从小鼠附睾脂肪组织中分离脂肪前体细胞

摘要

我们介绍一种简单的方法，利用荧光激活细胞分选技术从小鼠附睾脂肪垫中分离出高活力的脂肪前体细胞。

摘要

肥胖以及糖尿病、心脏病和癌症等代谢性疾病均与显著的脂肪组织重塑相关。组织驻留的脂肪前体细胞（APCs）在脂肪组织稳态中发挥关键作用，并可能参与组织病理过程。单细胞分析技术（包括单细胞RNA测序和单细胞蛋白质组学）的日益广泛应用，正在深刻改变干细胞/前体细胞研究领域，使研究人员能够在群体或组织整体变化背景下，以前所未有的分辨率解析单个细胞的表达变化。本文提供了详细的操作方案，用于解剖小鼠附睾脂肪组织、分离来源于脂肪组织的单个细胞，并通过荧光激活细胞分选（FACS）富集具有活力的 Sca1⁺/CD31^-/CD45^-/Ter119^- APCs。这些方案将帮助研究人员制备高质量的APCs，适用于单细胞RNA测序等后续分析。

引言

脂肪组织在能量代谢中起着关键作用。多余的能量以脂质形式储存，脂肪组织能够根据营养状况和能量需求发生显著的扩张或收缩。脂肪组织的扩张可源于脂肪细胞体积的增加（肥大）和/或脂肪细胞数量的增加（增生）；后者过程受到脂肪组织前体细胞增殖与分化的严格调控^1,2。在肥胖状态下，脂肪组织过度扩张，并常伴随组织功能障碍——包括缺氧、炎症和胰岛素抵抗——的发生^3,4。这些并发症是多种慢性疾病的风险因素，包括高血压、糖尿病、心血管疾病、中风和癌症⁵。因此，限制脂肪组织的不受控扩张并减轻其病理变化是当前生物医学研究的重点方向。在脂肪组织扩张过程中，组织驻留的脂肪源性干细胞（ASCs）依次增殖并分化为前脂肪细胞（定向前体细胞），进而形成成熟脂肪细胞⁶。近期的单细胞RNA测序（scRNA-seq）研究表明，这些脂肪前体细胞（APC）群体（包括ASCs和前脂肪细胞）在分子特征和功能上具有显著的异质性^7,8,9,

方案

所有动物实验操作均经梅奥诊所机构动物护理和使用委员会批准后进行。

1. 溶液配制

1. 通过将 2 g 胶原酶 II 溶解于 100 mL 汉克斯平衡盐溶液（HBSS）中，制备 2%（w/v）胶原酶溶液。每次使用时分装 200 µL。
2. 通过混合 84 mL F-12 培养基、15 mL 马血清和 1 mL 青霉素/链霉素，制备中和培养基。
3. 通过将 500 mg 牛血清白蛋白（BSA）和 400 µL 0.5 M EDTA 溶解于 100 mL 杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）中，制备流式细胞术缓冲液。

2. 附睾脂肪垫的解剖与组织解离

1. 以人道方式处死（使用异氟烷/颈椎脱位法）一只雄性小鼠。本方案中使用了一只四月龄的 FVB 小鼠。
2. 用干净的剪刀和镊子将 70% 乙醇涂抹或喷洒于腹部，并暴露下腹部腔体。
3. 定位附睾脂肪垫（靠近睾丸/与睾丸相连）。用钝头镊子夹住睾丸与附睾脂肪垫之间的连接处，轻轻拉拽以分离附睾脂肪垫。
4. 用剪刀剪除睾丸，并将附睾脂肪垫放入含 3% BSA 的 5 mL HBSS 中，置于 50 mL 锥形管内，室温孵育 15 分钟。
5. 在 4 °C 条件下以 150 x ....

结果

本实验使用4月龄雄性FVB小鼠。通过FSC/SSC图排除碎片和双联体后，对活细胞（DAPI^-群体）设门，随后选择APC⁺/FITC^-群体（图1）。DAPI、APC和FITC的设门依据未染色对照样本确定。设门策略如图1所示。

分选1小时后，通过流式细胞术分析对分离质量进行定量评估（图2,3）。细胞使用碘化丙啶溶液（1:100）染色以进行活率检测。采用与分选相同的设门策略，细胞保持较高的活率和纯度：单细胞比例为92.6 ± 2.2%（图2中第三张图），活细胞（PI^-细胞）比例为86.4 ± 3.0%，APC⁺/FITC^-细胞比例为86.0 ± 2.8%（n = 4，平均值 ± 标准差）。这些百分比分别定义为各设门群体（单细胞、PI^-

讨论

单细胞RNA测序（scRNA-seq）正迅速成为一种强大的工具，可用于在单细胞水平上同时研究多种细胞群体。由于样本制备和高通量测序成本较高，优化细胞投入量（高活力和高纯度）对于提高实验成功率至关重要。一些细胞制备方案依赖低速离心洗涤和基于柱的分离方法去除死细胞和碎片，而无需使用FACS分选¹⁴。然而，这些方法中的许多会显著减少可回收的活细胞数量，并且在很多情况下无法完全去除死细胞¹⁴。本方案介绍了一种简单的方法，用于分离高活力的Sca1⁺脂肪前体细胞，其中细胞碎片、双细胞和死细胞含量极低。尽管使用本方案分离的细胞表现出高活力，我们仍建议尽量缩短细胞分离与后续下游分析之间的时间，以维持细胞的高活力。此外，成功的抗体标记对于高纯度地分离Sca1⁺脂肪前体细胞至关重要。因此，强烈建议针对每种抗体确定其最佳浓度，并可根据需要相应调整步骤3.2中抗体的稀释比例。

该基于流式细胞术的实验方案可根据研究者对特定脂肪祖细胞亚群的兴趣进行定制。此处可采用不同的抗.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.7 mL 微量离心管	VWR	87003-294
13 mL 培养管	Thermo Fisher Scientific	50-809-216
15 mL 圆锥形离心管	Greiner Bio-one	188 271
带细胞筛网 snap cap 的 5 mL 试管	Thermo Fisher Scientific	08-771-23
50 mL 圆锥形离心管	Greiner Bio-one	227 261
70 µm 细胞筛网	Thermo Fisher Scientific	22-363-548
抗 CD31-FITC 抗体	Miltenyi Biotec	130-102-519
抗 CD45-FITC 抗体	Miltenyi Biotec	130-102-491
抗 Sca1-APC 抗体	Miltenyi Biotec	130-102-833
抗 Ter119-FITC 抗体	Miltenyi Biotec	130-112-908
BSA	Gold Biotechnology	A-420-500
II 型胶原酶	Thermo Fisher Scientific	17101-015
DAPI	Thermo Fisher	D1306
杜氏磷酸盐缓冲液 (DPBS)	Thermo Fisher Scientific	14190-144
F-12 培养基	Thermo Fisher Scientific	11765-054
FcR 封闭试剂	Miltenyi Biotec	130-092-575
汉克斯平衡盐溶液 (HBSS)	Thermo Fisher Scientific	14025-092
马血清	Thermo Fisher Scientific	16050-122
青霉素-链霉素	Thermo Fisher Scientific	15140-122
碘化丙啶溶液	Miltenyi Biotec	130-093-233