. 概率评分高于80%的报告被视为具有高区分价值，可作为可靠结果接受，并认可其细菌鉴定结果。

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结果

眼拭子平板的代表性结果图示了不同的平板接种方法 图3A 显示来自C57BL/6小鼠的形态多样性的分离株。针对每种形态不同的分离株，统计条带中的菌落数量，并计算每眼拭子中独特的菌落形成单位（CFUs）的相对丰度，用于比较分析。为进行微生物学表征，从各小鼠眼拭子平板上挑取细菌，制备主TS平板（通过从每只小鼠眼拭子平板上重复三次挑取形态不同的分离株构建）。在次日或菌落出现后，利用主平板进行额外检测，以表征或鉴定微生物。主平板用于提供足够的接种物以扩增相应的分离株。

采用微生物学技术对菌种进行特征鉴定，随后通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）分析进行鉴定。对主培养板上的每一份分离株均进行过氧化氢酶试验检测。13,14 并在选择性培养基上培养。由于本研究中的主要微生物是 链球菌属 spp., 葡萄球菌属 和 棒状杆菌属 spp. 甘露醇...

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讨论

由于眼表处于细菌稀少的状态，许多实验室在分离眼表共生菌时遇到困难7,20，导致培养出菌的样本数量少、菌量低且多样性不足8。本方法通过引入富集步骤、重新设计的眼部拭子以及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）鉴定，显著改进了标准培养技术4,21。富集步骤通过扩增细菌载量，解决了回收率低的问题。从每眼拭子回收的细菌数量由不足100 CFU显著增加至2,500 CFU的相对丰度（野生型雄性小鼠），表明在营养丰富的培养基中孵育可重新激活存活但不可培养的细菌22,23，从而实现对休眠微生物的回收。近期，基于培养的富集步骤已被整合到微生物组分子测序研究中，以区分宿主与微生物的表达特征24

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致谢

来自 P30 DK034854 的资助支持了 VY、LB 以及麻省宿主-微生物组中心的研究工作，来自 NIH/NEI R01 EY022054 的资助支持了 MG。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.1 至 10 µl 移液器吸头USA Scientific1110-300使用前高压灭菌
0.5 至 10 µl Eppendorf 移液器Fisher Scientific13-690-026
1 ml 注射器Fisher ScientificBD309623每组眼拭子使用一支注射器
1.5 ml Eppendorf 离心管USA Scientific1615-5500使用前高压灭菌
1000 µl 移液器吸头USA Scientific1111-2021使用前高压灭菌
200 至 1000 µl Gilson 移液器（P1000）Fisher ScientificF123602G
25 G 针头Fisher Scientific14-826AA每组眼拭子使用一个针头
3 % 过氧化氢Fisher ScientificS25359
37 °C 培养箱实验设备
70 % 异丙醇Fisher ScientificPX1840-4
Ana-Sed 注射液（赛拉嗪 100 mg/ml）Santa Cruz Animal HealthSC-362949Rx
BD BBL 革兰染色试剂盒Fisher ScientificB12539
本生灯实验设备
洁净纸巾实验设备
棉絮/无菌卷棉CVS
一次性 1 ml 移液管Fisher Scientific13-711-9AM用于革兰染色和触酶试验
E.coliATTCATCC 8739
载玻片Fisher Scientific12-550-A3用于革兰染色和触酶试验
氯胺酮（100 mg/ml）Henry Schein9950001
麦康凯琼脂平板Fisher Scientific43212704 °C 保存至使用前
甘露醇盐琼脂Carolina Biological Supply784641按制造商说明制备平板，4 °C 保存一周
小鼠Jackson LabsC57/BL6J
培养皿Fisher Scientific08-757-12用于甘露醇盐琼脂平板
RPI 脑心浸液培养基Fisher Scientific50-488525按说明配制并高压灭菌
SteriFlip（0.22 µm 孔径聚酯砜滤膜）EMD/Millipore, Fisher ScientificSCGP00525用于麻醉剂的除菌过滤
无菌 Corning 离心管Fisher Scientific430829麻醉剂配制
无菌小鼠笼实验设备
牙签（圆形竹制）Kitchen Essentials使用前高压灭菌，并用于拭子制备
含 5% 羊血的胰蛋白酶大豆琼脂 II 平板Fisher Scientific43212614 °C 保存至使用前
Vitek 靶板BioMerieux Inc. Durham,NC
Vitek-MSBioMerieux Inc. Durham,NC
Vitek-MS CHCA 基质溶液BioMerieux Inc. Durham, NC411071
一次性眼药水CVS PharmacyBausch and Lomb Soothe 润滑眼药水，28 支，每支 0.02 fl oz

参考文献

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