微塑料对鸟类胚胎发育的生态毒理学效应：无壳孵化研究

摘要

本文介绍了一种用于微塑料等颗粒污染物毒理学研究的无蛋壳孵化方法。

摘要

微塑料是一种新兴的全球性污染物，由于其可在动物组织和器官中被吸收并发生转位，对动物健康构成严重威胁。微塑料对鸟类胚胎发育的生态毒理学效应尚不明确。鸟蛋是一个完整的发育和营养系统，整个胚胎发育过程均在蛋壳内完成。因此，在传统孵化条件下，由于蛋壳不透明，难以直接观察污染物（如微塑料）胁迫下鸟类胚胎发育的动态过程。本研究通过无壳孵化技术，实现了对微塑料暴露下鹌鹑胚胎发育过程的可视化监测。主要步骤包括受精卵的清洗与消毒、暴露前的孵化、暴露后的短期孵化以及样本提取。结果显示，与对照组相比，暴露于微塑料组的胚胎湿重和体长均存在统计学差异，且整个暴露组的肝脏占体重比例显著增加。此外，我们还评估了影响孵化的外部因素：温度、湿度、蛋的旋转角度及其他条件。该实验方法为研究微塑料的生态毒理学效应提供了有价值的信息，也为探讨污染物对胚胎发育不良影响提供了一种新颖的研究途径。

引言

2015年，塑料废弃物的产量约为6300兆吨，其中约十分之一被回收利用，其余部分被焚烧或填埋于地下。据估计，到2050年，将有约12000兆吨塑料废弃物被填埋于地下¹。随着国际社会对塑料废弃物问题的关注，Thompson于2004年首次提出了微塑料的概念²。微塑料（MPs）是指粒径小于5 mm的微小塑料颗粒。目前，研究人员已在各大洲的海岸线、大西洋岛屿、内陆湖泊、北极地区以及深海生境中广泛检测到MPs的存在^3,4,5,6,7。因此，越来越多的研究人员开始关注MPs对环境的危害。

生物体可能摄入环境中的微塑料（MPs）。全球已有233种海洋生物的消化道中发现微塑料（包括100%的海龟物种、36%的海豹物种、59%的鲸类物种、59%的海鸟物种、92种海鱼以及6种无脊椎动物）⁸。此外，微塑料可能阻塞生物体的消化系统，并在其体内积累和迁移⁹。研究发现，微塑料可通过食物链传递，其摄入量随栖息地、生长阶段、摄食习性和食物来源的变化而不同¹⁰。一些研究人员在海鸟的粪便中检测到微塑料的存在¹¹，这表明海鸟可作为微塑料的传播载体。此外，摄入微塑料可能影响某些生物体的健康。例如，微塑料可能缠结在胃肠道中，从而增加鲸目动物的死亡率¹²。

微塑料（MPs）不仅对生物体具有单独的毒性作用，还可能与其他污染物共同对生物体产生联合毒性效应。摄入环境中浓度的塑料碎屑可能干扰成年鱼类的内分泌系统功能¹³。微塑料的尺寸是影响其被生物体摄取和积累的重要因素之一^14,15。小尺寸塑料，尤其是纳米级塑料，更容易与细胞和生物体相互作用，表现出较高的毒性^16,17,18,19。尽管纳米级微塑料对生物体的危害已超出当前研究水平，但对环境中尺寸小于几微米、特别是亚微米级/纳米级塑料的检测与定量仍面临巨大挑战。此外，纳米塑料对胚胎也有一定影响。聚苯乙烯可通过调控蛋白质和基因表达谱，损害海胆胚胎的发育²⁰。

为了探究微塑料（MPs）对生物体的潜在影响，我们开展了本项研究。由于鸟类胚胎与人类胚胎具有相似性，通常被用于发育生物学研究²¹，包括血管生成与抗血管生成、组织工程、生物材料植入以及脑肿瘤研究^22,23,24。鸟类胚胎具有成本低、培养周期短和操作简便等优势^25,26。因此，本研究选用生长周期较短的鹌鹑胚胎作为实验动物。同时，我们可利用无壳孵化技术，在胚胎发育阶段直接观察暴露于微塑料的鹌鹑胚胎所发生的形态学变化。实验所用材料为聚丙烯（PP）和聚苯乙烯（PS）。由于PP和PS²⁷在全球范围内的沉积物和水体中所获得的聚合物类型中占比最高，而从海洋生物体内提取出的最常见聚合物类型为乙烯和丙烯²⁸。本实验方案详细描述了对暴露于微塑料的鹌鹑胚胎进行毒理学效应可视化评估的完整流程。该方法可轻松拓展应用于检测其他污染物对其他卵生动物胚胎发育的毒性作用。

方案

1. 暴露前的准备

1. 选择同一天产出的受精鹌鹑蛋用于暴露实验。
2. 挑选重量相近的鹌鹑蛋。每个受精鹌鹑蛋约重10-12 g。
3. 彻底清除所有受精鹌鹑蛋表面的粪便及其他杂质。
4. 用抗生素溶液（青霉素和链霉素，1:1000，室温）对每枚孵化前的受精鹌鹑蛋以及待用蛋（选择蛋壳形状相似、尤其是蛋尖部分一致的蛋）进行消毒，并用75%乙醇对孵育箱进行消毒。
5. 使用牙科钻的钝端打开蛋壳，保留蛋尖处的蛋壳以备后续使用。在转移受精蛋之前，将蛋内容物倒出，以保持蛋壳的湿度。 开孔直径约为3 cm。
   注意：为减少对鹌鹑胚胎的损伤，应使用牙科钻在蛋的钝端开孔，并尽量使裂口平滑。
6. 消毒后，将受精鹌鹑蛋置于38 °C、湿度60%的孵育箱中孵育24-48小时，确保鹌鹑蛋的钝端朝上。
7. 在受精鹌鹑蛋孵育期间，将后续实验所需的工具放入灭菌锅中进行灭菌。这些工具包括保鲜膜、烧杯、无菌水、移液器吸头、外科直剪、镊子和勺子。
   注意： 应选用耐高温的保鲜膜，以避免高温灭菌过程中出现问题。

2. 无壳孵化鹌鹑蛋

1. 将孵化前的受精鹌鹑蛋从培养箱转移至洁净台，平放在容器中，静置约1-2分钟以稳定蛋体。
2. 使用剪刀（12.5 cm 外科直剪）穿刺 在孵化前的受精鹌鹑蛋中央轴线上打一个小孔（直径3 mm），并切开1-2 cm的小口。小心地将受精鹌鹑蛋的蛋清和蛋黄转移至切开的蛋壳中。
   注意：使用剪刀剪出小开口时，避免触碰鹌鹑蛋的蛋黄。
3. 用移液器将对照溶液（不含微塑料）以及含有不同质量（0.1、0.2 和 0.3 mg）、三种粒径（100、200 和 500 nm）微塑料的暴露溶液加入蛋内容物中。同时，加入1滴 用1 mL注射器加入青霉素和链霉素各1滴。
4. 用灭菌膜（步骤1.6）覆盖蛋壳的开口。
5. 根据步骤2.1-2.4，处理所有受精的鹌鹑蛋。
6. 将已转移的鹌鹑胚胎置于38 °C、湿度60%的培养箱中孵育所需时间。本实验中，采用±30°的鸡蛋旋转角度，每小时翻蛋一次。
   ​注意：转移过程应尽可能快速，这在初期阶段需要更多练习。

3. 样本采集

1. 培养7天后，用肉眼观察并取出发育良好的胚胎，去除蛋黄，并用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗。
2. 用吸水纸吸干清洗后胚胎表面多余的液体，在洁净的培养皿中称重。
3. 打开整个胸腔，用尖头镊子将肝脏和心脏从内脏中分离，清理后立即放入1.5 mL离心管中。
4. 迅速在电子天平上记录重量，并计算肝体指数（HIS = 肝脏重量 / 体重 × 100）。测量胸骨和身体的长度。
5. 根据上述指标，评估微塑料（MPs）对胚胎发育的影响。
   ​注：此处胚胎质量指的是去黄卵质量。

4. 数据分析

1. 以均值 ± 标准误（SEM）的形式报告实验数据。
2. 采用单因素方差分析比较多组样本均值。显著性差异水平设为 α = 0.05。

结果

在实验数据分析中，我们比较了对照组与6个实验组之间的湿重、体长、胸骨长度以及肝体指数的变化，从宏观角度测量并反映鹌鹑胚胎的生长发育情况。每组检测了六只正常的鹌鹑胚胎，每只胚胎均达到所需的哈amburger和Hamilton（HH）发育阶段。

在图1中，我们将孵化前的受精鹌鹑蛋内容物转移至半球形蛋壳中，并将其放入培养箱。随后，我们连续三天记录了孵化中期胚胎的发育情况。如图2所示，A-A2为对照组，B-B2为一个处理组。从胚胎宏观发育的角度来看，胚胎发育正常，未受到微塑料的不良影响。

表1 和 表2 为鹌鹑胚胎经一周暴露后的湿重、体长和胸骨长度的均值 ± 标准误（SEM）。表格显示，不同暴露组的湿重和体长变化显著。经0.1 mg、0.3 mg、100 nm和500 nm微塑料处理的组别，其体重和体长略有下降。经0.2 mg的200 nm微塑料处理...

讨论

本文提供了一种通过检测基本发育指标来评估鹌鹑胚胎发育的有效实验方案。然而，该实验仍存在一些局限性。

首先，由于无壳孵化，鹌鹑胚胎在孵化后期死亡率较高。实验过程中存在一些人为无法控制的因素，例如正常蛋白质比例遭到破坏。我们限制了胚胎的暴露时间，以确保实验的准确性。胚胎毒性研究只能在胚胎发育的早期和中期进行。其次，微塑料（MPs）对鹌鹑胚胎发育的研究目前仅停留在基本形态学分析层面，因此结论相对简单，可能存在不足之处。同时，本实验对实验条件和操作技术的要求相对较高。因此，列出以下值得注意的要点：

在准备工作过程中，对受精鹌鹑卵进行消毒和灭菌非常重要，因为受精鹌鹑卵表面可能携带对实验有害的病原微生物。若未进行消毒，这些微生物可能在孵化过程中侵入受精卵，导致鹌鹑胚胎死亡；即使移植操作成功，胚胎死亡率也会升高。因此，必须做好充分的消毒与灭菌工作，以降低实验过程中的死亡率。

鸟类在孵化蛋时，通常会调整蛋的位置，并保持空气流通，以维持蛋的恒定温度以及胚胎的正确位置。本实验使用薄膜密封蛋壳...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
多样品组织研磨机	上海精兴工业发展有限公司	Tissuelyser-24	在低温下将大块塑料研磨成小块
电子天平	OHAUS 公司	PR系列精密仪器	用于称重
受精的鹌鹑蛋	广州苍木农业发展有限公司		无壳孵化鹌鹑蛋
荧光聚丙烯颗粒	佛山聚亮光学材料有限公司		实验选用的塑料类型
培养箱	山东邦达孵化设备有限公司	264 pc	为胚胎的生长和发育提供场所
纳米级聚苯乙烯微球	Xi’an Ruixi 生物科技有限公司	100 nm，200 nm，500 nm	实验选用的塑料类型
钢尺	德力集团	20 cm	用于测量  长度
立式加热压力蒸汽灭菌器	上海申安医疗器械厂	LDZM-80KCS-II	对实验物品进行灭菌