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方法文章

通过金纳米颗粒与葫芦[n]脲聚集体中精确等离激元纳米间隙的形成实现尿酸的定量SERS检测

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DOI：

10.3791/61682

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2020年10月3日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University College London (UCL), 2Institute for Materials Discovery, University College London (UCL)

本文内容

摘要

在水溶液中形成葫芦[7]脲与尿酸的主客体复合物后，将其少量加入金纳米粒子（Au NP）溶液中，利用模块化光谱仪进行定量表面增强拉曼光谱（SERS）检测。

摘要

本研究介绍了一种通过表面增强拉曼光谱（SERS）快速、高灵敏定量检测重要生物标志物尿酸（UA）的方法，使用模块化光谱仪在指纹区多个特征峰处实现了约0.2 μM的低检测限。该生物传感策略基于大环主体分子葫芦[7]脲（CB7）与尿酸之间的主客体络合作用，并在自组装的金纳米粒子：CB7（Au NP: CB7）纳米聚集体中形成精确的等离子体纳米间隙。此外，采用经典的柠檬酸盐还原法简便地合成了适用于SERS基底的理想尺寸金纳米粒子，亦可选择使用实验室自制的自动合成仪辅助完成。该方案可轻松拓展用于体液中多种生物标志物的多重检测，具有临床应用潜力。

引言

尿酸是嘌呤核苷酸代谢的终产物，是血液和尿液中重要的生物标志物，可用于诊断痛风、子痫前期、肾脏疾病、高血压、心血管疾病和糖尿病等疾病1,2,3,4,5。目前检测尿酸的方法包括比色酶法、高效液相色谱法和毛细管电泳法，这些方法耗时较长、成本较高，且需要复杂的样品前处理过程6,7,8,9。

表面增强拉曼光谱是一种有前景的常规即时诊断技术，因其可通过分子振动指纹实现生物分子的选择性检测，并具备高灵敏度、响应快速、操作简便以及无需或仅需极少样品前处理等优势。基于贵金属纳米颗粒（如 Au NPs）的 SERS 基底可将分析物分子的拉曼信号增强 4 到 10 个数量级10 通过表面等离子体共振引起的强电磁增强11. 与耗时的复杂金属纳米复合材料制备相比，可轻松合成尺寸可控的金纳米颗粒（Au NPs）12，因此因其卓越的性能而被广泛应用于生物医学领域13,14,15,16大环分子葫芦[n]脲（CBn，其中 n = 5-8, 10）修饰到金纳米颗粒（Au NPs）表面可进一步增强分析物分子的表面增强拉曼散射（SERS）信号，因为具有高度对称性和刚性结构的CB分子能够通过形成主客体复合物，精确调控金纳米颗粒之间的间距，并将分析物分子定位在等离子体热点的中心或附近区域。图1)17,18,19,20. 使用金纳米颗粒进行表面增强拉曼散射研究的先前实例：CBn 纳米聚集体包括硝基炸药、多环芳烃、二氨基茋、神经递质和肌酐21,22,23,24,25，表面增强拉曼散射（SERS）测量可在比色皿中进行，或通过将少量液滴加载至定制的样品 holder 上完成。该检测方案特别适用于在复杂基质中快速定量生物标志物，并具有高重复性。

本文展示了一种简便的方法，用于形成CB7与重要生物标志物UA的主客体复合物，并通过模块化光谱仪在水相中利用CB7介导的金纳米粒子（Au NPs）聚集实现UA的定量检测，检测限达0.2 μM，该方法在诊断和临床应用中具有广阔前景。

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方案

1. 金纳米颗粒的合成

  1. 通过传统Turkevich方法合成金种子26
    1. 在玻璃小瓶中，将98.5 mg HAuCl4·3H2O前驱体溶于10 mL去离子水中，配制10 mL 25 mM的HAuCl4溶液。
      注意：取少量HAuCl4前驱体置于称量舟中，使用塑料刮勺而非金属刮勺称量晶体，因为HAuCl4前驱体会腐蚀金属实验器具。称量操作应尽可能迅速，因HAuCl4具有吸湿性，会从空气中吸收水分而随时间增加重量。HAuCl4具有强腐蚀性，可导致严重皮肤灼伤和眼部损伤。操作时需格外小心。
    2. 在玻璃小瓶中，将64.5 mg柠檬酸钠粉末溶于0.5 mL去离子水中，配制0.5 mL 500 mM的柠檬酸钠溶液。
    3. 在250 mL蓝盖瓶中，将1 mL 25 mM HAuCl4溶液用99 mL水稀释，得到100 mL 0.25 mM的HAuCl4溶液。
    4. 将99.5 mL 0.25 mM HAuCl4溶液加入配有冷凝管的250 mL三颈圆底烧瓶中。在剧烈搅拌下加热至90 °C，并维持该温度15分钟。
    5. 向反应混合物中注入0.5 mL 500 mM柠檬酸钠溶液，并持续保持温度和搅拌，直至溶液颜色变为红宝石红色。
      注意：反应约需30分钟。
  2. 通过动力学控制法进行金纳米颗粒的种子生长13
    1. 将上述合成的金种子溶液冷却至70 °C。
    2. 在玻璃小瓶中，将154.8 mg柠檬酸钠粉末溶于10 mL去离子水中，配制10 mL 60 mM柠檬酸钠溶液。
    3. 以2分钟的时间间隔，向金种子溶液中依次注入0.67 mL 25 mM HAuCl4溶液和0.67 mL 60 mM柠檬酸钠溶液。
    4. 重复步骤1.2.3，逐步增大金纳米颗粒尺寸至40 nm。
      注意：约需10次生长步骤达到40 nm。实际所需步数可能因具体实验条件而异。
  3. 使用自动合成仪进行金纳米颗粒的种子生长（图2）
    1. 将第1部分制备的25 mL金种子溶液转移至50 mL锥形离心管中，并在恒温混匀仪中冷却至70 °C。
      注意：使用热电偶温度计监测恒温混匀仪内部温度，将温度计置于装有25 mL水的50 mL离心管中进行测量。
    2. 用2.5 mL 25 mM HAuCl4溶液填充一支3 mL鲁尔锁一次性注射器。另取一支3 mL鲁尔锁一次性注射器，用2.5 mL 60 mM柠檬酸钠溶液填充。
    3. 将注射器安装至注射泵上，使用鲁尔接头转MicroTight接头将PEEK管（内径150 µm）连接至注射器，并将管路插入恒温混匀仪中装有金种子溶液的离心管内。
    4. 设置两台注射泵，在20分钟内分别匀速释放0.1675 mL溶液（即8.357 μL/分钟）。
    5. 将恒温混匀仪的转速设为700 rpm，按下装有25 mM HAuCl4溶液的注射泵上的启动按钮。
    6. 2分钟后，按下装有60 mM柠檬酸钠溶液的注射泵上的启动按钮。
    7. 在开始注入HAuCl4溶液30分钟后，取出一份金纳米颗粒溶液样品用于分析。
    8. 重复步骤1.3.5–1.3.7，逐步将金纳米颗粒直径增大至40 nm。
      注意：通过增加步骤1.3.4中添加的反应物体积，该装置可在单步中将金纳米颗粒生长至40 nm。可通过延长分配时间但保持相同注入速率来实现。

2. 金纳米颗粒的表征

  1. 紫外-可见光谱法
    1. 将1 mL金纳米颗粒（Au NP）溶液加入半微量石英比色皿中。
    2. 打开光谱仪。
    3. 设置波长范围为400 - 800 nm。
    4. 采集每个样品的紫外-可见吸收光谱。
  2. 动态光散射（DLS）
    1. 使用0.22 μm滤膜将样品溶液过滤至塑料半微量比色皿中。
    2. 开启DLS仪器。
    3. 设置温度为25 °C，并平衡60秒。
    4. 测量每个样品的流体动力学粒径。
  3. 透射电子显微镜（TEM）
    1. 取5 μL样品溶液滴加到表面碳支持膜覆盖的300目铜网上，空气中自然干燥。
      注意：对于浓度较高的金纳米颗粒溶液样品，需进行稀释，以获得在TEM载网上分散良好的金纳米颗粒。
    2. 使用透射电子显微镜在200 kV加速电压下，采集每个样品的多张TEM图像。
    3. 使用ImageJ软件测量每个样品中200个金纳米颗粒的直径，计算平均粒径及标准偏差。

3. CB7-UA 复合物的形成

  1. 0.4 mM CB7 溶液的制备
    1. 将 4.65 mg CB7 加入一个 15 mL 玻璃小瓶中。
      注意：CB7 的用量是基于文献中普遍采用的 CB7 分子量（= 1163 Da）计算得出。然而，CB7 固体样品通常含有来自合成与纯化步骤残留的水、HCl、甲醇及其他盐类，约占样品总重的 10–20%，属于无效质量。这些包埋的溶剂和盐类无法通过真空烘箱加热或其他方法完全去除，其含量在不同批次样品中有所差异，但可通过元素分析进行定量。不过，本实验方案对 CB7 样品中未定量的溶剂和盐类的存在不敏感。
    2. 向小瓶中加入 10 mL 水，并拧紧瓶盖。
    3. 在室温下超声处理样品，直至 CB7 固体完全溶解。
      注意：CB7 的合成方法依据文献27进行，但也可直接购买获得。
  2. 0.4 mM UA 溶液的制备
    1. 将 2.69 mg UA 加入一个 50 mL 离心管中。
    2. 向管中加入 40 mL 水，并拧紧管盖。
    3. 使用恒温混匀仪，设置温度为 70 °C、转速为 800 rpm、时间 2 h，使样品溶液旋转混匀，随后让溶液自然冷却至室温。
      注意：UA 在水中的溶解度较低（0.40 mM）5。若 UA 粉末未完全溶解，可延长混匀时间。也可采用超声处理促进溶解。
  3. 0.4 mM UA 溶液的逐级稀释
    1. 在 15 mL 玻璃小瓶中，将 5 mL 0.4 mM UA 溶液与 5 mL 水混合，得到 10 mL 0.2 mM UA 溶液。拧紧瓶盖后超声处理 30 秒。
    2. 按照表 1 所述，使用适当体积的 UA 溶液和水，重复步骤 3.3.1。
  4. CB7-UA 复合物的制备
    1. 在 1.5 mL 离心管中加入 0.75 mL 0.4 mM CB7 溶液和 0.75 mL 0.4 mM UA 溶液。盖紧管盖后超声处理 30 秒。
    2. 静置 30 分钟，以确保主客体复合物充分形成。
    3. 使用不同浓度的 UA 溶液，重复步骤 3.4.1–3.4.2。

4. 尿酸的表面增强拉曼散射（SERS）检测

  1. 拉曼系统的实验装置（图3）
    1. 打开633 nm的He-Ne激光器（22.5 mW）。
    2. 打开模块化拉曼光谱仪。
    3. 打开计算机并启动软件。
    4. 点击光谱应用向导图标，然后选择拉曼。
    5. 开始新的采集。将积分时间设为30 s，扫描平均次数设为5次，移动平均（boxcar）设为0。
    6. 保存背景光谱，并输入激光波长（即633 nm）。
      注：积分时间是指每次扫描的时间，扫描平均次数是指用于生成每条光谱的扫描次数平均值，移动平均（boxcar）是指进行平均的相邻像素数量28。
  2. SERS基底的制备
    1. 将0.9 mL的40 nm金纳米粒子（Au NP）溶液和0.1 mL预先形成的CB7-UA复合物溶液加入1.5 mL离心管中。盖紧管盖，并超声处理，直至溶液颜色由红宝石红色变为紫色。
      注：也可使用市售的柠檬酸盐稳定的40 nm Au NP溶液。通常通过浓缩原液稀释，将局域表面等离子体共振（LSPR）峰的光密度调整至1。样品中的柠檬酸盐浓度通常保持在2 mM。
    2. 将样品溶液转移至半微量比色皿中。将比色皿放入拉曼样品架，并盖上盖子。
    3. 开始测量。
    4. 设置自动保存，连续记录五条SERS光谱。
    5. 停止测量并更换样品。
    6. 使用不同浓度的CB7-UA溶液重复步骤4.2.1–4.2.5。
      注：由于纳米聚集体中UA浓度不同，导致空CB7的浓度存在差异，而空CB7在介导Au NP聚集过程中起主要作用，因此聚集时间也有所不同，范围从0.1 μM UA时的30 s到20 μM UA时的30 min。对于CB7-UA复合物，其一个通道被体积较大的UA分子占据而被封闭，无法与Au NP表面结合，因此不能介导纳米粒子的聚集21。当溶液颜色由红宝石红色变为紫色时，样品即可用于测量。

5. 数据分析

  1. 数据处理
    1. 将基于非对称最小二乘法（ALS）的插件下载并安装到 Origin 软件中。
      注意：ALS 插件需要 OriginPro 版本。
    2. 将原始数据导入 Origin。
    3. 计算每个样品五组表面增强拉曼光谱（SERS）的平均值。将该平均值除以激光功率（例如 22.5 mW）和积分时间（例如 30 s）。
    4. 点击 ALS 图标以打开对话框。将非对称因子设为 0.001，阈值设为 0.03 %，平滑因子设为 2，迭代次数设为 20，以校正每条平均光谱的基线。
    5. 使用按 y 偏移堆叠的线形图绘制不同尿酸（UA）浓度的 SERS 光谱。输出结果应为强度（counts s-1 mW-1）相对于拉曼位移（cm-1）的图谱。

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结果

在本研究的金纳米颗粒（Au NP）合成过程中，紫外-可见光谱显示，经过10次生长步骤后，局域表面等离子体共振（LSPR）峰从521 nm红移至529 nm（图4A,B）；同时，动态光散射（DLS）数据表明，随着金纳米颗粒尺寸从25.9 nm增大至42.8 nm，其尺寸分布保持狭窄（图4C,D）。根据透射电子显微镜（TEM）图像测量得到的G0、G5和G10代颗粒的平均尺寸分别为20.1 ± 2.1 nm、32.5 ± 2.3 nm和40.0 ± 2.2 nm（每种情况下统计了200个颗粒）（图4E）。这些结果表明，该实验方案能够有效合成尺寸均一、分散性良好的金纳米颗粒。

在本研究的表面增强拉曼散射（SERS）实验中，CB7与UA形成了主客体复合物，空的CB7介导了金纳米颗粒：CB7纳米聚集体内部精确等离激元纳米间隙的形成，SERS谱图中UA...

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讨论

本方案中描述的自动合成方法可重复性地制备尺寸逐渐增大的金纳米颗粒（Au NPs）。尽管仍有一些步骤需要手动完成，例如在种子合成过程中快速加入柠檬酸钠，以及定期检查以确保聚醚醚酮（PEEK）管路固定牢固，但该方法使得大尺寸金纳米颗粒（最大可达40 nm）的合成成为可能。这类大尺寸颗粒通常需要多次手动注入HAuCl4和柠檬酸钠，而本方法则可通过长时间连续加料实现合成。

可进一步表征以阐明CB复合物的基本性质。例如，通常可采用1H核磁共振（NMR）确认主客体复合物的形成，若发生复合，谱图中应出现信号的化学位移上移及峰展宽21,22,25。然而，由于尿酸（UA）缺乏不可交换的质子，1H NMR不适用于UA的检测。可采用其他技术如13C NMR...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

TCL 感谢英国皇家学会研究资助 2016 R1（RG150551）以及由英国工程与物理科学研究委员会（EPSRC）机构资助奖（EP/P511262/1）资助的伦敦大学学院（UCL）BEAMS 未来领袖奖的支持。WIKC、TCL 和 IPP 感谢由新加坡科技研究局-伦敦大学学院研究实习项目通过 EPSRC M3S 博士培训中心（EP/L015862/1）资助的学生奖学金。GD 和 TJ 感谢 EPSRC M3S 博士培训中心（EP/L015862/1）对其学生奖学金的资助。TJ 和 TCL 感谢 Camtech Innovations 对 TJ 学生奖学金的资助。所有作者均感谢伦敦大学学院开放获取基金的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
40 nm 金纳米颗粒NanoComposixAUCN40-100MNanoXact，0.05 mg/mL，裸露（柠檬酸盐）
离心管Corning Falcon14-432-2250 mL 容量
葫芦[7]脲实验室自制参见参考文献19
三水合氯金酸Sigma Aldrich520918≥99.9% 痕量金属基准
鲁尔锁一次性注射器Cole-ParmerWZ-07945-153 mL 容量
鲁尔接头转 MicroTight 适配器LuerTightP-662外径 360 μm 的管路转鲁尔注射器
PEEK 管路IDEX1572外径 360 μm，内径 150 μm
PEEK 管路切割器IDEXWZ-02013-30适用于外径 360 µm 至 1/32" 的毛细管聚合物色谱管路切割器
拉曼光谱仪Ocean OpticsQE pro
二水合柠檬酸三钠Sigma AldrichS4641ACS 试剂，≥99.0%
超声仪
标准探头Digi-SenseWZ-08516-55K 型
注射泵AladdinALADDIN2-220双注射器，最大注射器容量 60 mL
热电偶温度计Digi-SenseWZ-20250-91单输入热电偶温度计，具备 NIST 可追溯校准
ThermoMixerEppendorf5382000031配备适用于 50 mL 管的 Eppendorf SmartBlock
尿酸Sigma AldrichU2625≥99%，结晶状

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