本方案描述了一种从健康人类供体尿液中分离尿液细胞外囊泡（uEVs）的方法，并通过流式细胞术检测其大小和表面标志物表达，对uEVs进行表型表征。
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本文内容
摘要
摘要
细胞外囊泡（EVs）是由任何细胞类型在尿液等体液中分泌的具有异质性的脂质膜复合物。这些囊泡的大小各异，直径范围从外泌体的40-100 nm到微囊泡的100-1000 nm。它们还可携带多种分子，这些分子可作为多种疾病预后和诊断的生物标志物。目前已有多种技术用于表征这些囊泡，其中之一是流式细胞术。然而，尚无现有报道阐明如何在检测生物标志物的同时，对EVs的浓度进行定量并按大小进行区分。本研究旨在描述一种利用常规流式细胞仪（无需对其配置进行任何修改）对尿液来源的细胞外囊泡（uEVs）进行分离、定量和表型分析的操作流程。该方法的局限性包括每份样本最多只能标记四种不同的生物标志物，且受限于样本中EVs的数量。尽管存在这些局限性，通过本方案及其后续分析，我们能够获得更多关于肾脏和脑损伤相关疾病中尿液样本内EVs标志物富集程度及其囊泡丰度的信息。
引言
在哺乳动物中，血液会循环通过肾脏250至300次以进行过滤，在此过程中形成尿液。这种生物液体的生成是一系列过程的结果，包括肾小球滤过、肾小管重吸收和分泌。尿液的主要成分为代谢废物和电解质。此外，其他副产物如肽类、功能蛋白以及细胞外囊泡（EVs）也会被排出1,2,3,4,5,6。最初，尿液中的细胞外囊泡（uEVs）是在患有水平衡障碍患者的尿样中被发现的。这些患者体内存在如水通道蛋白-2（AQP2）等分子，该蛋白随后被用作此类疾病的生物标志物7。随后多项研究聚焦于确定uEVs的细胞来源，指出这些结构可由肾脏细胞（如肾小球、足细胞等）以及其他内皮或白细胞谱系的细胞分泌。此外，uEVs的数量及其富集的分子可能与多种疾病和病理状态相关8,9,10,11
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方案
人尿液样本取自已签署知情同意书的健康志愿者。上述操作均经墨西哥国家医学与营养科学研究所Salvador Zubirán研究伦理委员会批准。
1. 尿液细胞外囊泡的分离
注意：尿液细胞外囊泡（uEVs）的分离方案修改自参考文献19。图1展示了uEVs分离流程的示意图。
图1：尿液细胞外囊泡（uEVs）分离用于流式细胞术分析的总体流程。 本方案中，首先离心晨尿以去除细胞和碎片；然后进行离心并结合处理以去除THP蛋白，从而去除大囊泡；最后通过超速离心并进行一次洗涤，富集并获得uEVs。图中标注了用于WB验证的尿液组分保留步骤。
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结果
在整个实验流程中存在多个检查点，且均在对尿液细胞外囊泡（uEVs）染色之前。因此，首先必须验证uEVs提取物中所含的蛋白质量。所有从事细胞外囊泡研究的科研团队均会对蛋白进行定量，具体操作如步骤2.1所述。补充图2展示了一块典型的96孔板，其中4E、5E和6E孔含有uEVs组分。1A、2A和3A孔为空白对照，但如果未纯化到uEVs，则这些孔的颜色将与样品孔相近。
此步骤之后，需要验证uEVs的存在。补充图3展示了一块聚丙烯酰胺凝胶的代表性结果，该凝胶经考马斯亮蓝染色，用于显示所有收集组分中的蛋白质含量，并与其他分离uEVs的方法进行比较。在两种不同的还原剂——二硫苏糖醇（DTT）和β-巯基乙醇中，后者表现出更高的蛋白质得率。
另一个重要步骤是使用MISEV2018推荐的任一方法验证uEVs的存在。补充图4展示了在uEVs以及用作阴性对照的收集组分中，CD63和CD9等多种蛋白质富集的代表性结果。在uEVs组分中，未观察到这些蛋白.......
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讨论
如今，细胞外囊泡作为多种疾病的生物标志物的应用日益增多，尤其是那些可从尿液等非侵入性来源分离的囊泡5,21,22,23,24。已有研究证实，尿液细胞外囊泡（uEVs）的分离对于了解健康个体的生理状态，以及多种疾病患者的诊断和预后评估具有重要意义6,13,16,25,26,27。本实验方案展示了如何获取uEVs，并通过流式细胞.......
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披露
作者声明，本研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的财务或商业关系的情况下进行的。
致谢
本工作由墨西哥国家科学技术委员会（CONACyT，项目号 A3-S-36875）和墨西哥国立自治大学-DGAPA-PAPIIT 项目（项目号 IN213020 和 IA202318）的资助支持。NH-I 获得了墨西哥国家科学技术委员会（CONACyT）第 587790 号奖学金的支持。
作者感谢 Leopoldo Flores-Romo†、Vianney Ortiz-Navarrete、Antony Boucard Jr 和 Diana Gómez-Martin 为本方案的实施提供的宝贵建议，并感谢所有健康个体提供的尿液样本。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| APC 抗人 CD156c（ADAM10）抗体 | BioLegend | 352706 | 加入5 µL 到 20 µPBS 中的 uEVs 升数 |
| APC抗人TSPAN33（BAAM）抗体 | BioLegend | 395406 | 加入5 µL 至 20 µPBS 中的 uEVs 升数 |
| Avanti 离心机配备 JA-25.5O 固定角转子 | Beckman Coulter | J-26S XPI | |
| BD Accuri C6 流式细胞仪 | BD 生物科学 | ||
| β-巯基乙醇 | SIGMA-Aldrich | M3148 | |
| 台式离心机配备 A-4-44 转子 | Eppendorf | 5804 | |
| BLUEstain 2 蛋白 Marker | GOLDBIO | P008 | |
| CD9 (C-4) 小鼠单克隆抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-13118 | |
| CD63（MX-49.129.5）小鼠单克隆抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-5275 | |
| 流式细胞术细胞增殖示踪CFSE试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | C34554 | |
| Chemidoc XRS+ 系统 | 伯乐（BIORAD） | 5837 | |
| FITC 抗人 CD9 抗体 | BioLegend | 312104 | 加入5 µL 到 20 µPBS 中的 uEVs 升数 |
| FITC 抗人 CD37 抗体 | BioLegend | 356304 | 加入5 µL 到 20 µPBS 中的 uEVs 升（L） |
| 荧光黄色颗粒 | Spherotech | FP-0252-2 | |
| 荧光黄色颗粒 | Spherotech | FP-0552-2 | |
| 荧光黄色颗粒 | Spherotech | FP-1552-2 | |
| FlowJo 软件 | Becton, Dickinson and Company | ||
| 山羊抗小鼠免疫球蛋白/HRP | Dako | P0447 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物停止液 | 赛默飞世尔科技 | 78429 | |
| Immun-Blot PVDF 膜 0.22µm | BIORAD | 1620177 | |
| Megamix-Plus FSC 微球 | COSMO BIO CO.LTD | 7802 | |
| NuPAGE LDS 样品缓冲液 4X | 赛默飞世尔科技 | NP0007 | |
| Optima 超速离心机，配备 90Ti 固定角转子 355530 | 贝克曼库尔特 | XPN100 | |
| PageBlue 蛋白染色液 | 赛默飞世尔科技 | 24620 | |
| PE 抗人 CD53 抗体 | BioLegend | 325406 | 加入5 µL20 µPBS 中的 uEVs 升数 |
| Pierce BCA 蛋白检测试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | 23227 | |
| Pierce RIPA 裂解液 | 赛默飞世尔科技 | 89900 | |
| 聚碳酸酯厚壁离心管 | 贝克曼库尔特 | 355630 | |
| Spherotech 8峰校准微球（FL1-FL3） | BD Accuri | 653144 | |
| Spherotech 6峰校准微球（FL4） | BD Accuri | 653145 | |
| 蔗糖 | SIGMA-Aldrich | 59378 | |
| 三乙醇胺 | SIGMA-Aldrich | 90279 |
参考文献
- Decramer, S., et al. Urine in clinical proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 7 (10), 1850-1862 (2008).
- Nawaz, M., et al. The emerging role of extracellular vesicles as biomarkers for urogenital cancers. Nature Reviews Urology. 11
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