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方法文章

利用流式细胞术进行尿液细胞外囊泡的粒径测定与表型分析

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DOI：

10.3791/61695

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2021年4月23日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Red de Apoyo a la Investigación, Universidad Nacional Autónoma de México e Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán, 2Departamento de Biología Celular, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional

本文内容

摘要

本方案描述了一种从健康人类供体尿液中分离尿液细胞外囊泡（uEVs）的方法，并通过流式细胞术检测其大小和表面标志物表达，对uEVs进行表型表征。

摘要

细胞外囊泡（EVs）是由任何细胞类型在尿液等体液中分泌的具有异质性的脂质膜复合物。这些囊泡的大小各异，直径范围从外泌体的40-100 nm到微囊泡的100-1000 nm。它们还可携带多种分子，这些分子可作为多种疾病预后和诊断的生物标志物。目前已有多种技术用于表征这些囊泡，其中之一是流式细胞术。然而，尚无现有报道阐明如何在检测生物标志物的同时，对EVs的浓度进行定量并按大小进行区分。本研究旨在描述一种利用常规流式细胞仪（无需对其配置进行任何修改）对尿液来源的细胞外囊泡（uEVs）进行分离、定量和表型分析的操作流程。该方法的局限性包括每份样本最多只能标记四种不同的生物标志物，且受限于样本中EVs的数量。尽管存在这些局限性，通过本方案及其后续分析，我们能够获得更多关于肾脏和脑损伤相关疾病中尿液样本内EVs标志物富集程度及其囊泡丰度的信息。

引言

在哺乳动物中，血液会循环通过肾脏250至300次以进行过滤，在此过程中形成尿液。这种生物液体的生成是一系列过程的结果，包括肾小球滤过、肾小管重吸收和分泌。尿液的主要成分为代谢废物和电解质。此外，其他副产物如肽类、功能蛋白以及细胞外囊泡（EVs）也会被排出1,2,3,4,5,6。最初，尿液中的细胞外囊泡（uEVs）是在患有水平衡障碍患者的尿样中被发现的。这些患者体内存在如水通道蛋白-2（AQP2）等分子，该蛋白随后被用作此类疾病的生物标志物7。随后多项研究聚焦于确定uEVs的细胞来源，指出这些结构可由肾脏细胞（如肾小球、足细胞等）以及其他内皮或白细胞谱系的细胞分泌。此外，uEVs的数量及其富集的分子可能与多种疾病和病理状态相关8,9,10,11,12,13,14。

总体而言，细胞外囊泡（EVs）是一类由脂质双分子层包被、通过被动或主动机制释放到不同体液中的高度异质性颗粒。根据其来源，EVs 可分为起源于内体的外泌体或源自质膜的微囊泡/微颗粒。然而，这种分类标准仅在直接观察到颗粒生物发生过程时才适用。因此，该领域多位研究人员已提出采用其他非简单的分类标准，包括物理特性、生化特性和细胞来源等15,16,17。根据所分析分离物的性质，建议采用不同的分析技术对 EVs 进行表征。例如，针对富集得到的大颗粒 EVs（≥100 nm）或小颗粒 EVs（≤100 nm），分别建议采用流式细胞术或纳米颗粒追踪分析进行定量18。

如今，细胞外囊泡（EVs）作为多种疾病的生物标志物已受到广泛关注，因此研究人员正在探索不同的来源。其中最有前景的来源之一是尿液，因其易于获取且具有非侵入性。因此，本方案描述了一种通过差速离心法分离尿液细胞外囊泡（uEVs），并使用荧光染料标记抗体进行处理，继而利用常规的双激光四色流式细胞仪进行下游分析的实验流程。

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方案

人尿液样本取自已签署知情同意书的健康志愿者。上述操作均经墨西哥国家医学与营养科学研究所Salvador Zubirán研究伦理委员会批准。

1. 尿液细胞外囊泡的分离

注意：尿液细胞外囊泡（uEVs）的分离方案修改自参考文献19。图1展示了uEVs分离流程的示意图。

尿液离心工作流程；示意图显示用于细胞外囊泡分离的离心机设置。
图1：尿液细胞外囊泡（uEVs）分离用于流式细胞术分析的总体流程。 本方案中，首先离心晨尿以去除细胞和碎片；然后进行离心并结合处理以去除THP蛋白，从而去除大囊泡；最后通过超速离心并进行一次洗涤，富集并获得uEVs。图中标注了用于WB验证的尿液组分保留步骤。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 采集健康志愿者的晨尿（15 mL）。在 4 °C 条件下，以 3,000 x g 离心 10 分钟，以去除所有细胞和碎片。
    注意：优先使用新鲜尿液；若无法获取，则可使用在 -20 °C 下保存不超过 3 个月，或在 -70 °C 下保存不超过 6 个月的尿液。将尿液样本置于冰上解冻，并剧烈涡旋混匀。所有操作均需在冰上或 4 °C 下进行。如需进行 Western 印迹分析，可选步骤为：另取一管，分装 200 µL 晨尿至独立离心管中，标记为“全尿”，于 -20 °C 保存备用，用于检测细胞外囊泡标志物。
  2. 将步骤 1.1 中获得的上清液转移至新的 15 mL 圆锥形离心管中，在 4 °C 条件下以 10,000 x g 离心 45 分钟。将上清液转移至 8 mL 聚碳酸酯超速离心管中，并置于冰上保存。
    注意：可选步骤为，将步骤 1.1 中获得的上清液分装 200 µL 至另一标记为“去细胞尿液”的离心管中，用于 Western 印迹分析。
    1. 去除 Tamm-Horsfall 蛋白（THP）
      注意：THP 存在于尿液中，在肾病患者中含量较高。已有报道表明，THP 会降低尿源性细胞外囊泡（uEVs）的得率，因其可与 uEVs 结合。为去除该蛋白，需使用还原剂3,6。
      1. 通过将 250 mM 蔗糖与 10 mM 三乙醇胺混合，配制分离溶液，并将 pH 调整至 7.6。
      2. 将步骤 1.2 中获得的沉淀与 500 µL 分离溶液混合，然后加入 5 µL β-巯基乙醇。
      3. 将沉淀混合物在 37 °C 下孵育 10 分钟，每 2 分钟涡旋一次。加入 500 µL 分离溶液后，在 37 °C 条件下以 17,000 x g 离心 10 分钟。收集所得上清液（含还原态非聚集 THP 及 uEVs）。
  3. 将步骤 1.2 和 1.2.1.3 中保留的上清液合并至同一 8 mL 聚碳酸酯超速离心管中，使用超速离心机的固定角转子，在 4 °C 条件下以 160,000 x g 离心 70 分钟。
    注意：如需进行 Western 印迹分析，可选步骤为：取 200 µL 上述上清液，标记为“无囊泡上清液”并保存。该样本在检测细胞外囊泡标志物时可作为阴性对照。
  4. 弃去上清液。向 8 mL 聚碳酸酯管中加入预冷的 1x PBS，于 4 °C 条件下以 160,000 x g 离心 70 分钟。
    注意：切勿弃去沉淀，因其含有 uEVs。1x PBS 需经灭菌处理，并使用孔径至少为 0.22 µm 的注射器滤器过滤。
  5. 弃去上清液。将剩余上清液加入 8 mL 聚碳酸酯管中，在 4 °C 条件下以 160,000 x g 离心 70 分钟。
  6. 弃去上清液，向沉淀中加入 8 mL 预冷 PBS 以洗涤 uEVs。
  7. 弃去上清液。让沉淀干燥后，用 1 mL 预冷 PBS 重悬。保存于 -70 °C 直至使用。
    注意：若进行 Western 印迹分析，应将备用管中的沉淀用含蛋白酶抑制剂的 50 µL RIPA 缓冲液重悬，保存于 -20 °C 直至使用。

2. 尿液细胞外囊泡（uEVs）的染色

注意：在对尿液细胞外囊泡（uEVs）进行染色和分析之前，必须至少执行一项MISEV201818推荐的方法，以验证uEVs的正确分离；此处以蛋白质印迹分析为例。图2展示了一种典型的uEVs染色方案。

流式细胞术示意图，显示抗体标记和CFSE染色用于细胞分析；荧光图。
图 2：尿源性细胞外囊泡（uEVs）染色及在流式细胞仪中捕获的总体流程。（A）uEVs 染色示意图。取 500,000 个 uEVs，加入抗体混合后于 4 °C 孵育 12 小时。随后加入 CFSE，并于 37 °C 孵育 10 分钟。uEVs 内部含有 CFSE，而抗体则结合于抗原表面。使用 400 µL 冷 PBS 重悬样本，并以低流速在流式细胞仪中捕获 100 µL 样本。（B）分析策略。第一个散点图（SSC-H 对 FL-X）显示 uEVs 的阴性对照，接着是显示 uEVs 经 CFSE 染色的散点图，最后是 uEVs 抗体染色的直方图（黑色线），灰色线表示阴性对照。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 使用任何常规比色法蛋白质检测试剂盒（如 材料表 中所述）定量蛋白质含量，以计算uEVs的相对数量。将uEVs样品稀释至1:5，并按照试剂盒说明书中的操作步骤进行。
  2. 根据先前报道的公式20，1 µg/mL的uEVs蛋白浓度相当于800,000个uEVs/µL。确保在20 µL冰冻PBS中含有500,000个uEVs。
  3. 按照 表1 所示标记试管。
    注意：所用试管数量取决于使用的抗体种类；对于双激光/四色流式细胞仪，每管最多可使用4种抗体，因此仅能读取FL1、FL2、FL3和FL4通道的信号，尽管需要进行补偿调节。在这些操作中，使用1.5 mL微量离心管或5 mL圆底管用于流式细胞术。所需试管如 表1 所示。第4管和第5管包含本实验方案中所有待用抗体的混合物。第8管和第9管作为问题示例管提供，因此该组对照必须包含各管中实际使用的抗体组合。
试管 1.Megamix FSC beads
试管 2.PBS
试管 3.PBS 加 CFSE
试管 4.问题 1 所有抗体的 PBS 溶液
试管 5.问题 2 所有抗体的 PBS 溶液
试管 6.自发荧光对照未添加任何试剂的 uEVs，仅溶于 PBS 中。
试管 7.#uEVs含 CFSE 的 uEVs
试管 8.问题 1含 CD37 FITC、CD53 PE、ADAM10 APC 的 uEVs
试管 9.问题 2含 CD9 FITC、TSPAN33 APC 的 uEVs

表1：试管标记。 示例展示如何标记试管。前几支试管为所需的所有对照。含抗体-荧光染料的试管则根据染色方案而定。

  1. 向已标记的试管中加入含有 500,000 个 uEV 的 20 µL PBS。
  2. 按照表 1中所示加入已预先滴定的抗体。在 4 °C 下孵育过夜。
    注意：染色前建议将抗体在 4 °C 下以最高速度离心至少 5 分钟，以防止形成聚集体。此处使用的抗体是 uEV 中存在的蛋白质的示例，相关研究属于另一篇正在撰写的独立论文。
  3. 向 3 号试管中加入 0.4 µL 羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）[5 nM]。在 37 °C 下孵育 10 分钟。
    注意：CFSE 是一种用于染色样品中所有 EV 并在进行流式细胞术分析时区分背景噪声的染料。更多详细信息请参见讨论部分。
  4. 向所有试管中加入 400 µL 冰冷的 1x PBS。
  5. 将所有试管置于 4 °C 下保存。

3. 使用常规流式细胞仪获取尿液细胞外囊泡

注意：此处描述了流式细胞仪（见材料表）的使用说明。

  1. 使用6峰和8峰微球对流式细胞仪进行质量校准。
    注意：最后一个峰的%CV值必须低于6；此操作由流式细胞仪技术人员完成。
  2. 打开流式细胞仪软件。
    注意：软件打开后，将自动新建一个实验，显示一个包含96个样本模板的检测界面，运行参数设置区域，以及一个用于创建散点图或直方图的“空白”区域。
  3. 调整运行中软件界面上的参数：设定采集样本体积为100 µL，低速进样，FSC-H阈值设为10,000，SSC-H阈值设为2,000。
    注意：此处推荐的阈值仅为示例；实际阈值应根据所分析的样本进行设置。
  4. 按照表1所示，加载1号管（Megamix微球管），采集微球信号。在软件界面的“空白”区域，点击散点图选项创建两个散点图，对应图3中的A和B面板。
    注意：Megamix荧光微球（用于界定0.1、0.3、0.5和0.9 µm粒径并建立粒径模板的微球）可使用FL1（FITC）检测器进行分析。所有散点图和直方图均应以高度值（height）显示。尽可能记录更多事件数；工作表中的任何修改均不会改变原始数据。

流式细胞术图解；SSC-H 与 FITC/FSC-H，Megamix 设门，颗粒大小分布。
图 3：Megamix FSC 微球的散点图。 散点图由流式细胞仪软件生成；在流式细胞仪中，图像将非常相似。（A）生成的第一个散点图用于选择微球，避免背景噪声（SSC-H 与 FL1-H）。（B）通过前一设门选择生成的散点图，显示微球的不同尺寸（SSC-H 与 FSC-H）。请点击此处查看此图的放大版本。

  1. 在软件界面的“空白”区域，为每种使用的荧光染料创建点图和直方图；可参考补充图1中的算法示例。操作时，依次点击每种荧光染料对应的点图或直方图选项。
    注意：背景噪声始终存在，如图3A所示。FL1（x轴）0至1,000之间的所有点均位于所设门区之外。因此，必须使用所有对照管以获得准确结果。每次上样前，需反向冲洗鞘液并执行一次去堵塞循环。上样前应轻轻振荡每根试管。连续上样五根试管后，运行100 µL的1x PBS。
  2. 上样第2号和第5号试管，以设定阴性阈值。操作时，选择点图下方的矩形门图标，或直方图下方的线形门图标，并将其放置在无信号区域，从而获得与补充图1中所示相似的点图和直方图。
    注意：所有这些试管中，阳性区域的比例不得超过0.70%，因为荧光信号不应超过103（1,500）。若信号超出该范围，应稀释所用试剂。因此，在最终检测前对试剂进行滴定至关重要。
  3. 上样第6号试管（自发荧光对照管），以设定样本的阴性区域。操作时，选择点图下方的矩形门图标，或直方图下方的线形门图标，并将其放置在无信号区域。
  4. 依次上样后续试管（第7至第9号试管，见表1）。
  5. 保存实验。
    注意：本实验所用流式细胞仪软件中的保存实验命令，意指保存生成的数据。换句话说，流式细胞仪所采集的所有试管及其各自产生的数据均需保存。为此，必须点击保存实验按钮。
  6. 将数据导出为FSC文件格式。

4. 使用流式细胞仪软件分析数据。

注意：本节描述了材料表中所示流式细胞仪软件的使用说明。图4展示了用于创建尺寸门控的工作区步骤。

流式细胞术数据分析；软件界面；散点图和直方图；参数调整。
图4：开始数据分析所需的所有步骤的工作区界面。所有图像均通过工作区截图生成。（A）左侧为添加样本数据后生成的工作区界面，右侧为选择第1管FSC微球后生成的点图。（B,C）显示对坐标轴的修改，设置为SSC-H和FSC-H。（D-F）逐步展示对两个坐标轴的自定义设置。（G-I）显示不同尺寸微球的选择与生成过程。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 打开流式细胞仪软件。点击 添加样本 按钮，添加导出的 FCS 文件。
  2. 点击 Megamix 管，打开散点图 SSC-H（y 轴）对 FSC-H（x 轴）。通过点击 T 按钮（变换数据显示），然后点击 自定义轴，选择 SSC-H 或 FSSC-H，将坐标轴范围设置为最小值 0、最大值 100,000（见 图 4A-F）。
  3. 在第 4.2 步生成的散点图中，设置 0.1、0.3、0.5 和 0.9 µm 的门。选择 矩形门 按钮，创建如 图 4G-I 所示的门。
    注意：图 5 显示了创建工作区的步骤，以创建阳性区域并获取荧光染料的平均荧光强度。

流式细胞术数据分析、荧光强度直方图、软件界面、示意图。
图 5：用于分析所获数据的工作区。所有图像均通过工作区的屏幕截图生成。（A）对所有样本应用了尺寸门控后生成的工作区。（B）选择自体荧光管，点图显示尺寸门控，以及一个选定尺寸（0.1 µm）的直方图，使用该直方图确定每种荧光染料和尺寸的阳性门控。（C）针对每种荧光染料和尺寸设置了阳性门控后生成的工作区。（D）为样本生成的工作区（左侧）和布局编辑器（右侧）。在布局编辑器中显示了自体荧光管和FL1-H通道阳性管的直方图，以及如何打开属性面板对其进行修改。（E）该图像展示如何获取平均荧光强度值。（F）为三种不同荧光染料生成的直方图，展示了软件允许对统计信息进行的各种调整。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 将生成的门控（0.1、0.3、0.5 和 0.9 µm）应用于所有样本。选择 门控，拖放到 所有样本 选项中，如 图 5A 所示。
  2. 单击 自发荧光管。针对每种荧光染料和每个粒径设置阳性区域。打开粒径门控的散点图 SSC-H VS FSC-H，单击 单一粒径门控。在新窗口中，单击 y轴 以选择直方图选项。在 x轴 上选择 FL1-H，然后选择 范围 图标以创建阳性区域。对 FL2-H 和 FL4-H 重复此操作（见 图 5B）。
  3. 将门控应用于所有样本。选择 门控，拖放到 所有样本 选项中，如 图 5C 所示。
  4. 打开布局编辑器。
  5. 将每个样本拖放到编辑器中。选择“自发荧光”管的粒径，拖放后，再选择染色管的相同粒径，进行拖放。
  6. 单击直方图右下角。打开 属性 菜单。单击 图例。添加荧光染料的平均荧光强度。
    注意：在 属性 中，还有其他可用工具可修改直方图的外观。
  7. 对剩余的荧光染料和粒径重复相同步骤。

5. 分析以获得每份样本中尿液细胞外囊泡（uEVs）的数量。

注意：图6展示了获取每份样本中uEV数量的操作步骤工作区。

流式细胞术数据分析；散点图和结果表格；细胞群体统计。
图6：CFSE样本管的分析工作区。所有图像均通过工作区截图生成。（A）通过选择所有尺寸区域生成的工作区，左侧为总uEVs区域，右侧为显示所选门控的点图。（B）自体荧光管中CFSE阴性区域的SSC-H与FL1-H点图。（C）染色管中CFSE的SSC-H与FL1-H点图。（D）获得的统计表格图像，显示样本中uEVs的数量。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 点击 Autofluorescence tube。在点图 SSC-H 与 FSC-H 中结合尺寸门控，创建一个包含所有尺寸的区域。点击 New Region。设定阳性区域（见 图6A,B）。
  2. 将门控应用于所有样本。选择门控区域，拖动并放置到 All Samples 选项中。
  3. 点击 CFSE + uEVs tube。打开新区域，并验证 CFSE（FL1-H）的阳性区域，如 图6C 所示。
  4. 在 图6D 的工作区中，复制该样本管的细胞数量数据。此数值即通过流式细胞术获得的 uEV 数量（#uEVs FC）。
  5. 应用以下公式计算每微升中的 uEV 数量：
    <uEVs 浓度计算公式，用于计算微囊泡的方程，科学方法>
  6. 为获得每种荧光染料对应的每微升 uEV 数量（#uEVs/µL FLX），在工作区中复制 FLX-H 子集的统计数值，该数值即为百分比（%FLX 子集）。
  7. 应用以下公式计算每种荧光染料对应的每微升 uEV 数量。
    微囊泡定量公式；方程；用于计算 %FLX 子集分析中 #uEVs/μL FLX 的值。
    注意：根据所选门控是针对单一尺寸还是全部 uEVs，需核对所选数据。

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结果

在整个实验流程中存在多个检查点，且均在对尿液细胞外囊泡（uEVs）染色之前。因此，首先必须验证uEVs提取物中所含的蛋白质量。所有从事细胞外囊泡研究的科研团队均会对蛋白进行定量，具体操作如步骤2.1所述。补充图2展示了一块典型的96孔板，其中4E、5E和6E孔含有uEVs组分。1A、2A和3A孔为空白对照，但如果未纯化到uEVs，则这些孔的颜色将与样品孔相近。

此步骤之后，需要验证uEVs的存在。补充图3展示了一块聚丙烯酰胺凝胶的代表性结果，该凝胶经考马斯亮蓝染色，用于显示所有收集组分中的蛋白质含量，并与其他分离uEVs的方法进行比较。在两种不同的还原剂——二硫苏糖醇（DTT）和β-巯基乙醇中，后者表现出更高的蛋白质得率。

另一个重要步骤是使用MISEV2018推荐的任一方法验证uEVs的存在。补充图4展示了在uEVs以及用作阴性对照的收集组分中，CD63和CD9等多种蛋白质富集的代表性结果。在uEVs组分中，未观察到这些蛋白...

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讨论

如今，细胞外囊泡作为多种疾病的生物标志物的应用日益增多，尤其是那些可从尿液等非侵入性来源分离的囊泡5,21,22,23,24。已有研究证实，尿液细胞外囊泡（uEVs）的分离对于了解健康个体的生理状态，以及多种疾病患者的诊断和预后评估具有重要意义6,13,16,25,26,27。本实验方案展示了如何获取uEVs，并通过流式细胞...

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披露

作者声明，本研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的财务或商业关系的情况下进行的。

致谢

本工作由墨西哥国家科学技术委员会（CONACyT，项目号 A3-S-36875）和墨西哥国立自治大学-DGAPA-PAPIIT 项目（项目号 IN213020 和 IA202318）的资助支持。NH-I 获得了墨西哥国家科学技术委员会（CONACyT）第 587790 号奖学金的支持。

作者感谢 Leopoldo Flores-Romo†、Vianney Ortiz-Navarrete、Antony Boucard Jr 和 Diana Gómez-Martin 为本方案的实施提供的宝贵建议，并感谢所有健康个体提供的尿液样本。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
APC 抗人 CD156c（ADAM10）抗体BioLegend352706加入5 µL 到 20 µPBS 中的 uEVs 升数
APC抗人TSPAN33（BAAM）抗体BioLegend395406加入5 µL 至 20 µPBS 中的 uEVs 升数
Avanti 离心机配备 JA-25.5O 固定角转子Beckman CoulterJ-26S XPI
BD Accuri C6 流式细胞仪BD 生物科学
β-巯基乙醇SIGMA-AldrichM3148
台式离心机配备 A-4-44 转子Eppendorf5804
BLUEstain 2 蛋白 MarkerGOLDBIOP008
CD9 (C-4) 小鼠单克隆抗体Santa Cruz Biotechnologysc-13118
CD63（MX-49.129.5）小鼠单克隆抗体Santa Cruz Biotechnologysc-5275
流式细胞术细胞增殖示踪CFSE试剂盒赛默飞世尔科技C34554
Chemidoc XRS+ 系统伯乐（BIORAD）5837
FITC 抗人 CD9 抗体BioLegend312104加入5 µL 到 20 µPBS 中的 uEVs 升数
FITC 抗人 CD37 抗体BioLegend356304加入5 µL 到 20 µPBS 中的 uEVs 升（L）
荧光黄色颗粒SpherotechFP-0252-2
荧光黄色颗粒SpherotechFP-0552-2
荧光黄色颗粒SpherotechFP-1552-2
FlowJo 软件Becton, Dickinson and Company
山羊抗小鼠免疫球蛋白/HRPDakoP0447
蛋白酶抑制剂混合物停止液赛默飞世尔科技78429
Immun-Blot PVDF 膜 0.22µmBIORAD1620177
Megamix-Plus FSC 微球COSMO BIO CO.LTD7802
NuPAGE LDS 样品缓冲液 4X赛默飞世尔科技NP0007
Optima 超速离心机，配备 90Ti 固定角转子 355530贝克曼库尔特XPN100
PageBlue 蛋白染色液赛默飞世尔科技24620
PE 抗人 CD53 抗体BioLegend325406加入5 µL20 µPBS 中的 uEVs 升数
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒赛默飞世尔科技23227
Pierce RIPA 裂解液赛默飞世尔科技89900
聚碳酸酯厚壁离心管贝克曼库尔特355630
Spherotech 8峰校准微球（FL1-FL3）BD Accuri653144
Spherotech 6峰校准微球（FL4）BD Accuri653145
蔗糖SIGMA-Aldrich59378
三乙醇胺SIGMA-Aldrich90279

参考文献

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