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方法文章

在猫科大型动物模型中进行人胚胎干细胞来源视网膜组织的视网膜下移植

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DOI：

10.3791/61683

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2021年8月5日

 ,  ,  ,  ,  , 
1College of Veterinary Medicine, Department of Small Animal Clinical Sciences, Michigan State University, 2Lineage Cell Therapeutics, Inc.

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种将人多能干细胞（hPSC）来源的视网膜组织移植到大型动物模型视网膜下腔的外科手术技术。

摘要

与感光细胞丧失相关的视网膜变性（RD）疾病，如年龄相关性黄斑变性（AMD）、视网膜色素变性（RP）和莱伯先天性黑蒙（LCA），会导致进行性且严重的视力丧失。目前尚缺乏在感光细胞丢失后恢复视力的有效疗法。将人多能干细胞（hPSC）来源的视网膜组织（类器官）移植到晚期RD患者眼球的视网膜下腔，可提供包含数千个健康且无突变感光细胞的视网膜组织片层，有望通过一项获批的方案治疗大多数或全部与感光细胞变性相关的致盲性疾病。将胎儿视网膜组织移植至动物模型及晚期RD患者视网膜下腔的技术已成功建立，但由于伦理问题和组织供应有限，无法作为常规治疗方法广泛应用。大型眼遗传性视网膜变性（IRD）动物模型对于开发利用先进外科技术将视网膜细胞/组织移植至视网膜下腔的视力恢复疗法具有重要价值。由于其眼球大小、感光细胞分布（例如具有类似黄斑的中央区 area centralis）与人类相近，且存在能高度模拟人类IRD的动物模型，因此有助于加速有前景的治疗方法向临床转化。本文介绍了一种将hPSC来源的视网膜组织移植至大型动物模型视网膜下腔的外科手术技术，可用于在动物模型中评估这一有前景的治疗策略。

引言

全球数百万人受到视网膜变性（RD）的影响，导致视力障碍或失明，其主要原因是感光光感受器（PRs）的丧失。年龄相关性黄斑变性（AMD）是导致失明的主要原因之一，由遗传风险因素与环境/生活方式因素共同作用引起。此外，已发现超过200个基因和位点可导致遗传性视网膜变性（IRD）1。视网膜色素变性（RP）是最常见的遗传性视网膜变性，具有显著的遗传异质性，目前已报道约70个基因中存在3000多种基因突变2,3,4。莱伯先天性黑蒙（LCA）是一种导致儿童期失明的疾病，同样具有高度的遗传异质性5,6。基因增强疗法已被开发，并正在针对少数遗传性视网膜变性疾病的临床试验中进行评估3,7。然而，每种不同遗传类型的IRD都需要开发独立的治疗方法，因此仅能治疗一小部分患者。此外，基因增强疗法依赖于存在可挽救的光感受器细胞群体，因此不适用于晚期变性患者。

因此，迫切需要开发针对和治疗晚期视网膜退行性疾病（RDs）以及重度至终末期失明的疗法，而这一临床需求目前尚未得到满足。在过去20年中，神经假体植入物已在大型动物模型（如猫）中进行了开发和测试，随后才用于人体8,9,10,11,12,13,14。同样，在过去20年中，利用胚胎期甚至成熟哺乳动物视网膜片层进行视网膜下移植的视网膜替代疗法也已得到发展15,16,17,18,19,20,21,22，并在RD患者中成功进行了试验23,24,25。这两种方法均基于将新的感光元件引入光感受器（PRs）已退化的视网膜中，其中神经假体设备使用的是光伏硅光电二极管26,27，而视网膜片层移植则使用以片层形式组织的健康、无突变的光感受器。近期研究探索了基于干细胞的方法，例如移植人多能干细胞（hPSC）来源的视网膜前体细胞28,29、hPSC来源的光感受器30以及hPSC来源的视网膜类器官31,32,33。视网膜类器官能够在体外形成视网膜组织，并产生包含数千个无突变光感受器的光感受器片层，其结构类似于发育中的人类胎儿视网膜的光感受器层34,35,36,37,38,39,40。将hPSC来源的视网膜组织（类器官）移植到RD患者视网膜下腔，是当前多个研究团队正在推进的一种新型且有前景的探索性细胞治疗策略31,32,41,42。与移植细胞悬液（如未成熟光感受器或视网膜前体细胞）相比，临床试验已证明移植胎儿光感受器片层可带来视力改善23,24。

本文详细介绍了一种用于将整个视网膜类器官（而非仅类器官边缘33,41）移植至视网膜下腔的手术方案，该方法有望更有效地植入包含感光细胞（PRs）的完整视网膜片层，从而提高移植物存活率并改善片层结构的保存。尽管已有将扁平的人类视网膜组织片及视网膜色素上皮（RPE）补片植入的技术报道43,44,45，但对较大体积的三维移植物的移植尚未开展系统研究。干细胞来源的视网膜类器官为视觉恢复技术的发展提供了无限的感光细胞片层来源，不存在伦理限制，并被认为是在治疗晚期视网膜变性（RD）和终末期失明相关疗法中极具前景的人类视网膜组织来源46。开发可精确地将视网膜类器官植入视网膜下腔且对宿主视网膜微环境（包括神经视网膜、视网膜色素上皮以及视网膜和脉络膜血管系统）造成最小损伤的外科手术方法，是推动此类疗法走向临床应用的关键步骤之一31,32。大型动物模型，如猫、狗、猪和猴，已被证实是研究手术递送方法的良好模型，可用于评估植入组织片（如视网膜色素上皮（RPE）细胞）的安全性，并探索类器官的应用潜力41,44,45,47,48,49,50。这些大型动物的眼球大小与人类相近，解剖结构也相似，且存在一个感光细胞密度较高的区域，包含视锥细胞（即area centralis），类似于人类的黄斑区6,51,52。

本文描述了一种将人多能干细胞（hPSC）来源的视网膜组织（类器官）植入猫科大型动物模型（包括野生型和CrxRdy/+猫）视网膜下腔的技术，该技术结合已有的良好疗效结果32,53，为将此类探索性疗法进一步推进至临床应用以治疗视网膜变性（RD）疾病奠定了基础。

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方案

实验操作遵循视力与眼科学研究协会（ARVO）关于眼科与视觉研究中使用动物的声明。本研究还获得了密歇根州立大学机构动物护理与使用委员会的批准。研究使用了来自密歇根州立大学饲养的猫群中的野生型和CrxRdy/+杂合突变猫。动物饲养在12小时光照与12小时黑暗交替的环境中，并饲喂商业全价猫粮。

1. 植入前操作步骤及手术准备

  1. 根据研究设计选择野生型或CrxRdy/+猫。进行术前眼科检查，包括裂隙灯生物显微镜检查和间接检眼镜检查。排除任何与基因型无关的视网膜异常动物。
  2. 在植入前一周，开始给予动物口服环孢素（2 mg/kg）和泼尼松龙（1 mg/kg），每日两次，以帮助预防移植排斥反应。
  3. 对年龄超过4个月的动物进行过夜禁食（至少8小时）。对年龄小于4个月的动物，过夜提供少量湿粮，然后在手术前禁食2小时。
  4. 进行全身体格检查，包括使用听诊器进行胸部听诊。记录心率、呼吸频率、体温、黏膜颜色和毛细血管再充盈时间。
  5. 对年龄小于4个月的动物，术前30–45分钟皮下或肌肉注射布托啡诺（0.02 mg/kg）；对年龄超过4个月的动物，联合使用布托啡诺（0.02 mg/kg）和乙酰丙嗪（0.02 mg/kg）进行术前给药。
  6. 在眼球表面至少两次滴加1%托吡卡胺滴眼液和10%去氧肾上腺素滴眼液，以充分散大瞳孔。若瞳孔散大不充分，可重复给药。
  7. 在所有动物的头静脉处放置22 G静脉导管：首先剪除头静脉区域约2 × 3 cm范围的毛发；用70%乙醇擦拭皮肤，再用氯己定溶液擦洗；置入导管后用医用胶带固定，并用肝素化生理盐水冲洗。对于年龄小于4个月的动物，可在麻醉诱导后进行此操作。
  8. 在术前给药后30–45分钟诱导全身麻醉：年龄小于4个月的动物通过面罩吸入异氟烷进行诱导，年龄超过4个月的动物则通过静脉注射丙泊酚（4–6 mg/kg）进行诱导。
  9. 使用合适尺寸的气管插管进行插管。使用检查灯或喉镜观察喉部结构，向喉部喷洒0.1 mL的2%利多卡因，等待数秒后进行插管。
  10. 通过Bain系统以氧气（300–600 mL/kg/min）为载体，维持异氟烷浓度在2%–3.5%之间，以维持麻醉状态。
  11. 将动物仰卧于定位枕上，定位枕上铺有覆盖毛巾的加热水毯。连接动物监护仪，持续监测心率和心电图（ECG）、呼吸频率、血压、血氧饱和度及呼气末二氧化碳。在手术过程中定期监测体温。应由经过适当培训的人员负责麻醉的维持与监测。
  12. 借助定位枕调整动物体位，使眼球处于原在位时角膜表面保持水平。使用医用胶带固定头部位置。
  13. 用毯子覆盖动物身体，以帮助维持体温。
  14. 用肝素化生理盐水冲洗静脉导管，并在整个手术过程中以2–5 mL/kg/h的速度静脉输注乳酸林格液。
  15. 使用0.2%聚维酮碘、无菌棉签和棉球对眼球表面、结膜囊及眼睑进行无菌手术准备。
  16. 调整手术显微镜位置，并适当调节目镜。将显微镜脚踏控制器（用于聚焦、变焦和XY轴控制）以及玻璃体切除机的脚踏板放置于术者可操作的位置。
  17. 准备无菌手术：所有人员必须穿着手术服、戴手术帽和口罩。确保术者及助手按照常规无菌手术要求进行刷手、穿手术衣和戴手套。所有人员应熟悉无菌操作技术。
  18. 在人员完成刷手、穿手术衣和戴手套后，打开手术包并摆放器械。在显微镜调节旋钮上安装无菌操作手柄，以便术者或助手调节而不破坏无菌环境。按照常规方式为动物进行眼部手术铺巾。
  19. 根据制造商说明，准备用于双通道玻璃体切除术的玻璃体切除机。
    1. 将玻璃体切除接触镜 和23 G双通道玻璃体切除装置放置于助手操作台。连接湿场电凝装置。连接并预冲灌注管路和23 G玻璃体切除手柄。
    2. 将玻璃体切除器械和液体管路置于无菌铺巾上，并使用巾钳固定位置。将玻璃体切除机设置为比例负压模式，切割速度为每分钟1,500至2,500次（cpm），最大负压为500 mmHg。此操作通过按压玻璃体切除机前面板上的箭头按钮（向上或向下）完成。

2. 视网膜下移植类器官的制备（图1）

  1. 按照先前所述方法诱导视网膜类器官31，如需运输，可按先前报道的方法在37 °C条件下过夜运送54。
  2. 使用消毒剂擦拭接收实验室中组织培养室的台面，并保持与眼科手术室相同的无菌操作水平，以避免细菌或真菌污染，并防止带入手术室造成手术部位感染。
  3. 在指定用于类器官制备以进行眼科手术的组织培养室内，穿戴外科鞋套、一次性实验服、头罩、外科口罩、袖套和外科刷手服。
  4. 在组织培养孵育箱（37 °C，5% CO2）中，将神经培养基预先平衡1小时，添加20 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和20 ng/mL脑源性神经营养因子（BDNF）。将类器官转移至超低黏附培养板中，使用约四分之一体积的条件培养基（来自过夜运输）和四分之三体积的新鲜培养基31,54。维持培养24–48小时。
  5. 在麻醉第一只动物前，将数个新鲜的60 mm培养皿用神经培养基（如步骤2.4中所配制）在组织培养孵育箱（37 °C，5% CO2）中预平衡至少1小时。注意：这些培养皿用于每次手术时转移类器官，假设培养基中的pH条件和CO2饱和度可维持至少20分钟，足以将培养皿转移至手术室并将类器官装入导管中。
  6. 每例移植手术均使用一个新的含有预饱和神经培养基的60 mm培养皿，其余培养皿则保留在37 °C组织培养孵育箱中。
  7. 使用手动单通道移液器（20–200 µL）配合带有宽口（~0.7 mm）的200 µL无菌滤芯吸头，将6–9个类器官转移至一个60 mm培养皿（含再饱和培养基）中。这些吸头可提前或在操作过程中使用无菌剪刀剪去吸头尖端约3–4 mm制备（需在组织培养生物安全柜内操作以避免污染）。将60 mm培养皿放入100 mm组织培养皿中（以避免在房间间转运时污染），并迅速转移至手术室。
  8. 将含有类器官的培养皿置于覆盖无菌布巾的37 °C电加热垫上。
  9. 在准备类器官前，更换一副新的无菌手套。
  10. 用无菌平衡盐溶液（BSS）冲洗类器官（可选），然后将其装入注射装置中。该装置由一根薄壁硼硅酸盐玻璃导管（外径OD 1.52 mm，内径ID 1.12 mm）组成，导管末端经抛光呈钝头，通过无菌塑料管连接至一支预先充满无菌BSS的无菌500 µL Hamilton注射器。
  11. 当手术团队准备注射类器官时，以无菌方式将导管传递给手术团队。
  12. 整个操作过程（从将类器官移出组织培养基到装入导管）应控制在20分钟或更短时间内完成。
  13. 若类器官植入出现延迟，应将其放回组织培养孵育箱中，以避免培养皿内pH/CO2饱和度发生变化。
  14. 未使用的类器官可在相同的组织培养孵育箱中保留1周，并监测是否有任何污染迹象。

3. 视网膜下类器官移植

  1. 使用Stevens斜视剪进行0.5–1 cm的外眦切开术。放置适当大小的Barraquer眼睑拉钩以保持眼睑张开。确保手术助手在整个手术过程中定期用BSS冲洗角膜。
  2. 在角膜缘4点和8点位置附近的结膜上立即放置两根6–0丝线固定缝线，以使眼球保持原位凝视并牵拉第三眼睑。使用0.5 Castroviejo角膜打结钳和小型蚊式止血钳轻轻夹住角膜缘旁的球结膜。保留较长的缝线末端，并用小型蚊式止血钳夹住末端以便操作。
    注意：将缝线置于第三眼睑下方较为困难；务必将其放置在紧邻角膜缘的位置。
  3. 在12点位置的角膜缘处放置另一根缝线，部分穿透角膜缘厚度，注意不要穿入眼球内部。将此缝线松松打结并剪短线尾。该缝线作为坚固的锚定缝线，在手术中用作“把手”，以便旋转眼球，使术者在不同手术阶段能够接触眼球的不同部位。
    注意：步骤3.2和3.3的顺序可互换。固定缝线的放置顺序由术者自行决定。
  4. 将球结膜在10点至2点之间（象限范围）反射。使用斜视剪在距离角膜缘2–3 mm处切开结膜，分离下方组织并清除Tenon囊，以暴露计划在2点和10点位置建立玻璃体切除通道处的巩膜，这些通道距离角膜缘约3–5 mm，具体距离取决于动物年龄。使用外科纤维素尖头棉签进行止血并清除血液。
  5. 在反射结膜和Tenon囊后，使用卡尺确定巩膜切开部位。选择巩膜切口位置（位于2点和10点，目标为通过睫状体平坦部），以避开猫眼中可能较明显的巩膜主要血管。在计划的巩膜切口处使用湿场电凝以减少巩膜出血，并计划在器械通道（右利手术者的10点通道）处预留约3 mm区域，该区域将在玻璃体切除术后扩大，以便引入植入导管。
  6. 在放置玻璃体切除通道前，预先在计划的巩膜切口处放置十字交叉缝线（6-0或7-0聚乳酸羟基乙酸共聚物缝线），但暂不打结。
    注意：这有助于在手术结束时快速闭合巩膜切口。计划用于器械通道的缝线需取较宽的巩膜咬合，因为此处将形成较长的切口。
  7. 缝线放置完成后，请助手通过牵拉12点位置的固定缝线（打结或使用Bishop-Harmon钳）协助定位眼球。术者也应使用0.12 mm Castroviejo钳夹住巩膜切口附近的组织以稳定眼球。
    1. 使用套管针经巩膜在2点和10点位置分别插入23 G玻璃体切除通道，方向朝向视神经，以避免接触晶状体。
    2. 通过用打结钳轻轻推动通道口，检查灌注通道是否位于玻璃体内，以便在玻璃体中观察到其尖端。确认位置正确后，将灌注管连接至通道，并使用细胶带将管道固定到位。通过按压玻璃体切除机前面板上的箭头按钮（向上或向下），将BSS缓冲液的灌注压力初始设定为30–35 mmHg。
  8. 让助手将Machemer放大灌注式玻璃体切除镜压在角膜上，以便在后续步骤中观察眼后段。将灌注式玻璃体切除镜连接至输液装置，提供持续液体供应，使镜片与角膜耦合。
    注意：也可使用其他类型的接触式玻璃体切除镜。调暗或关闭室内灯光，有助于通过手术显微镜进行观察。
  9. 将23 G玻璃体切除探头/切割器（2,500 cpm）经器械通道（靠近术者主用手一侧，即右利手术者的10点通道）插入，并进行部分核心玻璃体切除。
    1. 随后，通过分离玻璃体前界膜与视网膜，完全清除计划移植区域视网膜表面的玻璃体（这对手术成功至关重要）。
    2. 将玻璃体切除探头置于视盘上方，使开口背向视网膜表面，并施加较高负压，开始分离玻璃体前界膜。
  10. 准备用于眼内使用的曲安奈德晶体。如果曲安奈德混悬液并非专为玻璃体内使用设计，则需清洗晶体后重新悬浮于BSS中。
    1. 首先，在无菌条件下使用带有PES膜的0.22 µm孔径注射器滤器（连接至1 mL注射器）过滤混悬液，以截留晶体。
    2. 然后通过在1 mL注射器中吸入BSS并冲洗滤器来清洗截留的曲安奈德晶体（晶体仍保留在滤器中），以去除溶液中的防腐剂。重复清洗三次后，将晶体重新悬浮于1 mL BSS中。
  11. 将装有曲安奈德的注射器针头经器械通道插入。插入时通过瞳孔观察针尖位置，注意避免触碰晶状体。注入0.25至0.5 mL晶体混悬液。随后将玻璃体切除探头经同一通道插入，推进至视盘附近，开口背向视网膜表面，使用高负压辅助分离玻璃体前界膜与视网膜。
    注意：曲安奈德晶体会附着于残留玻璃体，从而使其显影。应仔细清除计划器官样体植入部位上方及周围的任何残留玻璃体（例如，靠近area centralis区域的中央带状部眼底）。
  12. 使用视网膜下注射器（例如，连接至装有无菌BSS的250 µL气密Luer锁注射器的可伸展41 G导管的23 G视网膜下注射器）在目标植入部位创建一个小的局灶性视网膜脱离隆起。
    1. 在创建视网膜下隆起前，将灌注压力降低至10 mmHg，以利于隆起形成。
    2. 将注射器经器械通道插入并推进至视网膜表面。推出导管尖端并轻压于视网膜表面。请助手快速轻推注射器活塞以启动视网膜脱离，随后减小注射压力，缓慢增加视网膜脱离范围，直至达到所需大小（约使用100至200 µL BSS）。
  13. 若所创建的视网膜切口位置合适（避免在植入部位与视盘之间切割视网膜，以防切断源自植入区的神经纤维层，并避开主要视网膜血管——这也由研究设计决定，在本例中选择中央视网膜），则可使用注射器的41 G导管略微扩大切口，以便于引入视网膜剪。
  14. 从眼内取出注射器，并移除10点位置的巩膜通道。使用直型2.85 mm裂口刀/角膜刀沿朝向视神经的方向扩大该处巩膜切口，以避免接触晶状体。保持灌注压力在10–15 mmHg。
  15. 使用玻璃体视网膜垂直80°剪（带挤压手柄）扩大视网膜切口，注意避免切割视网膜血管以防出血，并确保在远离视盘的隆起边缘处切割视网膜，以避免切断从移植区域通向视神经的神经纤维。视网膜切口应足够宽，以容纳器官样体。
  16. 将预装有器官样体的玻璃毛细管（见步骤2.10）经扩大的巩膜切口插入，并在直视下推进至视网膜切口部位。
    1. 使用玻璃毛细管尖端轻微打开视网膜切口，以进入视网膜下隆起腔隙。
    2. 请助手在显微镜下观察的同时缓慢推动注射器活塞，将器官样体注入视网膜下隆起内。BSS应先于器官样体注入，以冲开视网膜切口。
    3. 若器官样体位于视网膜切口边缘，可用玻璃毛细管尖端轻轻将其推入隆起内。
  17. 将玻璃毛细管在视网膜切口处停留数秒，尝试闭合切口，防止器官样体逸入玻璃体腔。
  18. 极其缓慢地将玻璃毛细管从眼内抽出，避免眼内液体突然释放，防止眼内液流将器官样体冲出视网膜下隆起。
  19. 缓慢将灌注压力升至20–30 mmHg，以帮助预防眼内出血，同时注意灌注液不要直接冲刷隆起区域。此操作通过按压玻璃体切除机前面板上的向上箭头按钮完成。
  20. 使用预先放置的十字交叉缝线（6–0或7–0聚乳酸羟基乙酸共聚物）闭合巩膜切口。根据需要添加额外的间断缝线以密封切口。
  21. 请助手移除灌注通道，术者迅速打结预先放置的缝线，以密封巩膜切口并防止眼内压丢失。
  22. 使用6–0或7–0聚乳酸羟基乙酸共聚物缝线以连续简单缝合方式闭合结膜切口（环切口）。
  23. 对眼底进行成像（例如，使用RetCam II视频眼底相机、Clarity或类似设备），记录器官样体在视网膜下空间的即时位置。
  24. 成像后，使用0.2%聚维酮碘溶液配合棉签和棉球重新消毒 ocular 表面。移除三根固定缝线及眼睑拉钩。
  25. 使用6-0聚乳酸羟基乙酸共聚物缝线闭合外眦切口。先放置一根埋藏缝线，随后采用8字皮肤缝线重建外眦，再使用间断皮肤缝线闭合其余伤口。
  26. 手术完成后，给予结膜下注射类固醇与抗生素混合制剂（2 mg醋酸甲泼尼龙、0.1 mg地塞米松和1 mg庆大霉素）。在角膜上涂抹眼科润滑剂（人工泪液）。
  27. 使动物从麻醉中恢复，并在恢复期间密切监测是否有疼痛迹象（如明显眼睑痉挛、严重抗拒操作、嗜睡或食欲减退、呼吸和心率增快），必要时给予额外治疗。根据需要提供术后镇痛，并密切观察是否出现不适。
    注意：术前、术中及术后对猫患者的麻醉和监测工作必须由经过适当培训的人员负责。术后护理应遵循当地动物伦理委员会的建议。

4. 植入后操作、术后处理及评估

  1. 继续使用口服免疫抑制药物（泼尼松龙 1 mg/kg 和环孢素 2 mg/kg，每日两次口服），以帮助控制炎症并防止类器官被排斥。提供全身性抗生素覆盖（例如多西环素 5 mg/kg，每日两次口服——选择该抗生素是因为免疫抑制动物存在机会性支原体感染的风险）。
  2. 定期进行眼科检查，以监测炎症或不良事件的发生。观察视网膜隆起是否变平，尽管手术中为将类器官注入视网膜下腔需做大范围视网膜切开，但术后数天内视网膜隆起仍会逐渐变平。每次检查时记录眼底图像，以记录移植类器官的位置和形态。
  3. 在监测期间及实验结束前，在全身麻醉下通过共聚焦扫描激光检眼镜（cSLO）和谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）5,31 对动物进行成像。
  4. 实验结束时，采用美国兽医医学协会（AVMA）批准的方法人道处死动物，例如静脉注射戊巴比妥 85 mg/kg。在镇静后放置静脉导管以给予戊巴比妥，从而减少动物应激。通过心跳停止确认死亡，并切开胸腔以造成气胸。
  5. 通过标准的经结膜途径摘除眼球，并根据需要进行固定。对于免疫组织化学（IHC），在用11号Parker刀片经平坦部做三个切口（距角膜缘约3-4 mm）后，向眼后段注入0.3 mL固定液，随后立即把眼球浸入4%多聚甲醛溶液中固定。
  6. 在4 °C条件下固定3.5小时后解剖眼球杯，小心去除残留的玻璃体，同时确保视网膜和类器官保持完整。将眼球杯重新放入固定液中，在4 °C下再固定30分钟，然后用PBS冲洗3次，每次10分钟。将眼球杯转移至15%蔗糖溶液中2小时，再转移至30%蔗糖溶液中继续处理2小时。
  7. 用PBS冲洗眼球杯两次，随后将其包埋于OCT包埋介质（最佳切割温度化合物）中，速冻后于-80 °C保存，直至进行组织学和免疫组织化学切片。
  8. 根据研究方案和目标选择用于免疫组织化学（IHC）的抗体。

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结果

该方法可实现人多能干细胞（hPSC）来源的视网膜类器官在大眼动物模型视网膜下腔的成功且可重复的移植（本研究以两种模型为例：具有健康光感受器（PRs）的野生型猫和 CrxRdy/+ 视网膜感光细胞（PRs）退化的猫及视网膜退化模型）。按照下述步骤进行操作 图1 将人多能干细胞（hPSC）来源的视网膜类器官制备并装载至注射装置的硼硅酸盐玻璃套管中，确保类器官不受损伤。可通过在装载类器官期间（步骤2.10）以及手术过程中（步骤3.16）直接观察来确认图2A，B以及手术结束时通过眼底成像（步骤 3.23， 图 2C）。通过术后眼科检查和眼底成像可确认使用该技术将类器官成功植入视网膜下腔。图3A），可记录类器官的位置和外观。在对眼球进行冷冻组织学和免疫组织化学处理时，了解移植位置极为重要，这能显著减少工作量，因为对较大的...

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讨论

将人多能干细胞（hPSC）来源的视网膜组织（视网膜类器官）植入视网膜下腔，是一种有望恢复因光感受器细胞（PR细胞）死亡导致晚期视网膜变性疾病的患者视力（深度或终末期失明）的实验性方法。本研究所提出的方法基于先前已开发并成功验证的实验疗法，即通过视网膜下移植人胎儿视网膜组织片段实现治疗23,24,25。该方法采用一种替代性的、可再生且符合伦理要求的视网膜组织来源——由hPSC衍生而来。为推动这一有前景的方法向临床应用转化，需在大眼动物模型中验证其手术可行性与眼部安全性51,55。本文提供了一种详细的在大型动物模型（包括正常视网膜及变性视网膜，即CrxRdy/+猫的LCA模型）中进行hPSC来源三维视网膜组织（视网膜类器官）视网膜下植入的方法。尽管已有将扁平的人视网膜组织片或RPE补...

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披露

Ratnesh K. Singh博士、Francois Binette博士和Igor O. Nasonkin博士是Lineage Cell Therapeutics, Inc.的员工。作者声明不存在利益冲突。

致谢

本工作由NEI快速通道SBIR资助项目R44-EY027654-01A1 以及SBIR资助项目3 R44 EY 027654 - 02 S1（I.O.N.，Lineage Cell Therapeutics；Petersen-Jones博士为共同项目负责人）资助。作者感谢Janice Querubin女士（MSU RATTS）在本研究涉及动物的麻醉与日常护理方面提供的帮助，以及在手术环境准备和器械准备/灭菌方面的协助。作者感谢Paige Winkler博士在移植前一天协助获取类器官并将其放入培养基，以及在移植当天提供的帮助。作者还感谢Randy Garchar先生（LCTX）在视网膜类器官的仔细运输、运输容器组装，以及每次运输后下载温度和G应力记录方面的努力。本工作在作者Igor Nasonkin受雇于 Biotime（现为Lineage）期间完成。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.22 µm 孔径注射器滤器，PES 膜CameoNA可通过多种供应商获得
23G 玻璃体下注射器，带可伸缩 41G 套管DORC1270.EXT
250 µL 汉密尔顿气密式鲁尔锁注射器HamiltonNA可通过多种供应商获得
6-0 丝线缝合线Ethicon707G
6-0/7-0 聚乳酸羟基乙酸缝合线EthiconJ570G
马来酸乙酰丙嗪 500 mg/5 mL（Aceproject）Henry Schein Animal HealthNA可通过多种供应商获得
丁丙诺啡 0.3 mg/mLPar PharmaceuticalNA可通过多种供应商获得
cSLO + SD-OCTHeidelberg EngineeringSpectralis HRA+ OCT
环孢素NovartisNA可通过多种供应商获得
地塞米松 2 mg/mL（Azium）VetoneNA可通过多种供应商获得
多西环素 25 mg/5 mLCiplaNA可通过多种供应商获得
Fatal Plus 溶液（戊巴比妥溶液）VortechNA可通过多种供应商获得
庆大霉素 20 mg/2 mLHospiraNA可通过多种供应商获得
玻璃毛细管（薄壁单管标准硼硅酸盐（Schott Duran）玻璃管）World Precision InstrumentsTW150-4
醋酸甲泼尼龙 40 mg/mLPfizerNA可通过多种供应商获得
显微镜ZeissNA
OCT 包埋介质（Tissue-Tek O.C.T. Compound）Sakura4583
Olympic Vac-Pac 23 号NatusNA可通过多种供应商获得
16% 多聚甲醛溶液EMS15719
盐酸去氧肾上腺素 10% 眼用溶液AkornNA可通过多种供应商获得
泼尼松龙 15 mg/5 mLAkornNA可通过多种供应商获得
丙泊酚 500 mg/50 mL（10 mg/mL）（PropoFlo28）ZoetisNA可通过多种供应商获得
RetCam II 视网膜视频相机Clarity Medical SystemsNA可通过多种供应商获得
曲安奈德 400 mg/10 mL（Kenalog-40）Bristol -Myers Squibb CompanyNA可通过多种供应商获得
托吡卡胺 1% 眼用溶液AkornNA可通过多种供应商获得
23G 玻切手术端口AlconAccurus systems
玻璃体切除机AlconAccurus systems
玻璃体视网膜垂直 80° 剪刀，带挤压手柄FrimenFT170206T

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