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方法文章

鹰嘴豆干根腐病检测方法：详细实验方案

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DOI：

10.3791/61702

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2021年1月17日

 , 
1National Institute of Plant Genome Research

本文内容

摘要

本研究介绍了用于分析鹰嘴豆与立枯丝核菌（Rhizoctonia bataticola）互作中病理形态学和分子机制的方法体系。滤纸法可用于快速研究不同鹰嘴豆基因型的反应，而病土盆栽法可用于同时施加干旱胁迫和R. bataticola侵染，以筛选耐受性基因型。

摘要

干根腐病（DRR）是一种在全球范围内对鹰嘴豆种植构成威胁的新兴生物胁迫病害，由一种土传真菌病原体Rhizoctonia bataticola引起。目前文献中关于该病害检测的全面且详细的分步实验方案较为缺乏。本文提供了建立利用滤纸法快速筛选抗DRR基因型的完整操作步骤。滤纸法操作简便且成本较低。另一种基于病钵法的方法可模拟自然侵染过程，适用于研究病害三角中涉及的植物、病原体和环境三者之间的相互作用组分。

此外，在自然条件下，根腐病（DRR）主要发生在雨养鹰嘴豆种植区，随着作物生长的推进，土壤水分逐渐减少。已知干旱胁迫会增加鹰嘴豆植株对DRR病害的易感性。在干旱胁迫条件下，对植物与病原菌互作的病理形态学和分子机制的理解，有助于从鹰嘴豆种质资源库中鉴定出优良的DRR抗性品种。本文提供了一套制备病土盆及后续病害检测的逐步操作方法。总体而言，本文所提供的信息将帮助研究人员制备R. bataticola真菌接种物，维持该病原菌的培养，建立滤纸培养技术，制备病菌培养物和病土盆，并评估鹰嘴豆植株中的病原菌侵染情况。

引言

干根腐病（DRR）是鹰嘴豆中一种具有重要经济影响的病害1,2。该病害为根部特异性病害，由Rhizoctonia bataticola（有性态：Macrophomina phaseolina）引起。感病植株缺乏侧根，主根脆性增加，地上部分表现为叶片黄化1,3。已有报道指出，在干旱胁迫条件下，干根腐病已成为鹰嘴豆种植中日益严重的威胁1,2,3。此外，在田间条件下，干旱胁迫会加剧干根腐病的发生1,2,3。与灌溉田块相比，干根腐病在雨养农业区更为普遍4。利用抗病品种是防控该病害并避免使用杀菌剂的有效途径1,13。由于全球范围内的鹰嘴豆种质资源在该性状上存在遗传变异5，因此筛选和鉴定抗病/感病基因型对于通过分子育种手段改良作物品种至关重要。

稳健、简便且经济有效的病害检测方法对于研究鹰嘴豆中 R. bataticola 的侵染模式至关重要。目前用于观察鹰嘴豆基因型对 R. bataticola 侵染反应的主要病害检测方法是滤纸法1,4。该方法操作简单，仅需液体真菌接种物、带根幼苗和无菌滤纸即可完成。然而，由于文献中尚无详细的分步操作方案，该技术尚未得到充分应用。

与此同时，病菌盆栽技术涉及制备潜在的病原菌培养物并施加干旱胁迫。鉴于干旱胁迫会加剧水稻根腐病（DRR）的发生3，因此在干旱胁迫条件下研究植物与病原菌的互作至关重要6,7。病菌盆栽技术为此类同步研究提供了平台，有助于更好地进行种质资源筛选并深入理解互作的机制基础。利用该技术可研究DRR病害特有的病理形态学变化，例如根长增加和侧根数量减少1,3,7。

本文介绍了一种用于研究鹰嘴豆与R. bataticola相互作用并筛选鹰嘴豆种质资源的 blotting paper 和 sick pot 技术的详细实验方案。研究中所用材料的详细信息见 材料表。

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方案

1. 薯蓣柱孢（R. bataticola）的分离与保存

  1. 鹰嘴豆基因型及DRR症状的详细信息
    1. 使用通常表现出典型根腐病（DRR）症状的鹰嘴豆植株（基因型 JG 62），症状包括干燥、脆性的主根，无侧根，以及树皮下和髓部内部存在微菌核1,3.
  2. 收集与洗涤
    1. 拔除表现出症状的植株，症状包括叶片呈干草色、主根变脆，并在表皮层下可见微菌核。拔除时，由于感病根系脆弱，大部分根系将残留在土壤中。去除附着在根部的粗大土壤杂质。将根部分开剪切，并分别收集于标有适当标签的纸信封（27.5 cm × 12 cm）中，然后放入样品采集箱内。
    2. 将样品运输至实验室后，将根系放入200 mL烧杯中，用网筛覆盖（孔径为3 mm的尼龙网筛），并用流动的自来水彻底冲洗根系，以去除附着的土壤颗粒。
    3. 使用反渗透（RO）水在最后冲洗一次。
  3. 表面灭菌
    1. 用手术刀片将根切成四段，每段长约2厘米，放入洁净的200 mL烧杯中。
    2. 组装已灭菌的反渗透水、2% 次氯酸钠、废弃罐和已灭菌的吸水纸（5 cm2在层流室内部。
    3. 用50 mL高压灭菌的反渗透水（RO水）清洗根部三次，然后用50 mL 2% NaOCl处理10分钟。再用50 mL反渗透水清洗根部三次，以去除NaOCl。
    4. 将根部置于经高压灭菌的吸水纸上，吸干水分，直至根部干燥。
  4. 培养基与培养
    1. 用灭菌的手术刀片切除根部的边缘，用刀片将根部切开，并用灭菌镊子将其放置于含硫酸链霉素（50 mg L⁻¹）的马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基平板上-1）和氨苄青霉素（50 mg L-1).
    2. 盖上培养板，用封口膜密封，在28 °C培养箱中避光培养两天。
  5. 菌丝尖端法
    1. 孵育两天后，将培养皿移入超净工作台，剪取菌丝生长尖端8 在体视显微镜（Leica EZ4 教学用体视显微镜）下观察，并将其转移至含硫酸链霉素和氨苄青霉素的新鲜 PDA 平板中。
    2. 将培养皿置于28 °C培养箱中避光培养十天。
  6. 储存与维护 R. bataticola 真菌接种物
    1. 在试管中制备PDA斜面，使用经火焰灭菌的接种环从培养十天的真菌培养皿中转移一块真菌琼脂块。用封口膜密封试管帽。
    2. 在黑暗条件下于28 °C培养斜面10天。
    3. 用封口膜再次密封瓶盖，并于4 °C冰箱中保存以备后续使用。
    4. 每六个月进行一次传代培养以维持真菌活性。
  7. 毒力的维持
    1. 采用病土法所述方法制备的纯真菌接种物对植物进行接种感染3从感病植株中分离出相同的真菌（柯赫氏法则）9 并用于后续实验。
      注意：本研究中使用了一株从田间分离的真菌菌株（GenBank：MH509971.1 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MH509971）

2. 吸水纸法

注意：点样纸法包括液态真菌接种物的制备、幼苗准备以及病害评估。

  1. 液体 R. bataticola 接种物的制备
    注意：液体 R. bataticola 真菌接种物包含菌丝体和微菌核。这两种结构均可作为初生接种源。
    1. 在1,000 mL三角瓶中配制500 mL PDB培养基，并在121 lbs条件下灭菌15分钟。
    2. 待培养基冷却后，用接种环取少量真菌斜面培养物的琼脂块接种至液体培养基中，于28 °C、180 rpm黑暗条件下振荡培养5天。
    3. 在实验台上组装一个已灭菌的玻璃或塑料漏斗（10 cm）、一个1 L锥形瓶以及两层筛网（10 cm2大小）（孔径为3 mm的尼龙筛网）。用该筛网过滤真菌菌丝体和微菌核，并用已灭菌的吸水纸吸干真菌。
    4. 称取100 g菌丝体用于制备50%接种物，并置于室温下保存。
  2. 鹰嘴豆植株的准备
    1. 选取50粒健康种子（本研究中使用的是对DRR敏感的基因型JG 62），放入100 mL烧杯中，并用筛网覆盖。
    2. 先用自来水清洗种子，以去除泥土等杂质。
    3. 将盛有种子的烧杯移入超净工作台，用50 mL灭菌的反渗透（RO）水清洗三次，每次1分钟。
    4. 用50 mL 2%次氯酸钠（NaOCl）水溶液对种子进行2分钟表面灭菌，期间持续摇动，随后用50 mL灭菌水清洗五次，每次1分钟。
    5. 取一个聚乙烯袋（47.5 cm × 25 cm），装入Soilrite（园艺级膨胀珍珠岩、爱尔兰泥炭藓和膨胀蛭石按1/3:1/3:1/3比例混合），将表面灭菌后的50粒种子播种于袋中，深度约2 cm，置于生长室/箱中培养，条件为28 °C ± 2 °C、16小时光周期、光照强度150 μmol m−2 s−1、相对湿度70%。用RO水定期浇灌，并在播种后第8天将植株拔出。
    6. 用自来水冲洗根部以去除Soilrite颗粒，再用灭菌的RO水冲洗根部，然后将根部置于盛有RO水的1000 mL烧杯中备用。
  3. 在托盘中准备吸水纸
    1. 取吸水纸并裁剪成（30 cm × 23 cm）大小的纸片，数量应满足实验重复需求。
    2. 将纸片装入可灭菌的聚乙烯袋 中，在121 lbs条件下灭菌15分钟，随后放入热风烘箱中干燥保存。
    3. 将每张吸水纸对折。
    4. 如图2i-iv所示，将纸张放置于洁净、经酒精擦拭消毒的塑料托盘上。
  4. 浸根法接种植株
    1. 在200 mL烧杯中，将100 g真菌接种物溶解于200 mL已灭菌的RO水中，制成50%接种液。
    2. 将植株根部浸入上述接种液中1分钟，并间歇性上下移动，以确保真菌接种物均匀附着于根部。
  5. 将植株放置于吸水纸上
    1. 用无菌RO水润湿托盘上的吸水纸底部。将植株放置于纸上，确保仅根部被纸包裹，地上部分暴露在外。
    2. 将吸水纸上半部分折叠覆盖根部，并润湿整张纸，以提供足够水分维持植株生长。
    3. 每天向托盘补充一次水，并将托盘置于28 °C环境中。每日观察植株症状，如坏死、根腐和叶片黄化等。

3. 病株盆栽技术

注意：病钵法包括致病接种物和病钵的制备、水分水平的维持以及病害症状的评估。

  1. 底物的制备
    1. 取1 kg市售鹰嘴豆种子，剔除受感染的种子（带有真菌生长、病斑或虫害损伤的种子）。将种子放入5 L塑料烧杯中，用自来水彻底冲洗3–4次，以去除主要杂质。
    2. 用2 L反渗透水清洗种子三次，然后将1 kg种子置于5 L烧杯中，加入三倍体积的水浸泡5小时。
    3. 种子吸水后，用RO水重新清洗三次，以去除种子渗出物。
    4. 彻底去除水分，将种子装入果酱瓶（300 mL，高12 cm，直径6 cm，重155 g）中，装填至约1/4满th 容量（每瓶果酱100克），盖上瓶盖。将十个果酱瓶装入一个可高压灭菌的塑料袋（48 cm × 30 cm）中，于121磅压力下连续高压灭菌两次，每次15分钟。
    5. 在40 °C烘箱中将种子干燥过夜，以去除瓶内的水滴。
  2. 制备病态培养物
    1. 打开BSL-2级层流洁净台，用70%乙醇彻底擦拭台面，并开启紫外灯照射15分钟。随后，将种子置于层流洁净台内。
    2. 取10日龄新鲜分离的 R. bataticola 培养（第一部分）。然后，使用无菌移液器吸头或打孔器取三块真菌琼脂块（直径4 mm），无菌操作接种至果酱瓶中。用瓶盖盖好瓶子，并用封口膜密封。
    3. 轻轻摇晃瓶子，使真菌菌饼与鹰嘴豆种子充分混匀。
    4. 在黑暗条件下于30 °C培养瓶装样品15天。
    5. 取带有黑色真菌生长的果酱瓶（图 4iii）并使用无菌镊子将果酱瓶中受感染的培养物（带有微菌核的种子）转移至玻璃培养皿中，在室温下干燥两天。
    6. 使用研钵和研杵将菌体研磨成粉，并于 4 °C 保存。
    7. 将Soilrite在121磅压力下灭菌两次，每次15分钟。
    8. 在遮阳条件下干燥经高压灭菌的Soilrite混合物。
    9. 将真菌粉末与Soilrite按50%（w/w）混合，将混合物装入花盆中，室温下放置一天。
    10. 每盆（直径10 cm的圆盆）播种一粒表面灭菌的对DRR敏感的鹰嘴豆种子材料表）并保持80%田间持水量（FC）。
    11. 萌发后拔起植株，观察坏死和根腐等症状。
  3. 评估病态锅具的效率
    注意：当根部完全腐烂时，植物会表现出叶片发黄的症状。
    1. 基于病灶（坏死斑点）建立疾病评分补充图 2C)根腐病的病株数量及严重程度。显示90%植株死亡的病盆可继续使用。
  4. 基因型筛选
    1. 大量制备病土，并将其与灭菌的Soilrite或田间土壤按5%（w/w）的比例混合，装入30 cm高的花盆中。加水至土壤表面湿润，静置7天。
    2. 每个10厘米圆形花盆播种一粒表面灭菌的种子，每个30厘米圆形花盆播种三粒表面灭菌的种子，并适量浇水。
    3. 观察叶片黄化及根部腐烂症状。
  5. 干旱与干旱复合胁迫 R. bataticola 感染
    1. 按照 Sinha 等（2019）中所述方案施加干旱胁迫。

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结果

本研究旨在展示诸如吸水纸法和病害盆法等技术，以促进在干旱胁迫条件下对植物-病原物互作的病理形态学和分子机制的理解。为实现这一目标，选取表现出干旱相关病害（DRR）症状的植物1,3,4 从小扁豆田中采集样本，并采用菌丝尖端法分离真菌8. R. bataticola 真菌培养物在PDA平板和斜面上孵育四天后呈深灰色图1A & C）以及在培养五天后于PDB培养基中呈较深的灰色图1B). R. bataticola 具有隔膜的菌丝（图1D），并产生微 sclerotia（图1E），在土壤中作为初始接种...

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讨论

点样滤纸法为在实验室条件下筛选鹰嘴豆基因型提供了一种简便的方法。浸根接种法能够基于时间动态研究互作过程，并可轻松控制接种量（补充图1），同时便于开展体外筛选。此外，即使是幼嫩的幼苗也可用于实验。培养5天的真菌菌体（图1B）即可产生足量的接种物用于植株接种。液体接种物中包含菌丝体和微菌核（图1D & E）。可通过根腐病症状（图3B）对病害严重程度进行评分，并据此鉴定抗性基因型。干旱胁迫是影响根腐病（DRR）发生的主要因素1,3,5。然而，仅依靠该技术无法施加干旱胁迫，因此单独使用该方法进行筛选无法反映自然条件下的真实响应。

病钵法可用于研究...

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披露

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致谢

M.S.K 实验室的项目得到了国家植物基因组研究机构核心资金的支持。VI 感谢 DBT-JRF（DBT/2015/NIPGR/430）项目的支持。我们感谢实习学生 Rishika 女士、Jayachendrayan 先生和 Durgadevi 女士在视频拍摄过程中提供的技术帮助，感谢 Sandeep Dixit 先生、Anjali 女士和 Avanish Rai 博士对原始数据和稿件文件的审阅。我们感谢 Rahim H Tarafdar 先生和 Sunder Solanki 先生在实验室工作中提供的帮助。我们感谢 DBT 电子图书馆联盟（DeLCON）和 NIPGR 图书馆提供电子资源访问权限，以及 NIPGR 植物生长设施为植物培养提供的支持与空间。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
真菌- Rhizoctonia bataticola病原菌接种物印度典型培养物保藏中心编号：8365GenBank: MH509971.1, ITCC 8635 (https://www.iari.res.in/index.php?option=com_content&view=article&
id=1251&Itemid=1370)
Soilrite 培养基混合物实验室用土壤介质Keltech Energies Limited, Bangalore, Indiahttp://www.keltechenergies.com/
滤纸用于支持植物生长的吸水纸Himediahttp://himedialabs.com/catalogue/chemical2017/index.html#374
花盆植物栽培容器10 和 30 cm 规格的花盆常规使用的育苗盆，例如 https://dir.indiamart.com/impcat/nursery-pots.html
马铃薯葡萄糖琼脂/肉汤真菌的培养与保藏Cat# 213400, DifcoTM, MD, USAhttps://www.fishersci.com/shop/products/bd-difco-dehydrated-culture-media-potato-dextrose-agar-3/p-4901946
培养箱真菌培养LOM-150-2, S/N AI13082601-38, MRC, 培养箱与摇床http://www.mrclab.com/productDetails.aspx?pid=91131
生长室在受控条件下培养植物型号 A1000, Conviron, 加拿大https://www.conviron.com/products/gen1000-reach-in-plant-growth-chamber
层流罩进行无菌操作Telstar, Bio II advance, II 级生物安全柜, EN-12469-2000https://www.telstar.com/lab-hospitals-equipment/biological-safety-cabinets/bio-ii-advance-plus/, http://www.atlantisindia.co.in/laminar-air-flow.html
筛网过滤真菌菌丝尼龙蚊帐网孔径为 0.6–1 mm 的筛网
高压灭菌器培养基和鹰嘴豆种子的高压灭菌高压灭菌器http://www.scientificsystems.in/autoclave
显微镜观察侵染过程及真菌菌丝SMZ25 / SMZ18, 研究型体视显微镜, Leica EZ4 教学用体视显微镜https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18

https://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/p/leica-ez4/

https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-80i
电子天平称量真菌和化学试剂Sartorius 电子天平, BSA 4202S-CWhttps://www.sartorius.com/en/products/weighing/laboratory-balances
WGA-FITC真菌染色Sigmahttps://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l4895?lang=en®ion=IN
苯胺蓝真菌染色Himediahttp://www.himedialabs.com/intl/en/products/Chemicals/Dyes-Indicators-and-Stains/Aniline-blue-Water-soluble-Practical-grade-GRM901

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