在小鼠心肌梗死模型中移植三维生物打印补片

摘要

本方案旨在将三维生物打印贴片移植到模拟心力衰竭的小鼠梗死心外膜上。内容包括麻醉、开胸手术、左前降支冠状动脉永久性结扎以及将生物打印贴片应用于心脏梗死区域的详细操作步骤。

摘要

利用永久性左前降支（LAD）结扎的小鼠心力衰竭模型，在体内测试3D生物打印心脏补片的再生性能是一项具有挑战性的操作，因其本身性质导致较高的死亡率。我们建立了一种方法，能够稳定地将生物打印的细胞-水凝胶补片移植到梗死小鼠心脏的心外膜上，从而以可靠且可行的方式评估其再生能力。首先，对小鼠进行深度麻醉，随后小心地进行气管插管并实施机械通气。在行左侧胸廓切开术（胸部的外科切口）后，暴露并永久结扎左前降支，然后将生物打印补片移植至心外膜表面。胸腔关闭后，小鼠可迅速从手术中恢复。该方法具有可靠且快速的优点，预计术后28天内的死亡率可低至30%（低于其他研究报道的类似小鼠永久LAD结扎模型44%的死亡率）。此外，本方案所述方法具有良好的通用性，可根据需要进行调整，用于测试含有不同类型细胞或水凝胶的生物打印补片，尤其适用于需要大量动物以确保统计效能的研究。总体而言，我们提出这一优势显著的方法，有望在未来的心脏再生与组织工程领域的临床前研究中改变现有的测试范式。

引言

心脏移植是治疗终末期心力衰竭患者的金标准，但供体器官严重短缺。该手术需要抑制免疫系统以防止移植物排斥，全球范围内术后一年死亡率为15%¹。因此，长期以来人们一直致力于在临床前动物模型中实现心肌再生，以期推进到人体试验^{2,3,4,5,6,7,8,9}。近年来，利用干细胞或干细胞衍生的心脏细胞进行3D生物打印的技术进展备受关注，被视为一种具有前景的心肌再生策略^{2,3,9,10,11,12}。

已有研究报道了将补片用于心脏再生的首个人体安全性试验，其中将自体骨髓单个核细胞悬浮于胶原中，或将胚胎干细胞来源的心脏前体细胞悬浮于纤维蛋白中，移植至心外膜^7,8,13。然而，为了实现更精确、可扩展、可自动化且可重复的方法，采用三维生物打印技术制备优化的水凝胶补片并将其应用于心脏心外膜表面，是一种极具前景的心肌再生策略，有望用于原本需要心脏移植的患者^2,10,11,12。

在开展人体试验之前，必须先进行临床前动物研究。已有报道采用猪⁵、绵羊¹⁴、大鼠⁶和小鼠⁴作为心肌再生的临床前体内模型。小鼠心肌梗死（MI）的常用模型是永久性结扎左前降支（LAD）冠状动脉^15,16。在所使用的不同小鼠品系中，C57BL6小鼠的永久性LAD结扎具有可接受的存活率，并且在心肌梗死后通常表现出一致的心室重构和心脏变化¹⁶。在啮齿类动物模型中，已有多种方法被描述，旨在将心脏组织应用于心脏以实现受损心肌的有效再生^4,6,17。尽管大型动物仍然是测试心脏再生特性的更具临床相关性的模型^5,14，但小鼠模型的灵活性和可行性使其适用于这一快速发展的研究领域。这可能避免大型动物研究中常见的一些缺陷，包括但不限于：1）动物死亡率高（除非结扎对角支冠状动脉导致不可预测的节段性梗死¹⁴，或阻塞LAD远端后进行再灌注而非永久性结扎⁵）；2）与小鼠相比，大型动物实验造成的相对更大伤害引发的伦理问题¹⁸；3）成本增加和/或可行性问题，例如大型动物专用设备（如MRI扫描仪）相对难以获得¹⁴。还应注意到，由于大型动物研究通常耗时较长且需要大量投入，它们有可能在完成之前就已过时，尤其是在该领域技术迅速发展的背景下。例如，最近才逐渐明确炎症细胞及其介质在调控心脏再生中的关键作用^19,20。此外，《柳叶刀》委员会已强调，临床前研究（如小型动物模型）是在推进至人体试验前获取可靠知识的必要步骤²¹。

为了促进对基于补片的心脏再生方法在体内的机制理解并优化其条件，本文介绍了一种新颖的方法，描述了如何采用“ scoop and drape”（挖取与覆盖）技术将3D生物打印的海藻酸盐/明胶水凝胶补片应用于C57BL6小鼠梗死心脏表面。该方法的目的是提供一种通用的在体模型，用于测试3D生物打印补片，适用于快速发展的心脏再生研究领域中广泛的科研场景²。该技术可进一步拓展用于在体内评估非生物打印方法制备的补片、不同类型的水凝胶，以及补片中包含的自体或异体干细胞来源的细胞。然而，有关生物打印技术、水凝胶材料或细胞类型的详细讨论不在本研究范围之内，本研究重点在于手术移植方法。

该方案的优势包括：心肌梗死的诱导与生物打印补片的应用可在一次手术中完成，操作快速，仅需常规且经济的实验设备，且动物死亡率相对较低。此外，在较小的空间内通常可容纳比大型动物模型更多的实验动物，从而允许设置更多实验组进行充分的组间比较，尤其适用于体内多组对比研究。然而，该方案也存在以下不足：1）小鼠模型的心脏大小、解剖结构和生理特性与人类相比，较大型动物模型更远，因此不能直接外推至人类；2）小鼠左前降支（LAD）起始位置较近，且个体间存在显著差异，导致梗死面积变异较大（这一问题在大型动物模型中同样存在）；3）补片需覆盖整个心脏前表面，相较于仅针对特定梗死区域进行修补，精确性较低；4）补片是在心肌梗死（MI）发生后立即施用，而临床上更理想的应用场景可能是开发一种用于在初次心肌梗死数月后治疗慢性梗死后衰竭心脏的补片¹⁴。

然而，如果根据待验证的假设合理选择，该方案能够快速提供关键的体内数据，并具有较高的样本量（n值），同时与大多数实验室现有的材料、预算和专业技术水平相适应。与大型动物模型相比，这是一种具有足够适应性的体内模型，可灵活结合新兴的3D生物打印技术（例如，可在转向大型动物模型之前，相对容易地开展预试验以评估其可行性与安全性）。该模型非常适合希望高效且低成本地获取体内数据的研究人员，或许可用于对具有不同生物打印参数、细胞类型或水凝胶成分的3D生物打印补片进行多项比较研究。在体内测试不同组合的干细胞及其分化细胞与水凝胶之间的相互作用时，该模型尤为有用，可避免使用大规模补片可能导致的昂贵细胞系或其他材料的过度浪费。采用小鼠模型还有助于测试含有物种匹配的小鼠来源细胞和干细胞系的补片，或在需要特定免疫缺陷的均一化小鼠时测试人源细胞。此外，在基因修饰小鼠品系中进行测试，可使研究人员分离出特定基因在心血管疾病相关信号通路及特定细胞类型中的作用，而这一点在目前的大型动物模型中尚无法实现。

方案

本实验中描述的所有操作程序均经澳大利亚新南威尔士州北悉尼地方卫生区动物伦理委员会批准（项目编号 RESP17/55）。

1. 麻醉与插管

注意：打开并设置体视显微镜、加热垫（覆盖吸水垫）和通风系统。

1. 使用70%乙醇清洁手套、手术区域和工具。
2. 称量小鼠体重，以计算经腹腔注射的麻醉剂剂量（氯胺酮 40 mg/kg，赛拉嗪 5 mg/kg，阿托品 0.15 mg/kg），并进行注射。
3. 当小鼠达到深度麻醉状态后，使用修剪器剃除胸部左侧腹面的毛发。
4. 将小鼠置于含有2%异氟烷的密闭舱内（确保室内具备足够的排风系统）。
   注：较低剂量的氯胺酮/赛拉嗪注射联合2%异氟烷吸入，可在避免小鼠苏醒的同时降低死亡风险，有利于实现最佳插管条件。
5. 将小鼠仰卧固定，用3.0缝线粘贴于实验台面，钩住其上门齿，如视频所示。通过脚趾夹捏测试确认镇静状态。在小鼠颈部上方放置高强度照明装置，以便观察口咽部结构。
   注：也可将小鼠固定于插管套件配套的支架上（例如 Kent 小鼠插管套件），使用弹性带固定于上门齿下方，使口腔张开，便于识别气管。
6. 使用弯形刮匙打开下颌，并用另一对刮匙或钝头镊子轻柔地将舌头移开。插管时应保持视线与小鼠身体持平或略低于其水平位置。
7. 观察声门的开闭情况。当声门张开时，插入插管套件提供的20 G塑料导管。
8. 小心将已插管的小鼠转移至配备加热垫的手术台面。将小鼠连接至呼吸机（例如 MouseVent），该设备会根据小鼠体重自动设定目标潮气量。
9. 通过氧气输送1.5–2%异氟烷（氧气由呼吸机自动调节：确保氧气钢瓶以1–2 L/min的流速连接至自动呼吸机）。通过观察双侧胸廓起伏确认插管成功，并通过脚趾夹捏测试验证麻醉深度。
10. 在双眼涂抹眼用软膏（例如 Puralube Vet Ophthalmic Ointment），防止角膜干燥。

2. 准备手术区域

1. 用胶带在呼吸机与呼吸管/导管的连接处固定气管插管。
2. 剪一段较长的胶带，将动物左前肢足部以略微抬高的位置固定在操作台面上，同时将其他四肢也固定妥当。
3. 用无菌的70%异丙醇和聚维酮碘溶液以从中心向外周画圈的方式清洁胸部。
4. 再次通过夹捏脚趾检查麻醉深度。
5. 通过皮下注射给予0.08 mg/kg的Temvet（丁丙诺啡），溶于0.1 mL的0.9%生理盐水中。

3. 左侧开胸术

1. 使用尖头镊子轻轻提起剑突左侧约 5 mm 处的皮肤。使用手术剪从该点向上并向中线方向做一斜向上方的皮肤切口，直至胸骨柄水平。
2. 使用弯头镊子轻轻分离皮肤和肌肉层。沿皮肤切口方向切开肌层。
3. 沿胸廓的自然角度，辨认第三肋间隙并在此做切口。
4. 使用牵开器轻轻撑开第 3 和第 4 肋。
5. 用镊子轻轻去除薄层心包膜。
6. 若未观察到前降支冠状动脉（LAD），可轻轻将左心耳（见补充图 1）向上推移，并在其下方定位冠状动脉。

4. 左前降支（LAD）永久性冠状动脉结扎

1. 剪取一段长约3 mm的3-0丝线，将此加固用的3-0丝线片段放置于左前降支（LAD）上方，方向与LAD一致（如视频02:12–02:20时间点所示）。
2. 识别左前降支（LAD），并将7-0丝线从LAD下方穿过。若LAD不清晰可见，可将针插入左心耳尖端在心脏动态运动时所达到的最下点下方1 mm偏内侧的位置。
   注意：该结构颜色较心室腔略浅，但比邻近肺组织颜色更深，在视频01:54–01:55时间点中最为清晰，可见其位于牵开器上臂下方、左肺上方（参见补充图1中的标注视频静态图像）。
3. 用7-0丝线完成两圈结扎，并在加固用的3-0丝线上方收紧打结，以固定LAD。若结扎成功，结扎远端的前心室区域将出现苍白。
4. 以第三圈反向打结完成结扎，确保结扎牢固，同时避免对缝线产生向上的牵拉力。无需额外打结，以降低缝线切割导致心肌或LAD损伤的风险。

5. 将生物打印贴片移植到心外膜

1. 使用已打开的无菌手术刀包装袋的内表面，小心地将生物打印补片从六孔板转移至梗死区域。
2. 将生物打印补片精确放置于心室前侧心外膜表面，使其完全覆盖该区域，并自然下垂覆盖下缘和侧缘，从而包覆左心室及梗死区（苍白区域）。
3. 轻柔关闭并取出牵开器，避免其锐利边缘朝向心脏。
4. 使用6-0 Prolene缝线，以单纯间断缝合方式关闭肋骨和肌肉层。
5. 在使用6-0 Prolene缝线关闭胸腔时，启用叹气呼吸（Sigh Breath）功能，使肺部膨胀，以排出胸膜腔内多余空气，防止空气滞留于胸腔导致气胸。
6. 确保胸腔完全密闭。
7. 将异氟烷浓度降至1.0%，用6-0 Prolene缝线以单纯间断缝合方式关闭皮肤，随后关闭异氟烷蒸发器。

6. 小鼠恢复

1. 在切口处局部应用含有0.9%氯化钠的2 mg/mL布比卡因。同时给予：i) 安替达因（atipamezole）1 mg/kg；ii) 速尿灵（furosemide）8 mg/kg；iii) 通过皮下注射给予600 µL 0.9%氯化钠溶液。
   注意：安替达因用于更快地逆转麻醉作用；速尿灵用于减轻因心输出量受损以及药物注射时额外补液所导致的液体潴留。
2. 监测小鼠，待其出现自主呼吸后，方可将小鼠从气管插管中移出。
3. 当小鼠表现出足够且双侧对称的呼吸频率与深度，并对足趾夹捏有反应时，将其放入置于加热垫上的清洁恢复笼中。
4. 为小鼠提供湿润食物（湿润以利于咀嚼）、饮水瓶以及营养/补水凝胶。密切观察是否存在呼吸费力、过度出血或其他可能危及生命的并发症。
5. 术后连续三天，每天两次通过皮下或腹腔注射给予0.08 mg/kg Temvet（丁丙诺啡）溶于0.1 mL 0.9%氯化钠溶液中，之后在术后第五天前改为每日一次。
6. 将小鼠成对饲养于带有笼内隔板的笼子中，以防止隔离应激，同时避免打斗行为。自手术后至实验结束（28天）期间，至少每日监测一次小鼠状况，密切关注其健康状况，若发现任何异常则需增加监测频率。

结果

在移植时，该补片在室温下（未添加额外交联剂）具有一定的黏度，能够“贴合”心脏表面的轮廓（图1），并随心动周期动态运动。术后，我们将补片在体内保留28天，因为已有研究发现这一时间足以观察补片对宿主心脏功能的影响^3,4（尽管有报道指出，移植后三个月才能观察到完全的功能效应）²²。在图1中展示的小鼠心脏原位补片照片是在补片应用后立即拍摄的，显示了补片在移植时能够贴合心脏表面的能力。该代表性结果表明，水凝胶可使补片顺应心脏的轮廓，而在张力过大的区域，水凝胶会发生裂开，如图1中裸露（无水凝胶）的三角形区域所示（图像中以黑色星号标示）。生存数据（Kaplan-Meier生存曲线）如图2所示，与接受假手术的小鼠（仅将针线穿过LAD下方但不结扎，随后关闭胸腔）进行比较。

图1：应用于C57BL6小鼠心脏心外膜的生物打印心肌补片。 显示一个10 mm × 10 mm × 0.4 mm的生物打印补片（移植后立即成像），其中含有水凝胶（培养基中含4% (w/v)海藻酸钠和8% (w/v)明胶），覆盖在梗死区域并贴附于心外膜表面（白色箭头和虚线 = 补片边界）。补片的黏度使其能够贴合心脏表面轮廓，在上方区域因张力过大而出现裂口，形成一个未被水凝胶覆盖的三角形裸露区域（黑色星号）。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：心肌梗死后 28 天内的 Kaplan-Meier 生存分析。 手术组共有 9 只小鼠死亡（n=38），总体死亡率为 24%。请点击此处查看该图的放大版本。

补充图1：视频静止图像（视频时间点01:54–01:55），显示左心耳（左心房 appendage）。 箭头指向左心耳的下内侧尖端，该结构在心脏左上方边缘呈三角形可见。当左前降支（LAD）显示不清时，可将左心耳尖端作为穿刺定位标志，以引导缝线穿过LAD下方。进针点位于左心耳尖端在心脏动态运动过程中所达到的最下点的下方及内侧1 mm处（黑箭头指示左心耳的下内侧尖端）。请点击此处下载该图。

讨论

该方法使操作者能够高效地将生物打印的补片移植到永久性左前降支（LAD）结扎后的小鼠心脏梗死区域的心外膜表面。在此以可行性为重点的方法中，我们每天每个工作日可完成八只小鼠的手术操作（包括术前和术后房间的准备）。在六孔板中打印八个1 cm²补片的一次生物打印运行耗时2–3小时（包括前后准备时间）。我们使用外科手术刀片包装袋内部无菌部分作为补片的铲取工具，该工具易于获取且成本极低，并利用海藻酸盐/明胶水凝胶补片的天然黏附特性，将其覆盖于心脏前壁梗死区域表面。根据我们的经验，小鼠LAD结扎术的操作效果依赖于操作者的技术水平，由专精于该模型的熟练操作者实施时，28天内的死亡率更低。Van den Borne等¹⁶报道，在未使用补片的情况下，C57BL6小鼠在永久性LAD结扎后28天的死亡率为44%，高于本方法中我们观察到的30%上限。

插管步骤至关重要，若操作者技术不熟练，其本身即可能成为小鼠死亡的原因。由于气管尺寸极小，该操作难度较高，因此操作者在此步骤中需佩戴放大镜。我们采用注射酮胺/甲苯噻嗪联合吸入异氟烷进行麻醉诱导，使小鼠在每种药物相对较低剂量下即达到深度麻醉状态。因此，可避免小鼠在插管过程中苏醒的风险，同时规避了单一药物高剂量使用所导致的高死亡率。此外，还给予阿托品以拮抗心动过缓和唾液分泌过多等副作用。使用外部照射至喉部的聚光灯可使气管在内部透光，从而更清晰可见，且必须观察到声门随小鼠呼吸频率（通常约为每分钟120次）开合运动。此步骤中必须将小鼠体位精确摆放（因此更推荐使用硬质表面，而非在小鼠身下放置加热垫），用环形线固定两颗门齿，并用钝头镊子或刮勺极其轻柔地牵拉舌头，以充分张开口腔并暴露气管。插管完成后，在将小鼠从插管区域转移至手术台的过程中，操作者需注意避免移位脱管（手术台下配有加热垫，以防止低体温）。连接呼吸管路至呼吸机装置时，必须用一只手稳定气管插管，另一只手连接呼吸机管路，以最大限度减少插管移动，防止连接过程中将插管进一步推入气管深部。

在本研究中，我们使用了含4%（w/v）海藻酸盐和8%（w/v）明胶的杜尔贝科改良伊格尔培养基（Dulbecco’s Modified Eagle Medium, DMEM）。海藻酸盐/明胶水凝胶因其良好的生物相容性、低成本以及优异的生物力学特性，已被广泛应用于三维组织工程策略中²³。这些水凝胶可通过添加钙离子实现温和交联，从而实现对黏度的调控。生物打印完成后，我们将含2%（w/v）氯化钙（CaCl₂）的磷酸盐缓冲液（PBS）滴加至组织补片上，随后将其置于6孔板中的DMEM培养基中培养7至14天，再进行移植。该时间窗口为含有心肌细胞的补片在体外开始规律搏动但尚未发生解体的最佳时期。尽管在生物打印后的培养阶段可定期补充CaCl₂以减缓补片解体，但我们发现，水凝胶本身的固有黏度已足以维持补片结构的完整性，仅需一次初始剂量的CaCl₂处理即可支持其直至移植阶段。

该方法实现了无需缝合（缝合可能损伤心脏）或胶水（胶水可能阻塞补片与心脏之间的界面）的成功移植。未来的研究可能会验证无缝线、无胶水移植不会对小鼠的移植整合产生负面影响这一假设，因为关键在于补片不能从心脏上滑脱或干扰肺部功能。其他针对永久性左前降支结扎模型中基于补片修复的移植整合研究³，已采用多种方法进行评估，包括随时间测量残留的移植面积（mm²）²⁴、随时间测量移植补片的厚度（μm）²⁵、通过聚合酶链式反应（PCR）定量移植细胞²⁶，或检测标记的活体供体细胞的生物发光光子发射通量（即每秒发射的光子数，可用于定量活体动物中随时间存活的标记移植细胞）²⁷。未来的研究可采用这些方法进一步评估无缝线、无胶水移植是否影响补片的整合效果（以及对宿主心肌结构和功能的影响）。然而，在免疫功能正常的实验小鼠体内观察28天后，宏观上可见前纵隔存在不同程度的纤维素性渗出物和粘连。基于补片的心脏再生机制可能并非来自细胞数量的补充，而是源于对宿主巨噬细胞炎症反应的刺激¹⁹或分泌的免疫因子的作用²⁰。如果炎症发挥积极作用，则异物性水凝胶材料的存在可能具有益处。相反，若希望减少异物残留，水凝胶组分随时间逐渐降解可能更为有利。事实上，已有部分研究采用最初支持细胞生长但随后自行降解、最终仅留下组织的生物材料^28,29。未来对补片整合的全面分析以及对基于补片心脏再生机制的深入理解，可能有助于在推进至人体试验前优化实验设计²。

总体而言，该方案具有较高的可行性，也适用于测试多组含有不同细胞成分的3D生物打印补片。该方法的未来发展方向包括生物打印含有此前未在体内测试过的先进水凝胶的补片，或测试不同自体或同种异体干细胞来源细胞的作用效果，以在推进到大型动物模型之前实现优化。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3-0 不可吸收黑色编织处理丝线	Ethicon	232G
6-0，24”（60 cm）Prolene（聚丙烯）缝线，蓝色单丝	Ethicon	8805H
7-0，18”（45 cm）黑色编织丝线	Ethicon	768G
可调式体视显微镜，6.4倍放大	Olympus	SZ 3060 STU1
Anitisedan（阿替美唑）	Zoetis	N/A
硫酸阿托品 0.6 mg，1 mL 小瓶，10 支装	Symbion Pharmacy Services	ATRO S I2
布比卡因，20 mL，5 瓶	Baxter Heathcare	BUPI I C01
Temvet（丁丙诺啡），300 µg/mL，10 mL 瓶装	Troy Laboratories	TEMV I 10
弯头镊子	Kent Scientific	INS650915-4	虹膜敷料镊，10 cm 长弯头敷料镊；0.8 mm 带齿尖端；不锈钢材质
用于剪切肌肉/皮肤的解剖剪	Kent Scientific	INS600393-G	直头解剖剪，10 cm 长
气管插管套件	Kent Scientific	ETI-MSE	包含插管导管/管（20 G）、光纤光源和牙用压舌板
精细剪刀	Kent Scientific	INS600124	McPherson-Vannas 微型剪，8 cm 长，直头，0.1 mm 尖端，5 mm 刀刃；不锈钢材质
速尿（呋塞米）20 mg，2 mL，5 支装	Sigma Company	LASI A 1
术后动物恢复用加热垫	Passwell	PAD	Passwell 动物保暖加热垫 - 26 cm × 36 cm；10 瓦；软质 PVC 外套
氯胺酮 100 mg，50 mL	CEVA Animal Heath	KETA I 1
持针器	Kent Scientific	INS600137	Castroviejo 持针器，带齿，14 cm 长，1.2 mm 颚部带锁扣
配备 MouseVent G500 自动呼吸机的生理监测系统	Kent Scientific	PS-MVG
Puralube Vet 眼科软膏（无菌眼部润滑剂）	Dechra	17033-211-38
自持式带齿小鼠拉钩	Kent Scientific	INS600240	ALM 带齿自持式拉钩，7 cm 长
直头镊子	Kent Scientific	INS650908-4	超细敷料镊，12.5 cm 长，带齿尖端，0.35 × 0.10 mm；不锈钢材质
外科放大镜	Kent Scientific	SL-001
VetFlo 蒸发式麻醉机	Kent Scientific	VetFlo-1205S-M
赛拉嗪 100 mg，50 mL	Randlab	XYLA I R01