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方法文章

制备成年啮齿类动物海马背极的急性脑切片

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DOI：

10.3791/61699

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2020年9月10日

1Simons Initiative for the Developing Brain, Centre for Discovery Brain Sciences, The University of Edinburgh

本文内容

摘要

本实验方案的目的是描述一种制备背侧海马脑片以进行电生理学检测的方法。该方法在切片前采用冷的任氏液（ACSF）灌注，并以接近冠状面的角度进行切片，从而有助于保持主要神经元的健康状态。

摘要

对急性啮齿类动物脑切片进行全细胞膜片钳记录是现代神经生理学研究的主要手段，可精确测量细胞和突触特性。然而，随着关于脑功能的问题日益复杂，除了脑片电生理之外，人们越来越需要在不同实验模式之间进行关联分析，例如：免疫组织化学、分子生物学、体内成像或电生理记录。然而，从这些不同的实验方法中得出有意义的结论并不容易，因为即使在结构描述相对清晰的脑区中，细胞功能也存在高度的亚区域差异。这一点在海马体CA1区表现得尤为明显，该区域根据细胞和分子特性具有明确的背侧-腹侧差异。然而，许多已发表的研究在海马背侧区域考察蛋白质表达模式或与行为相关的体内活动，并用腹内侧区域的细胞电生理结果来解释其发现的机制。这一问题还因另一个事实而更加复杂：许多急性脑片电生理实验是在幼年动物上进行的，而其他实验模式则在更成熟的动物上开展。为解决这些问题，本方法采用人工脑脊液对成熟（>60日龄）动物进行经心脏灌流，随后制备包含背侧海马隔极的改良冠状切片，以记录CA1锥体细胞的电活动。该流程可获得健康的背侧海马急性脑片，从而实现与其他检测手段相匹配的基于脑片的细胞电生理研究。

引言

海马体可以说是哺乳动物大脑中研究最为深入的结构之一，这主要归因于其相对较大的体积和显著的层状结构。海马体已被证实参与多种行为过程，包括空间导航、情境记忆以及事件记忆的形成。这部分归因于在啮齿类动物中，其海马背侧区域相对易于进行实验操作与研究 体内 分析表明，主要的输出细胞通常位于软脑膜表面下不到2毫米处。

在啮齿类动物中，海马体是一个相对较大的结构，由端脑内陷形成，从背侧隔区延伸至腹侧新皮层。它主要由两个区域构成：齿状回和 海马角 （CA）；后者根据连接性、细胞解剖结构和遗传特性，可分为3个已有明确描述的亚区（CA1-3），并延伸至齿状回门部（ formerly known as CA4）1该结构沿海马的背腹侧延伸范围保持一致，尽管在突触特性上存在显著差异。2,3,4解剖学5，遗传多样性6,7,8，以及行为功能9,10在CA区域中，CA1亚区主要由谷氨酸能CA1锥体细胞（CA1 PCs）构成，目前已定义出3种亚型。11，以及构成约10%神经元的抑制性中间神经元，其具有高度多样性，已定义出超过30种亚型12,13,14除了区域特异性差异外，正常衰老已被证明对突触传递具有显著影响15,16,17解剖学18，以及遗传谱型19目前，通过急性脑切片的全细胞膜片钳记录来评估细胞和突触特性的复杂机制，是该领域公认的标准方法。20.

对海马功能的理解在很大程度上依赖于背侧区域的操作，因为该区域在手术或解剖上更容易接近，便于开展行为学任务、植入电极或成像窗口，以及病毒质粒表达等操作。此外，在许多研究中，这些操作通常在晚幼年期或成年啮齿类动物中进行，以避免发育过程中脑结构的变异性。尽管如此，许多用于检测细胞和亚细胞水平电生理特性的方法仍主要在早至中幼年期的啮齿类动物中实施，且大多取自海马横断面的腹内侧区域21,22,23,24,25。在少数研究中，当评估整个背腹向范围时，通常使用组织切片机以维持横断面的完整性4,26，或实验在幼年大鼠27或小鼠28中进行。此外，已知在解剖脑组织前对组织进行冷却可有效保护大鼠海马的结构29以及小鼠新皮层神经元的完整性30,31。然而，关于在成年大鼠中通过改良冠状切面获取海马背侧横断轴脑片的具体操作细节仍十分缺乏。

本方案描述了一种方法，可在经改良的冠状切片中对老龄大鼠背侧海马的单个或成对神经元进行全细胞膜片钳记录，随后进行事后形态学鉴定。通过经心脏灌注冰冷的人工脑脊液（ACSF）获得健康的脑片，从而便于记录CA1锥体细胞及局部中间神经元的电生理特性。

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方案

所有动物的产生和饲养均遵循英国内政部及机构指南（HO# P135148E）进行。所有大鼠均维持在12小时光照/12小时黑暗的循环条件下，并提供 随意摄取 自由获取食物和水

1. 冰冷人工脑脊液的经心灌注

  1. 所有实验开始前，将约200 mL蔗糖-ACSF溶液表1) 在 -20 °C 冰箱中冷冻至半冻结状态（用于切片），另准备约 100–200 mL 冰上预冷的过滤蔗糖-ACSF（用于灌注），并用碳氧混合气（95% O₂2/5% CO₂2).
  2. 从饲养笼中取出一只成年大鼠，置于实验操作室内的暂养笼中，适应环境噪音和光照条件约30分钟。
  3. 准备解剖工具（图1A灌注区域及可注射麻醉剂（约1 mL 200 mg/mL 戊巴比妥钠，终浓度为100 mg/kg）。
  4. 在麻醉室中放入一小块组织纸或脱脂棉，加入1-2 mL挥发性异氟烷麻醉剂至 chamber 内的吸水材料中。
  5. 将大鼠放入麻醉舱内进行镇静。监测其呼吸，直至呼吸频率降至约每秒1次浅呼吸。
  6. 此时，将半冷冻的蔗糖-ACSF溶液置于冰上，并用碳合气（carbogen）鼓泡，以备切片时使用。
  7. 称量大鼠并记录其体重。
  8. 通过腹腔注射预先配制的戊巴比妥钠使大鼠最终麻醉。戊巴比妥钠剂量应为100 mg/kg，根据之前测得的体重及药物储备浓度计算给药量。将大鼠置于固定盒中，等待0.5–5分钟以确保终末麻醉起效。
  9. 确认反射消失：使用钝头探针（如圆头镊子）检测角膜眨眼反射（轻触角膜）和后肢足垫夹捏反射（抬起后肢并夹捏足垫）。待反射完全消失后，用皮下注射针头将大鼠固定于聚苯乙烯或软木制手术板上。
  10. 打开胸腔，将套管置于心脏左心室底部。穿刺右心房，并立即使用冰冻（0-1 °C）蔗糖-ACSF溶液（以50 mL/分钟的流速通过蠕动泵）开始灌注。
  11. 一旦液体完全交换且身体冷却后（<5 分钟后，移除套管和针，然后使用断头器进行断头。
  12. 使用骨剪和咬骨钳小心且迅速地移除颅骨（图1A,1B).
    1. 首先使用骨剪在枕骨大孔处进行双侧两次切割，然后用咬骨钳将颅骨从枕骨大孔去除至人字缝。接着用骨剪沿颅骨正中缝小心剪开，直至眼球后方。
    2. 沿中线两侧做两处双侧切口，切口方向垂直于中线。使用咬骨钳沿中线打开颅骨。使用精细剪刀或钩针时需格外小心，彻底清除软脑膜。
  13. 使用钝头刮勺将脑组织从颅骨中取出，通过左右挤压切断颅神经和视神经。将脑组织置于充有碳合气、半冷冻（0–1 °C）的蔗糖人工脑脊液（sucrose-ACSF）中，浸泡1–2分钟后再进行切片。

2. 背侧海马脑片的制备

  1. 将灌注后的脑组织从半冷冻（0–1 °C）的蔗糖-ACSF溶液中取出，置于铺有滤纸的玻璃培养皿中，将脑组织腹面朝下放置。
  2. 使用手术刀（22号刀片），从垂直方向约10°处切除脑组织后部，以形成一个平整的表面，用于将脑组织粘附于切片台上图1C).
  3. 在振动切片机的载物台上涂抹少量氰基丙烯酸酯胶水。将胶水铺展成一层薄膜，其面积约为脑组织切面横截面积的1.5倍。
  4. 将脑组织从玻璃培养皿中移至刮勺上，切面朝下，使用画笔引导组织。用一片纸巾轻压脑组织以吸去多余的ACSF，然后将脑组织切面朝下移至胶水中央。使用巴斯德移液管，在脑组织上加入1–2 mL冰冻的蔗糖-ACSF，以清除脑块周围的胶水。
  5. 将脑组织放入切片室，并用半冷冻的蔗糖人工脑脊液（ACSF）充满。使用勺子或刮刀清除脑组织块周围的多余冰屑，然后通入碳合气（carbogenate）图1D).
  6. 将振动切片机的刀片移至指定位置：距离脑组织背侧表面约 1 mm，垂直方向上位于前囟前方约 1 mm 处。确保刀片完全浸入液面下，并使用画笔去除气泡。
  7. 开始切片脑组织。为修整至背侧海马，使用0.1–0.2 mm/s的切片速度，水平刀片移动距离为1–1.5 mm，往复振荡频率约为90 Hz。切片背侧海马时，将速度降低至0.05–0.1 mm/s。
  8. 每只脑组织采集背侧海马切片（通常为3-4张完整切片或6-8张半切切片）。若需获取腹内侧海马的纵向切片，可继续切片。背侧海马切片完成后，无需再切取大约位于第三脑室位置之后的额外组织。rd 心室。停止振动切片机，用弯头皮下注射针分离切片，并收集到切片室底部。
    注意：切片厚度可根据实验需求设定为250–500 µm。对背侧海马体进行记录时，通常采用400 µm厚的切片，以尽可能保留局部神经网络，同时满足适宜的显微观察条件。
  9. 在解剖显微镜下修剪脑片，仅保留海马及覆盖的皮层。将脑片转移至预热至35 °C的孵育 chamber 中，腹面朝上。
  10. 根据待进行的实验确定储存室类型。若需在浸没式记录室中获取高质量的全细胞膜片钳记录或靠近脑片表面的细胞外场电位记录，请将脑片储存在浸没式室中。或者，若需记录振荡性网络活动或进行界面式细胞外场电位记录，则将脑片储存在液/气界面室中。
  11. 对于浸没式储存条件，从最后一片组织进入储存室开始计时，在35 ºC下孵育30分钟以使组织切片恢复。此步骤可重新激活代谢过程并修复被切断的神经突。30分钟后，将储存室转移至室温。

3. 记录背侧海马神经元

  1. 使用毛细玻璃管制备记录用膜片钳电极。本方案采用外径1.5 mm、内径0.86 mm并带有细丝的硼硅酸盐玻璃管，当灌注细胞内液后，电极尖端电阻为3–5 MΩ（见表1）。细胞内液需在使用前置于冰上冷藏，以防止高能成分降解，并在使用前经滤器过滤（注射器滤器，孔径：0.2 μm）。
  2. 用碳合气（carbogen）饱和记录用人工脑脊液（ACSF），并在水浴中预热至35–40 ºC。通过蠕动泵驱动的灌流管路将已饱和碳合气并预热的ACSF输送至记录浴槽。在将脑片转移至浴槽前数分钟即开始灌流。
  3. 暂停灌流，将脑片转移至记录浴槽，确保其前表面朝上。用带有丝线单丝纤维的铂金丝环固定脑片，形成“竖琴”状结构。调整脑片位置，使CA1区的stratum pyramidale（锥体细胞层）与第一根记录电极的轴线垂直。
  4. 以6–8 mL∙min-1的最佳流速重新启动碳合气饱和并预热（35–40 ºC）的记录ACSF灌流（表1）。
    注意：较高的灌流速率（6–8 mL∙min-1）有利于维持脑片中的网络活动32。较低的流速（例如2–3 mL∙min-1）可用于维持脑片稳定性，适用于成像实验或无需生物相关网络活动的研究。
  5. 使用40倍物镜的红外微分干涉差（IR-DIC）光学系统（通过CCD相机观察）评估脑片质量。若在平滑且轻微凹陷的表面下20–30 μm深度处的str. pyramidale中可见大量呈卵圆形、中等对比度的CA1锥体细胞（PCs），则认为脑片质量良好（图2A）。质量差的脑片则表现为大量高对比度、皱缩或肿胀的细胞，且脑片表面不平整。
  6. 用细胞内液（例如基于24 mM [Cl-]的细胞内液）灌注膜片钳电极，以便与已发表的数据进行比较。
  7. 按照先前描述的方法进行全细胞膜片钳记录22。若穿孔后膜电位（VM）去极化程度超过-50 mV，串联电阻>30 MΩ，或记录过程中串联电阻变化>20%，则排除该细胞。在本记录条件下，串联电阻通常在8–25 MΩ范围内，并在长达1小时内保持稳定。
  8. 为研究背侧海马CA1区的固有兴奋性，采用全细胞记录模式，在电流钳配置下通过以下方案检测细胞的固有生理特性：
    1. 在未施加偏置电流、处于静息膜电位时，施加小幅度电流脉冲（-10 pA，500 ms），重复30次。
    2. 在施加偏置电流使膜电位维持于-70 mV时，施加持续500 ms的超极化至去极化电流阶梯（-100 至 +400 pA，步长25 pA），每组波形重复3次。
    3. 施加峰-峰值为100 pA的正弦波，频率从0.1至20 Hz可变，重复3次。
    4. 施加5组2 nA、2 ms的刺激，以分别在20、40、60、80、100 Hz频率下诱发动作电位，每个频率采集10次扫描。
    5. 在-70 mV电压钳条件下，记录5分钟的自发性兴奋性突触后电流（EPSC）。
  9. 为在成功记录后对细胞进行组织学分析而重新封闭细胞，可通过缓慢回撤膜片钳电极形成外向膜片（outside-out patch）。当-5 mV测试脉冲测得的串联电阻从实验水平上升至>1 GΩ时，将钳制电位升至-40 mV，并完全撤出电极。
  10. 在同一脑片上进行额外记录，以满足实验设计所需的统计效力。
  11. 将含有已记录神经元的脑片从记录浴槽中取出，放入24孔板中，用4%多聚甲醛（溶于0.1 M磷酸盐缓冲液）替换ACSF，并在4°C下过夜固定。
  12. 次日，用0.1 M磷酸盐缓冲液替换多聚甲醛溶液，储存待后续组织学处理。按照先前描述的方法22，使用荧光标记的链霉亲和素对细胞进行可视化。

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结果

上述方案可用于制备成年大鼠背侧海马腹侧极的活体脑片。本方案的一个关键因素是在脑片制备前灌注冰冻的蔗糖-人工脑脊液（ACSF），从而获得靠近脑片表面、状态良好的CA1区锥体细胞（PCs）。脑片质量通过红外微分干涉相差（IR-DIC）光学显微镜进行视觉评估，健康细胞表现为具有较大、卵圆形的胞体，沿stratum pyramidale全层分布，从致密层延伸至stratum oriens（图2A，黑色箭头）。不健康的脑片则表现为表面存在死亡细胞，深层极少出现（图2A，红色箭头），死亡细胞的识别依据是胞体高度浓缩、对比度强，或胞体显著“膨胀”且细胞核浓缩。

通过在假定健康的神经元上进行全细胞膜片钳记录来确认脑片的健康状态。全细胞膜片钳记录通过快速、自发形成吉欧姆封接实现（15.5 ± 2.9 s； 图2B），与此...

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讨论

本文描述了一种从海马体CA1区背侧区域制备高质量脑切片的实验方案，可在该区域内对多个存活神经元进行记录。通过对近冠状切片进行全细胞记录并结合神经元可视化观察的联合方法，对于确认细胞存活状态及细胞身份至关重要。

本方案之所以能稳定地制备出具有活性的脑片，主要有两个原因。首先，对切割角度的改进（偏离真正的冠状面）有助于更好地保留神经元的胞体-树突轴，从而维持其生物学上的相关功能。由于海马背侧最远端CA1区锥体细胞（PCs）的胞体-树突轴方向并不与真正的冠状切面共面1，因此这一调整可实现更佳的组织保存效果。另一种可选方法是完全取出海马，并使用组织切片机来制备脑片，该方法此前已被用于急性脑片4,33以及脑片培养34,35。然而，这种方法的缺点是在提取和切片过程中可能损伤海马（尤其在操作经验不足的情况下），而保持...

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披露

作者声明不存在任何竞争性财务利益。

致谢

作者希望感谢 David JA Wyllie 教授、Emma Perkins 博士、Laura Simoes de Oliveira 以及 Peter C Kind 教授对文稿提出的有益意见及实验方案的优化建议，并感谢 Simons 发展中大脑倡议项目为本文提供出版费用。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
采集软件Molecular DevicespClamp 10
成年大鼠多种n/a任何品系的成年大鼠（60天及以上）
放大器Molecular DevicesAxopatch 700B
分析软件免费软件Stimfithttps://github.com/neurodroid/stimfit
骨剪FST16152-12Littauer 型
毛细玻璃管Harvard Apparatus30-0060含丝硼硅酸盐玻璃移液管，外径 1.5 mm，内径 0.86 mm。
碳酰气（Carbogen）BOC多种95% O2/5% CO2
CCD相机ScientificaSciCamProhttps://www.scientifica.uk.com/products/
化学品/试剂Sigma Aldrich多种所有实验室试剂均购自 Sigma Aldrich。
氰基丙烯酸酯（例如 RS Pro 3）RS Components918-6872避免使用凝胶型氰基丙烯酸酯配方
数模转换器Molecular DevicesDigidata 1550B
解剖针/针头多种多种使用 16 号针头（如上）
电生理系统ScientificaSliceScopehttps://www.scientifica.uk.com/products/ scientifica-slicescope
精细虹膜剪FST14568-12带碳化钨尖端
玻璃培养皿Fisher Scientific12911408
皮下注射针头BD Healthcare多种16、18 和 22 号
异氟烷 100% W/W（例如 IsoFlo）Zoetis50019100
梅奥型剪刀FST14110-17钝头
显微操作器ScientificaMicrostarhttps://www.scientifica.uk.com/products/scientifica-microstar-micromanipulator
画笔美术用品店n/a从本地美术用品店购买的细毛画笔。
巴斯德移液管Fisher Scientific11546963玻璃巴斯德移液管，但需剪断，使用钝端转移移液管。
蠕动泵Watson Marlow12466260单通道蠕动泵
移液管拉制仪Sutter InstrumentsP-97其他型号或移液管制备方法同样适用。
塑料注射器（1、2、5 mL）BD Healthcare多种
咬骨钳FST16021-14
切片保存室自制
切片固定网/支架Harvard ApparatusSHD-22L/15其他替代品亦可适用。
戊巴比妥钠（例如 Pentoject）Animalcare Ltd10347/4014200 mg/mL；其他戊巴比妥制剂亦可适用
刮勺Bochem3213可从 Fisher Scientific 购得
注射器滤器Fisher Scientific10482012Corning 品牌注射器滤器，孔径 0.22 µm。
振动切片机Leica1491200S001VT1200S 型，配备 Vibrocheck
水浴锅Fisher Scientific151670155 升水浴锅，例如：Grant Instruments™JBA5 scientifica-scicam-pro

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