我们介绍一种简单的方法，利用荧光激活细胞分选技术从小鼠附睾脂肪垫中分离出高活力的脂肪前体细胞。
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本文内容
摘要
摘要
肥胖以及糖尿病、心脏病和癌症等代谢性疾病均与显著的脂肪组织重塑相关。组织驻留的脂肪前体细胞（APCs）在脂肪组织稳态中发挥关键作用，并可能参与组织病理过程。单细胞分析技术（包括单细胞RNA测序和单细胞蛋白质组学）的日益广泛应用，正在深刻改变干细胞/前体细胞研究领域，使研究人员能够在群体或组织整体变化背景下，以前所未有的分辨率解析单个细胞的表达变化。本文提供了详细的操作方案，用于解剖小鼠附睾脂肪组织、分离来源于脂肪组织的单个细胞，并通过荧光激活细胞分选（FACS）富集具有活力的 Sca1+/CD31-/CD45-/Ter119- APCs。这些方案将帮助研究人员制备高质量的APCs，适用于单细胞RNA测序等后续分析。
引言
脂肪组织在能量代谢中起着关键作用。多余的能量以脂质形式储存，脂肪组织能够根据营养状况和能量需求发生显著的扩张或收缩。脂肪组织的扩张可源于脂肪细胞体积的增加（肥大）和/或脂肪细胞数量的增加（增生）；后者过程受到脂肪组织前体细胞增殖与分化的严格调控1,2。在肥胖状态下，脂肪组织过度扩张，并常伴随组织功能障碍——包括缺氧、炎症和胰岛素抵抗——的发生3,4。这些并发症是多种慢性疾病的风险因素，包括高血压、糖尿病、心血管疾病、中风和癌症5。因此，限制脂肪组织的不受控扩张并减轻其病理变化是当前生物医学研究的重点方向。在脂肪组织扩张过程中，组织驻留的脂肪源性干细胞（ASCs）依次增殖并分化为前脂肪细胞（定向前体细胞），进而形成成熟脂肪细胞6。近期的单细胞RNA测序（scRNA-seq）研究表明，这些脂肪前体细胞（APC）群体（包括ASCs和前脂肪细胞）在分子特征和功能上具有显著的异质性7,8,9,10,11,12。例如，与前脂肪细胞相比，ASCs表现出较低的脂肪生成分化能力，但具有更高的增殖和扩增潜能7。在ASC和前脂肪细胞群体内部还报道了进一步的分子差异，尽管这些差异的功能意义尚不明确7。综上，这些数据凸显了脂肪前体细胞库的复杂性，并强调了开发和标准化研究工具的必要性，以更深入地理解并调控这些关键细胞群体。
本方案详细描述了从小鼠附睾脂肪垫中分离高活力Sca1+脂肪前体细胞群体的方法，所获细胞适用于多种敏感的下游分析，包括单细胞研究（单细胞RNA测序）和细胞培养。附睾脂肪垫的分离与解离操作参照先前报道的方法7,13，并进行了轻微修改，以提高分离所得脂肪前体细胞（APC）的活力。简言之，将来自附睾脂肪垫的解离细胞用针对Sca1的抗体进行染色，Sca1是脂肪基质细胞（ASCs）和前脂肪细胞的标志物6,7；同时使用其他谱系（Lin）标志物抗体染色：Ter119（红系细胞）、CD31（内皮细胞）和CD45（白细胞）。随后通过荧光激活细胞分选（FACS）技术分选出活的Sca1+/Ter119-/CD31-/CD45-/DAPI-细胞。重要的是，本方案已在近期一项单细胞RNA测序研究中得到验证，该研究成功分离并分析了具有活力的Sca1+/Lin-脂肪前体细胞，鉴定了脂肪基质细胞和前脂肪细胞内功能异质性的亚群7。
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方案
所有动物实验操作均经梅奥诊所机构动物护理和使用委员会批准后进行。
1. 溶液配制
- 通过将 2 g 胶原酶 II 溶解于 100 mL 汉克斯平衡盐溶液（HBSS）中，制备 2%（w/v）胶原酶溶液。每次使用时分装 200 µL。
- 通过混合 84 mL F-12 培养基、15 mL 马血清和 1 mL 青霉素/链霉素，制备中和培养基。
- 通过将 500 mg 牛血清白蛋白（BSA）和 400 µL 0.5 M EDTA 溶解于 100 mL 杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）中，制备流式细胞术缓冲液。
2. 附睾脂肪垫的解剖与组织解离
- 以人道方式处死（使用异氟烷/颈椎脱位法）一只雄性小鼠。本方案中使用了一只四月龄的 FVB 小鼠。
- 用干净的剪刀和镊子将 70% 乙醇涂抹或喷洒于腹部，并暴露下腹部腔体。
- 定位附睾脂肪垫（靠近睾丸/与睾丸相连）。用钝头镊子夹住睾丸与附睾脂肪垫之间的连接处，轻轻拉拽以分离附睾脂肪垫。
- 用剪刀剪除睾丸，并将附睾脂肪垫放入含 3% BSA 的 5 mL HBSS 中，置于 50 mL 锥形管内，室温孵育 15 分钟。
- 在 4 °C 条件下以 150 x g 离心 7 分钟。
- 从 50 mL 锥形管中取出漂浮的附睾脂肪垫，用干净的剪刀将其精细剪碎。
- 在 13 mL 培养管中，将 200 µL 胶原酶 2% 溶液加入 3.8 mL HBSS 中。加入剪碎的组织，在 37 °C 旋转孵育器中以 5 rpm 转速孵育 1 小时。若无旋转孵育器，也可使用 37 °C 细胞培养箱，期间偶尔震荡代替。
- 将全部内容物转移至 50 mL 锥形管中，加入 10 mL 中和培养基。通过反复倒置试管 2–3 次轻柔混匀。
- 准备另一个装有 70 µm 细胞滤器的 50 mL 锥形管。将消化后的组织经细胞滤器过滤至新管中。
- 将滤过液转移至 15 mL 锥形管中，在 4 °C 条件下以 350 x g 离心 10 分钟。
- 小心吸除上清液，用 5 mL DPBS 重悬细胞沉淀。在 4 °C 条件下以 350 x g 离心 10 分钟。
- 小心吸除上清液，加入 50 µL 流式细胞术缓冲液。通过轻柔吹打充分混匀，并将细胞置于冰上保存。由于细胞沉淀体积及残留上清液量较小，最终细胞在流式缓冲液中的总体积将大于 50 µL（约 100 µL）。
3. 抗体标记与荧光激活细胞分选（FACS）
- 轻轻吹打混匀细胞后，取54 µL细胞悬液转移至1.7 mL微量离心管中，加入6 µL FcR封闭试剂，再轻轻吹打混匀，4 °C孵育10分钟。在取走54 µL细胞后，将剩余细胞保存于冰上，用于步骤3.5和步骤3.6中的未染色对照。
- 在步骤3.1孵育期间，于微量离心管中将抗Sca1-APC、抗Ter119-FITC、抗CD31-FITC和抗CD45-FITC抗体各取11 µL混合，配制抗体混合液。轻轻吹打混匀后置于冰上避光保存。
- 经FcR封闭试剂孵育10分钟后，加入40 µL抗体混合液，轻轻吹打混匀，4 °C继续孵育10分钟。
- 向染色后的细胞中加入500 µL流式细胞术缓冲液，其中添加1 µg/mL DAPI。轻轻吹打混匀后，使用带细胞滤网卡扣盖的5 mL试管过滤细胞，将细胞置于冰上保存。
- 向步骤3.1中剩余的细胞加入500 µL流式细胞术缓冲液，轻轻吹打混匀。使用带细胞滤网卡扣盖的5 mL试管过滤细胞，将这些细胞置于冰上保存，并在下一步中作为未染色对照使用。
- 将染色后的细胞和未染色对照细胞送至流式细胞分选（FACS）分析或分选仪器进行检测。
- 根据图1所示的设门策略，鉴定并分离APC+/FITC-/DAPI-细胞群体。该群体代表活的Sca1+/Ter119-/CD31-/CD45-细胞。利用前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）图排除碎片和细胞聚集体。随后设门选择DAPI-细胞群体，再进一步设门选择APC+/FITC-细胞群体。应使用未染色对照辅助设定设门参数。
- 将细胞收集至含有500 µL流式细胞术缓冲液的1.5 mL微量离心管中。后续所有操作均需在无菌条件下进行，以避免污染。每只小鼠可收集约50,000 – 100,000个细胞。
- 使用血细胞计数板对细胞进行计数以评估细胞活力。由于细胞聚集体可能干扰后续分析，还需评估其存在情况，确保聚集体数量极少（<活细胞总数的5%）。
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结果
本实验使用4月龄雄性FVB小鼠。通过FSC/SSC图排除碎片和双联体后，对活细胞（DAPI-群体）设门，随后选择APC+/FITC-群体（图1）。DAPI、APC和FITC的设门依据未染色对照样本确定。设门策略如图1所示。
分选1小时后，通过流式细胞术分析对分离质量进行定量评估（图2,3）。细胞使用碘化丙啶溶液（1:100）染色以进行活率检测。采用与分选相同的设门策略，细胞保持较高的活率和纯度：单细胞比例为92.6 ± 2.2%（图2中第三张图），活细胞（PI-细胞）比例为86.4 ± 3.0%，APC+/FITC-细胞比例为86.0 ± 2.8%（n = 4，平均值 ± 标准差）。这些百分比分别定义为各设门群体（单细胞、PI-
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讨论
单细胞RNA测序（scRNA-seq）正迅速成为一种强大的工具，可用于在单细胞水平上同时研究多种细胞群体。由于样本制备和高通量测序成本较高，优化细胞投入量（高活力和高纯度）对于提高实验成功率至关重要。一些细胞制备方案依赖低速离心洗涤和基于柱的分离方法去除死细胞和碎片，而无需使用FACS分选14。然而，这些方法中的许多会显著减少可回收的活细胞数量，并且在很多情况下无法完全去除死细胞14。本方案介绍了一种简单的方法，用于分离高活力的Sca1+脂肪前体细胞，其中细胞碎片、双细胞和死细胞含量极低。尽管使用本方案分离的细胞表现出高活力，我们仍建议尽量缩短细胞分离与后续下游分析之间的时间，以维持细胞的高活力。此外，成功的抗体标记对于高纯度地分离Sca1+脂肪前体细胞至关重要。因此，强烈建议针对每种抗体确定其最佳浓度，并可根据需要相应调整步骤3.2中抗体的稀释比例。
该基于流式细胞术的实验方案可根据研究者对特定脂肪祖细胞亚群的兴趣进行定制。此处可采用不同的抗...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢梅奥诊所显微镜细胞分析核心流式细胞术平台在FACS分选方面的协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.7 mL 微量离心管 | VWR | 87003-294 | |
| 13 mL 培养管 | Thermo Fisher Scientific | 50-809-216 | |
| 15 mL 圆锥形离心管 | Greiner Bio-one | 188 271 | |
| 带细胞筛网 snap cap 的 5 mL 试管 | Thermo Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| 50 mL 圆锥形离心管 | Greiner Bio-one | 227 261 | |
| 70 µm 细胞筛网 | Thermo Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 抗 CD31-FITC 抗体 | Miltenyi Biotec | 130-102-519 | |
| 抗 CD45-FITC 抗体 | Miltenyi Biotec | 130-102-491 | |
| 抗 Sca1-APC 抗体 | Miltenyi Biotec | 130-102-833 | |
| 抗 Ter119-FITC 抗体 | Miltenyi Biotec | 130-112-908 | |
| BSA | Gold Biotechnology | A-420-500 | |
| II 型胶原酶 | Thermo Fisher Scientific | 17101-015 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| 杜氏磷酸盐缓冲液 (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | |
| F-12 培养基 | Thermo Fisher Scientific | 11765-054 | |
| FcR 封闭试剂 | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| 汉克斯平衡盐溶液 (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| 马血清 | Thermo Fisher Scientific | 16050-122 | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| 碘化丙啶溶液 | Miltenyi Biotec | 130-093-233 |
参考文献
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重印与许可
