在猫科大型动物模型中进行人胚胎干细胞来源视网膜组织的视网膜下移植

摘要

本文介绍了一种将人多能干细胞（hPSC）来源的视网膜组织移植到大型动物模型视网膜下腔的外科手术技术。

摘要

与感光细胞丧失相关的视网膜变性（RD）疾病，如年龄相关性黄斑变性（AMD）、视网膜色素变性（RP）和莱伯先天性黑蒙（LCA），会导致进行性且严重的视力丧失。目前尚缺乏在感光细胞丢失后恢复视力的有效疗法。将人多能干细胞（hPSC）来源的视网膜组织（类器官）移植到晚期RD患者眼球的视网膜下腔，可提供包含数千个健康且无突变感光细胞的视网膜组织片层，有望通过一项获批的方案治疗大多数或全部与感光细胞变性相关的致盲性疾病。将胎儿视网膜组织移植至动物模型及晚期RD患者视网膜下腔的技术已成功建立，但由于伦理问题和组织供应有限，无法作为常规治疗方法广泛应用。大型眼遗传性视网膜变性（IRD）动物模型对于开发利用先进外科技术将视网膜细胞/组织移植至视网膜下腔的视力恢复疗法具有重要价值。由于其眼球大小、感光细胞分布（例如具有类似黄斑的中央区 area centralis）与人类相近，且存在能高度模拟人类IRD的动物模型，因此有助于加速有前景的治疗方法向临床转化。本文介绍了一种将hPSC来源的视网膜组织移植至大型动物模型视网膜下腔的外科手术技术，可用于在动物模型中评估这一有前景的治疗策略。

引言

全球数百万人受到视网膜变性（RD）的影响，导致视力障碍或失明，其主要原因是感光光感受器（PRs）的丧失。年龄相关性黄斑变性（AMD）是导致失明的主要原因之一，由遗传风险因素与环境/生活方式因素共同作用引起。此外，已发现超过200个基因和位点可导致遗传性视网膜变性（IRD）¹。视网膜色素变性（RP）是最常见的遗传性视网膜变性，具有显著的遗传异质性，目前已报道约70个基因中存在3000多种基因突变^2,3,4。莱伯先天性黑蒙（LCA）是一种导致儿童期失明的疾病，同样具有高度的遗传异质性^5,6。基因增强疗法已被开发，并正在针对少数遗传性视网膜变性疾病的临床试验中进行评估^3,7。然而，每种不同遗传类型的IRD都需要开发独立的治疗方法，因此仅能治疗一小部分患者。此外，基因增强疗法依赖于存在可挽救的光感受器细胞群体，因此不适用于晚期变性患者。

因此，迫切需要开发针对和治疗晚期视网膜退行性疾病（RDs）以及重度至终末期失明的疗法....

方案

实验操作遵循视力与眼科学研究协会（ARVO）关于眼科与视觉研究中使用动物的声明。本研究还获得了密歇根州立大学机构动物护理与使用委员会的批准。研究使用了来自密歇根州立大学饲养的猫群中的野生型和Crx^Rdy/+杂合突变猫。动物饲养在12小时光照与12小时黑暗交替的环境中，并饲喂商业全价猫粮。

1. 植入前操作步骤及手术准备

1. 根据研究设计选择野生型或Crx^Rdy/+猫。进行术前眼科检查，包括裂隙灯生物显微镜检查和间接检眼镜检查。排除任何与基因型无关的视网膜异常动物。
2. 在植入前一周，开始给予动物口服环孢素（2 mg/kg）和泼尼松龙（1 mg/kg），每日两次，以帮助预防移植排斥反应。
3. 对年龄超过4个月的动物进行过夜禁食（至少8小时）。对年龄小于4个月的动物，过夜提供少量湿粮，然后在手术前禁食2小时。
4. 进行全身体格检查，包括使用听诊器进行胸部听诊。记录心率、呼吸频率、体温、黏膜颜色和毛细血管再充盈时间。
5. 对年龄小于4个月的动物，术前30–45分钟皮下或肌肉注射布托啡诺（0.02 mg/kg）；对年龄超过4个月的动物，联合使用布托啡诺（0.02 mg/kg）和乙酰丙嗪（0.02 mg/kg）进行术前给药。
6. 在眼球表面至少两次滴加1%托吡卡胺滴眼液和1....

结果

该方法可实现人多能干细胞（hPSC）来源的视网膜类器官在大眼动物模型视网膜下腔的成功且可重复的移植（本研究以两种模型为例：具有健康光感受器（PRs）的野生型猫和 Crx^Rdy/+ 视网膜感光细胞（PRs）退化的猫及视网膜退化模型）。按照下述步骤进行操作 图1 将人多能干细胞（hPSC）来源的视网膜类器官制备并装载至注射装置的硼硅酸盐玻璃套管中，确保类器官不受损伤。可通过在装载类器官期间（步骤2.10）及手术过程中（步骤3.16）直接观察来确认图2A，B以及手术结束时通过眼底成像（步骤 3.23， 图2C）。通过术后眼科检查和眼底成像可确认使用该技术将类器官植入视网膜下腔的情况。图3A），用于记录类器官的位置和形态。了解移植位置在对眼球进行冷冻组织学和免疫组织化学处理时极为重要，可显著减少工作量，因为以12–14.......

讨论

将人多能干细胞（hPSC）来源的视网膜组织（视网膜类器官）植入视网膜下腔，是一种有望恢复因光感受器细胞（PR细胞）死亡导致晚期视网膜变性疾病的患者视力（深度或终末期失明）的实验性方法。本研究所提出的方法基于先前已开发并成功验证的实验疗法，即通过视网膜下移植人胎儿视网膜组织片段实现治疗^23,24,25。该方法采用一种替代性的、可再生且符合伦理要求的视网膜组织来源——由hPSC衍生而来。为推动这一有前景的方法向临床应用转化，需在大眼动物模型中验证其手术可行性与眼部安全性^51,55。本文提供了一种详细的在大型动物模型（包括正常视网膜及变性视网膜，即Crx^Rdy/+猫的LCA模型）中进行hPSC来源三维视网膜组织（视网膜类器官）视网膜下植入的方法。尽管已有将扁平的人视网膜组织片或RPE补.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.22 µm 孔径注射器滤器，PES 膜	Cameo	NA	可通过多种供应商获得
23G 玻璃体下注射器，带可伸缩 41G 套管	DORC	1270.EXT
250 µL 汉密尔顿气密式鲁尔锁注射器	Hamilton	NA	可通过多种供应商获得
6-0 丝线缝合线	Ethicon	707G
6-0/7-0 聚乳酸羟基乙酸缝合线	Ethicon	J570G
马来酸乙酰丙嗪 500 mg/5 mL（Aceproject）	Henry Schein Animal Health	NA	可通过多种供应商获得
丁丙诺啡 0.3 mg/mL	Par Pharmaceutical	NA	可通过多种供应商获得
cSLO + SD-OCT	Heidelberg Engineering	Spectralis HRA+ OCT
环孢素	Novartis	NA	可通过多种供应商获得
地塞米松 2 mg/mL（Azium）	Vetone	NA	可通过多种供应商获得
多西环素 25 mg/5 mL	Cipla	NA	可通过多种供应商获得
Fatal Plus 溶液（戊巴比妥溶液）	Vortech	NA	可通过多种供应商获得
庆大霉素 20 mg/2 mL	Hospira	NA	可通过多种供应商获得
玻璃毛细管（薄壁单管标准硼硅酸盐（Schott Duran）玻璃管）	World Precision Instruments	TW150-4
醋酸甲泼尼龙 40 mg/mL	Pfizer	NA	可通过多种供应商获得
显微镜	Zeiss	NA
OCT 包埋介质（Tissue-Tek O.C.T. Compound）	Sakura	4583
Olympic Vac-Pac 23 号	Natus	NA	可通过多种供应商获得
16% 多聚甲醛溶液	EMS	15719
盐酸去氧肾上腺素 10% 眼用溶液	Akorn	NA	可通过多种供应商获得
泼尼松龙 15 mg/5 mL	Akorn	NA	可通过多种供应商获得
丙泊酚 500 mg/50 mL（10 mg/mL）（PropoFlo28）	Zoetis	NA	可通过多种供应商获得
RetCam II 视网膜视频相机	Clarity Medical Systems	NA	可通过多种供应商获得
曲安奈德 400 mg/10 mL（Kenalog-40）	Bristol -Myers Squibb Company	NA	可通过多种供应商获得
托吡卡胺 1% 眼用溶液	Akorn	NA	可通过多种供应商获得
23G 玻切手术端口	Alcon	Accurus systems
玻璃体切除机	Alcon	Accurus systems
玻璃体视网膜垂直 80° 剪刀，带挤压手柄	Frimen	FT170206T