制备成年啮齿类动物海马背极的急性脑切片

摘要

本实验方案的目的是描述一种制备背侧海马脑片以进行电生理学检测的方法。该方法在切片前采用冷的任氏液（ACSF）灌注，并以接近冠状面的角度进行切片，从而有助于保持主要神经元的健康状态。

摘要

对急性啮齿类动物脑切片进行全细胞膜片钳记录是现代神经生理学研究的主要手段，可精确测量细胞和突触特性。然而，随着关于脑功能的问题日益复杂，除了脑片电生理之外，人们越来越需要在不同实验模式之间进行关联分析，例如：免疫组织化学、分子生物学、体内成像或电生理记录。然而，从这些不同的实验方法中得出有意义的结论并不容易，因为即使在结构描述相对清晰的脑区中，细胞功能也存在高度的亚区域差异。这一点在海马体CA1区表现得尤为明显，该区域根据细胞和分子特性具有明确的背侧-腹侧差异。然而，许多已发表的研究在海马背侧区域考察蛋白质表达模式或与行为相关的体内活动，并用腹内侧区域的细胞电生理结果来解释其发现的机制。这一问题还因另一个事实而更加复杂：许多急性脑片电生理实验是在幼年动物上进行的，而其他实验模式则在更成熟的动物上开展。为解决这些问题，本方法采用人工脑脊液对成熟（>60日龄）动物进行经心脏灌流，随后制备包含背侧海马隔极的改良冠状切片，以记录CA1锥体细胞的电活动。该流程可获得健康的背侧海马急性脑片，从而实现与其他检测手段相匹配的基于脑片的细胞电生理研究。

引言

海马体可以说是哺乳动物大脑中研究最为深入的结构之一，这主要归因于其相对较大的体积和显著的层状结构。海马体已被证实参与多种行为过程，包括空间导航、情境记忆以及事件记忆的形成。这部分归因于在啮齿类动物中，其海马背侧区域相对易于进行实验操作与研究 体内 分析表明，主要的输出细胞通常位于软脑膜表面下不到2毫米处。

在啮齿类动物中，海马体是一个相对较大的结构，由端脑内陷形成，从背侧隔区延伸至腹侧新皮层。它主要由两个区域构成：齿状回和 海马角 （CA）；后者根据连接性、细胞解剖结构和遗传特性，可分为3个已有明确描述的亚区（CA1-3），并延伸至齿状回门部（ formerly known as CA4）¹该结构沿海马的背腹侧延伸范围保持一致，尽管在突触特性上存在显著差异。^2,3,4解剖学⁵，遗传多样性^6,7,8，以及行为功能^9,

方案

所有动物的产生和饲养均遵循英国内政部及机构指南（HO# P135148E）进行。所有大鼠均维持在12小时光照/12小时黑暗的循环条件下，并提供 随意摄取 自由获取食物和水

1. 冰冷人工脑脊液的经心灌注

1. 所有实验开始前，将约200 mL蔗糖-ACSF溶液表1) 在 -20 °C 冰箱中冷冻至半冻结状态（用于切片），另准备约 100–200 mL 冰上预冷的过滤蔗糖-ACSF（用于灌注），并用碳氧混合气（95% O₂₂/5% CO₂₂).
2. 从饲养笼中取出一只成年大鼠，置于实验操作室内的暂养笼中，适应环境噪音和光照条件约30分钟。
3. 准备解剖工具（图1A灌注区域及可注射麻醉剂（约1 mL 200 mg/mL 戊巴比妥钠，终浓度为100 mg/kg）。
4. 在麻醉室中放入一小块组织纸或脱脂棉，加入1-2 mL挥发性异氟烷麻醉剂至 chamber 内的吸水材料中。
5. 将大鼠放入麻醉舱内进行镇静。监测其呼吸，直至呼吸频率降至约每秒1次浅呼吸。
6. 此时，将半冷冻的蔗糖-ACSF溶液置于冰上，并用碳合气（carbogen）鼓泡，以备切片时使用。
7. 称量大鼠并记录其体重。
8. 通过腹腔注射预先....

结果

上述方案可用于制备成年大鼠背侧海马腹侧极的活体脑片。本方案的一个关键因素是在脑片制备前灌注冰冻的蔗糖-人工脑脊液（ACSF），从而获得靠近脑片表面、状态良好的CA1区锥体细胞（PCs）。脑片质量通过红外微分干涉相差（IR-DIC）光学显微镜进行视觉评估，健康细胞表现为具有较大、卵圆形的胞体，沿stratum pyramidale全层分布，从致密层延伸至stratum oriens（图2A，黑色箭头）。不健康的脑片则表现为表面存在死亡细胞，深层极少出现（图2A，红色箭头），死亡细胞的识别依据是胞体高度浓缩、对比度强，或胞体显著“膨胀”且细胞核浓缩。

通过在假定健康的神经元上进行全细胞膜片钳记录来确认脑片的健康状态。全细胞膜片钳记录通过快速、自发形成吉欧姆封接实现（15.5 ± 2.9 s； 图2B），与此.......

讨论

本文描述了一种从海马体CA1区背侧区域制备高质量脑切片的实验方案，可在该区域内对多个存活神经元进行记录。通过对近冠状切片进行全细胞记录并结合神经元可视化观察的联合方法，对于确认细胞存活状态及细胞身份至关重要。

本方案之所以能稳定地制备出具有活性的脑片，主要有两个原因。首先，对切割角度的改进（偏离真正的冠状面）有助于更好地保留神经元的胞体-树突轴，从而维持其生物学上的相关功能。由于海马背侧最远端CA1区锥体细胞（PCs）的胞体-树突轴方向并不与真正的冠状切面共面¹，因此这一调整可实现更佳的组织保存效果。另一种可选方法是完全取出海马，并使用组织切片机来制备脑片，该方法此前已被用于急性脑片^4,33以及脑片培养^34,35。然而，这种方法的缺点是在提取和切片过程中可能损伤海马（尤其在操作经验不足的情况下），而保持.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
采集软件	Molecular Devices	pClamp 10
成年大鼠	多种	n/a	任何品系的成年大鼠（60天及以上）
放大器	Molecular Devices	Axopatch 700B
分析软件	免费软件	Stimfit	https://github.com/neurodroid/stimfit
骨剪	FST	16152-12	Littauer 型
毛细玻璃管	Harvard Apparatus	30-0060	含丝硼硅酸盐玻璃移液管，外径 1.5 mm，内径 0.86 mm。
碳酰气（Carbogen）	BOC	多种	95% O2/5% CO2
CCD相机	Scientifica	SciCamPro	https://www.scientifica.uk.com/products/
化学品/试剂	Sigma Aldrich	多种	所有实验室试剂均购自 Sigma Aldrich。
氰基丙烯酸酯（例如 RS Pro 3）	RS Components	918-6872	避免使用凝胶型氰基丙烯酸酯配方
数模转换器	Molecular Devices	Digidata 1550B
解剖针/针头	多种	多种	使用 16 号针头（如上）
电生理系统	Scientifica	SliceScope	https://www.scientifica.uk.com/products/ scientifica-slicescope
精细虹膜剪	FST	14568-12	带碳化钨尖端
玻璃培养皿	Fisher Scientific	12911408
皮下注射针头	BD Healthcare	多种	16、18 和 22 号
异氟烷 100% W/W（例如 IsoFlo）	Zoetis	50019100
梅奥型剪刀	FST	14110-17	钝头
显微操作器	Scientifica	Microstar	https://www.scientifica.uk.com/products/scientifica-microstar-micromanipulator
画笔	美术用品店	n/a	从本地美术用品店购买的细毛画笔。
巴斯德移液管	Fisher Scientific	11546963	玻璃巴斯德移液管，但需剪断，使用钝端转移移液管。
蠕动泵	Watson Marlow	12466260	单通道蠕动泵
移液管拉制仪	Sutter Instruments	P-97	其他型号或移液管制备方法同样适用。
塑料注射器（1、2、5 mL）	BD Healthcare	多种
咬骨钳	FST	16021-14
切片保存室	自制
切片固定网/支架	Harvard Apparatus	SHD-22L/15	其他替代品亦可适用。
戊巴比妥钠（例如 Pentoject）	Animalcare Ltd	10347/4014	200 mg/mL；其他戊巴比妥制剂亦可适用
刮勺	Bochem	3213	可从 Fisher Scientific 购得
注射器滤器	Fisher Scientific	10482012	Corning 品牌注射器滤器，孔径 0.22 µm。
振动切片机	Leica	1491200S001	VT1200S 型，配备 Vibrocheck
水浴锅	Fisher Scientific	15167015	5 升水浴锅，例如：Grant Instruments™JBA5 scientifica-scicam-pro