需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

急性小鼠脑切片以研究海马区自发性网络活动

9.7K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/61704

⸱

2020年8月28日

1Department of Neuroscience, Mortimer B. Zuckerman Mind Brain Behavior Institute, Columbia University

本文内容

摘要

本方案描述了从小鼠中制备表现出自发尖波涟漪活动的水平海马-内嗅皮层（HEC）切片的方法。切片在简化的界面式孵育室中孵育，并在浸没条件下用快速流动的人工脑脊液进行记录，以促进组织供氧及网络水平自发活动的出现。

摘要

急性啮齿类脑切片提供了一种可行的实验方法，可通过电生理学、显微成像和药理学手段，在单细胞分辨率下深入研究神经环路的结构与功能。然而，在实验设计中一个主要的考虑因素是 体外 实验的关键在于不同脑片制备方法在多大程度上能够重现所观察到的自然神经活动模式 体内 在完整的大脑中，海马网络会产生高度同步的群体活动，反映动物的行为状态，例如在清醒的摄食状态或非快速眼动睡眠期间出现的尖波涟漪复合体（SWRs）。在适当条件下，SWRs及其他形式的网络活动可在离体海马脑片中自发产生。为了利用强大的脑片工具研究海马网络活动，必须采用一种能够优化组织健康状态并维持海马网络内功能连接性的方法。实验中对小鼠进行经心脏灌注，使用低温的蔗糖基人工脑脊液。制备包含海马的水平脑片，厚度为450 μm，以保留突触连接性。脑片在界面式孵育室中恢复，随后转移至浸没式记录室进行电生理记录。记录室采用双表面灌流设计，以高流速人工脑脊液灌注，从而改善脑片的氧供。该方案可获得状态良好的脑片组织，适用于复杂且自发性网络活动的研究。 关键词：海马, 脑片, 尖波涟漪, 网络活动, 人工脑脊液, 突触连接性, 小鼠 体外.

引言

活体海马脑片的电生理学测量 体外 是一种功能强大的实验方法，具有多种优势。研究者可利用显微镜、显微操作器和记录系统，直接观察并采集组织中单个神经元的测量数据。组织切片也便于进行光刺激或药物递送，适用于光遗传学、化学遗传学或药理学实验。

海马网络产生高度同步的群体活动 体内，表现为细胞外局部场电位中的振荡1,2,3,4,5脑片方法已被用于深入探究神经元网络振荡背后的细胞和环路机制。Maier 等人的奠基性工作表明，腹侧海马脑片中可自发产生尖波-涟波复合体（SWRs）。6,7后续来自多位研究者的研究逐步阐明了尖波涟漪（SWRs）的多个方面，包括神经调节物质在调控海马网络状态中的作用8,9,10 并驱动突触机制的 体外 在行为过程中先前激活的神经元集合的再激活 体内11脑切片实验还揭示了伽马频段振荡（30–100 Hz），这是一种独特的海马网络状态，被认为有助于记忆的编码与提取。12,13最后，认识到海马体及相关结构在颞叶癫痫发病机制中的核心作用14,15研究人员利用海马脑片制备物来研究癫痫样活动的产生与传播。Carter 等人证明，从慢性癫痫动物制备的海马-内嗅皮层联合脑片可自发产生癫痫样放电。 体外16随后，Karlócai 等人通过使用离子浓度改变的改良人工脑脊液（ACSF）（降低 Mg²⁺ 浓度）研究了海马脑片中癫痫样放电的潜在机制。2+ 或高钾+）或添加的药物（4AP 或 gabazine）17.

研究人员已开发出多种海马脑片制备方法，这些方法在以下几个关键方面存在差异：（1）脑片所包含的海马区域（背侧、中间或腹侧）；（2）是否保留海马外组织，例如内嗅皮层；（3）切片时采用的切割方向（冠状面、矢状面、水平面或斜面）；（4）切片后组织维持的条件（完全浸没在人工脑脊液（ACSF）中，或置于ACSF与湿润含碳氧混合气体的界面环境中）。

选择何种切片方法应根据实验目的来确定。例如，在浸没条件下维持的背侧海马横切片或冠状切片已被有效地用于研究海马内环路及突触可塑性18,19,20。然而，这类制备样本产生网络振荡的自发性不如腹侧海马切片21,22,23。尽管通过强直刺激可在背侧和腹侧海马的横切片中诱导出持续的尖波涟漪（SWR）活动状态24，但自发性SWR在腹侧切片中更易观察到7,25。

大量在体（in vivo）和离体（in vitro）研究均支持背侧与腹侧海马之间存在固有的生理学和解剖学差异26。在大鼠中进行的记录显示，背侧和中间海马区域普遍存在高度同步的θ节律，而腹侧区域与海马其余部分之间的同步性则较差27。在体（in vivo）条件下，尖波涟漪（SWRs）可在背侧与中间海马之间顺利传播，而起源于腹侧海马的SWRs则通常局限于局部28。起源于背侧和中间海马CA3区锥体神经元的联合投射，沿海马纵轴投射较长距离；而起源于腹侧区域的CA3投射则相对局限于局部，因此在切片过程中较不易被切断29,30。因此，腹侧切片可能更完整地保留了产生群体同步性所必需的反馈神经网络。腹侧切片在离体（in vitro）条件下易于产生自发性网络活动，也可能反映了腹侧海马锥体神经元具有更高的内在兴奋性，或GABA能抑制作用较背侧区域更弱31。事实上，腹侧海马切片更容易出现类癫痫样活动32,33。因此，许多关于自发性生理8,9,11,24或病理16,34,35,36网络振荡的研究传统上采用水平切片方法，有时略微偏向前后方向倾斜，以获得与腹侧海马横断面平行的组织切片。

由于切片过程中许多细胞会被切断，网络连接性不可避免地受到影响。为了优化目标环路中的连接性，应考虑切片的角度、厚度以及制备中保留的脑组织区域。许多研究采用水平方向联合的海马-内嗅皮层切片（HEC）来探究在生理或病理网络振荡背景下这两个结构之间的相互作用。Roth 等人通过对海马 CA1 区和内侧内嗅皮层第 V 层进行双记录，证明了尖波涟漪（SWR）活动在 HEC 切片中的传播37。大量关于癫痫样活动的研究利用 HEC 切片制备模型，以研究癫痫样放电如何在皮层-海马网络中传播16,35,36,38。需要强调的是，完整的皮层-海马环路并非自发产生尖波涟漪、癫痫样放电或伽马振荡的必要前提；即使不附着旁海马组织，背侧或腹侧海马的横切片也能产生网络振荡21,22,23, 25,39,40,41。对于海马切片中网络振荡的自发产生而言，一个更为重要的因素可能是切片的厚度，因为较厚的切片（400–550 μm）能够更好地保留 CA2/CA3 区段的复发性网络连接性21,22,25。

尽管倾斜的水平 HEC 切片（以大约 12° 的角度沿前后方向切割）已被用于研究皮质-海马环路的功能连接性11,16,34,35,42，但研究自发性网络活动时并不需要此类倾斜切片43,44,45。然而，采用倾斜切片平面可使研究者选择性地制备出最佳保留腹侧或中间海马横行排列的层状结构的切片，具体取决于使用向下或向上的倾斜角度（图 1）。该方法在概念上类似于 Papatheodoropoulos 等人（2002 年）所采用的方法，即先将每个海马游离解剖，然后使用组织切片机沿整个背-腹轴方向制备横切切片21。鉴于上述腹侧与背侧-中间海马之间的功能差异，研究者在设计实验或解释结果时应考虑切片的解剖学来源。在切片过程中使用琼脂斜坡是一种优先制备中间或腹侧海马切片的简便方法。

海马脑片可保存在浸没式切片记录室（组织完全浸没于人工脑脊液中）或界面式切片记录室（例如奥斯陆室或哈斯室，脑片仅被一层薄薄的流动液体覆盖）。界面式保存方式可增强组织的供氧，促进神经元存活，并支持神经元间持续高水平的活动。传统上，浸没式记录条件采用较慢的人工脑脊液流速，无法为网络水平振荡的稳定表达提供足够的组织供氧。在浸没式海马脑片中，卡巴可诱导的伽马振荡仅能短暂观察到。46,47，而它们可以在界面式记录室中稳定维持10,48,49因此，许多关于复杂自发活动的研究 体外 依赖界面记录室来研究尖波涟漪复合体6,7,8,9,10,25,37，γ振荡10,13和癫痫样活动16,38,45,47.

在浸没式记录室中，可使用浸液物镜观察单个细胞，并选择性地针对外观健康的细胞进行记录。浸没式制备还允许对细胞微环境进行精细控制，因为浸没状态有助于药物或其他化合物快速扩散至组织。因此，一种在浸没条件下维持稳定网络振荡的改良方法代表了一种强大的实验手段。Hájos 等人的研究即为此方法的范例：海马脑片首先在简化的界面式孵育室中恢复数小时，然后转移至经改良的浸没式记录室，其中人工脑脊液（ACSF）以高流速（约 6 mL/min）灌注，以增强组织的氧气供应12,48,49。在此条件下，可在浸没式记录室中维持中间神经元的高水平活动以及稳定的自发性网络振荡。这种改良方法使研究人员能够进行视觉引导的全细胞膜片钳记录，并鉴定经形态学识别的细胞类型在卡巴胆碱诱导的γ振荡中的作用12。快速ACSF灌注的浸没式海马脑片中也可自发产生尖波涟漪（SWRs）11,48,49。Maier 等人证明，从界面式孵育室转移至浸没式记录室的海马脑片能够稳定地表现出自发性SWRs，而那些在烧杯中浸没恢复后再转移至浸没式记录室的脑片，则表现出较弱的诱发场电位反应、较低水平的自发突触电流，且极少出现自发性SWRs43。Schlingloff 等人利用这一改进的方法，揭示了表达小清蛋白的篮状细胞在自发性SWRs产生中的关键作用44。

以下方案介绍了一种切片方法，该方法可在界面条件下获得水平海马脑片中自发活动的神经元，并随后将其维持在浸没式记录室中，适用于药理学或光遗传学操作以及视觉引导下的记录。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

本文所述所有方法均已获得哥伦比亚大学机构动物护理和使用委员会（AC-AAAU9451）的批准。

1. 准备溶液

  1. 按照表1所述配制用于切片的蔗糖切割溶液。
    注意：配制1 L蔗糖溶液后，将少量（约100–200 mL）倒入冰格中冷冻。这些冷冻的蔗糖冰块将在后续步骤中被打碎成冰沙状混合物（见步骤4.3）。
  2. 按照表2所述配制用于记录的人工脑脊液（ACSF）。
  3. 通过将0.05844 g NaCl溶解于1 mL已过滤去除痕量金属及其他杂质的纯化水中，配制1 M NaCl溶液，用于刺激电极。
    注意：每次实验均应新鲜配制蔗糖切割溶液和ACSF。

2. 准备琼脂斜面

  1. 通过将琼脂粉溶解于已过滤去除痕量金属及其他杂质的纯化水中，制备4%的琼脂溶液（例如，2 g琼脂加入50 mL水中）。将混合物放入微波炉加热至即将沸腾（约30–60秒）。将熔化的琼脂倒入模具中，并在冰箱中于4 °C、约12°倾斜条件下冷却并凝固。
    注意：模具可使用任何倾斜放置的玻璃或塑料容器，倒入足量的熔化琼脂，以形成长度为4 cm、高度约为0.8 cm的斜面。

3. 准备切片区域

  1. 用约 250 mL 的 ACSF 填充一个装有切片回收室的 400 mL 烧杯；将其置于 32 °C 的水浴中，并开始用碳合气（95% 氧气 / 5% 二氧化碳）持续通气。
    注意：向回收烧杯中加入适量液体，使固定室的尼龙网刚好位于溶液表面，从而让脑片保持在温热溶液与空气交界处（图 1）。在尼龙网上放置少量滤纸片，脑片将置于滤纸片上方，后续可用滤纸片单独转移脑片至记录室（见步骤 6.6）。
  2. 将装有蔗糖溶液的烧瓶放入冰桶中冷却，并开始用碳合气通气。
    注意：在将小鼠放入异氟烷室前至少 30 分钟，应分别对回收烧杯进行预热、对蔗糖溶液进行预冷，并持续通入碳合气。
  3. 从冰箱中取出预先制备并冷冻的蔗糖溶液冰块托盘，放置在实验台上使其部分解冻。
  4. 将半片洁净的双面剃须刀片装入切片机中，必要时进行校准。将另一半刀片留出，供解剖过程中使用。
  5. 将碳合气导管和温度探头接入切片室，并用冰包围以冷却切片室。
  6. 准备一张洁净的实验台或桌子，表面覆盖两层一次性吸水垫。在左侧吸水垫上摆放所有解剖工具及三段实验室胶带，用于进行心脏灌流操作。
    注意：解剖工具包括小型博恩剪刀、解剖剪、大刮勺/勺状器械、微型刮勺、带新刀片的手术刀、刮刀、锐利/钝头外科剪、大组织镊和小组织镊（见 材料表）。
  7. 在灌流区域右侧的另一吸水垫上，将一张圆形滤纸放入直径为 100 mm 的玻璃培养皿盖内。将培养皿底部置于盖子旁，并将碳合气导管插入培养皿的盖子和底部中。
  8. 使用剃须刀片或手术刀切割一块小型琼脂斜坡（斜面长约 4 cm，高约 0.8 cm，宽约 2 cm）。从较高一端切下一小块琼脂斜坡并翻转，作为琼脂支撑块。使用氰基丙烯酸盐粘合剂将琼脂斜坡和支撑块固定在切片平台上，备用。
    注意：琼脂支撑块有助于在切片过程中稳定脑组织，并为逐片去除多余组织提供操作表面（图 1）。

4. 经心灌注

  1. 将一个容量为 60 mL 的注射器作为蔗糖切片液的储液罐，悬挂在实验台面上方约 18 英寸处（例如，使用垂直支架上的三爪旋转夹）。将管路连接至储液罐底部，穿过滚轴夹，再将管路另一端连接至一根洁净的 20 G 针头。
  2. 向 60 mL 储液罐中加入约 30 mL 冰冷的蔗糖溶液，并将碳氧混合气（carbogen）导管插入蔗糖储液罐中，持续向灌注液中通气鼓泡。
    注意：确保蔗糖溶液在管路和针头中流动顺畅，无气泡滞留。流速应调节至刚好使针头持续稳定地滴出蔗糖液滴。
  3. 使用搅拌器将冷冻的蔗糖打碎并搅拌成冰浆状，然后用大刮勺或大勺将冰浆均匀铺开。
    1. 在玻璃培养皿盖的边缘周围放置少量蔗糖冰浆，并在培养皿底部也加入少量蔗糖冰浆。
    2. 向灌流液储液罐中加入约 20–30 mL 蔗糖冰浆，与其中 30 mL 冰冷液态蔗糖充分混合，使储液罐内形成以极冷液态蔗糖为主、含有少量未完全融化的冷冻成分的混合液。
  4. 将小鼠放入与异氟烷蒸发器相连的麻醉室中。以约 2 L/min 的流速通入氧气，将蒸发器旋钮调至输出 5% 浓度的异氟烷，并启动计时器。
    注意：在整个切片过程中保持计时器运行，以评估获取切片的速度。整个操作应尽快完成，确保在小鼠进入异氟烷麻醉室后的 15–20 分钟内完成切片，并将组织转移至界面式孵育室中恢复。观察小鼠状态，确保其达到深度麻醉。至少 5 分钟后，小鼠应处于深度麻醉状态，对脚趾夹捏无反应。
  5. 在将小鼠从异氟烷麻醉室中取出前，立即向培养皿盖中加入冰冷蔗糖溶液，深度约为 3–5 mm；向培养皿底部加入冰冷蔗糖溶液，深度约为 1.0 cm。
  6. 迅速将小鼠转移至左侧吸水垫上，使用三段胶带固定前肢和尾巴。进行后肢脚趾夹捏测试，确认小鼠无反应后方可进行任何切口。 使用大号组织镊和手术剪，提起皮肤并沿胸骨下缘至胸部顶端做纵向切口。用镊子提起胸骨，用剪刀剪开膈肌。
    注意：为防止小鼠恢复意识，应尽快完成小鼠的初始定位及切断膈肌的前几个切口。 为确保整个操作过程中麻醉深度足够，可在灌流期间将鼻罩置于小鼠鼻部以持续给予异氟烷。
  7. 用剪刀从两侧剪开肋骨，以一次大幅度动作剪至前肢与躯干连接处。用镊子将胸骨前部向上并向头部方向掀开，再用大剪刀水平剪切将其完全移除。用大镊子固定心脏位置，将 20 G 灌流针插入左心室。当针头位置正确时，随着冰冷蔗糖溶液注入心室，心脏左侧应迅速变苍白。
  8. 使用小型解剖剪剪开右心房，使血液从循环系统中流出。若切口操作正确，心脏应无明显损伤，并在整个灌流过程中持续跳动。
    注意：可使用卷成小团的纸巾吸除心脏周围的血液和蔗糖溶液，以保持操作视野清晰，便于观察灌流针位置。
  9. 确保灌流针保持在原位，不从左心室脱落。若流速和位置合适，肝脏将在 20–30 秒内开始变苍白，呈现浅黄褐色或米色。
  10. 30–45 秒后，使用大剪刀将小鼠断头。左手握住头部，将皮肤从颅骨上推起或剥离。在灌流充分的小鼠中，颅骨应非常苍白，透过颅骨可见脑组织呈极淡的粉红色（接近白色），且无明显可见的血管。

5. 取出脑组织并切片

  1. 使用小型邦氏剪刀，在靠近眼睛的颅骨前部，从两侧向中线方向在颅骨上做两个侧向切口。在颅骨基部两侧再做两个额外的切口。
  2. 将头部转移至玻璃培养皿底部，使其大部分浸没在冰冷的蔗糖溶液中。使用小型邦氏剪刀沿颅骨全长的中线向下剪开，同时轻轻上提剪刀以尽量减少对下方脑组织的损伤。用小型组织镊子牢固夹住颅骨两侧，像打开一本书一样将颅骨向上并向两侧掀开。
  3. 用左手手指固定颅骨切开的骨瓣使其保持张开，将微型解剖刀片插入嗅球附近的脑组织下方。将脑组织翻出至蔗糖溶液中，并用微型解剖刀片切断脑干。清洗脑组织以去除任何残留的血液、毛发或其他组织。
  4. 使用大号刮刀/勺子将脑组织转移至玻璃培养皿盖上。取之前预留的双面剃须刀片的另一半，进行两次冠状面切削，首先切除小脑，然后切除包括嗅球在内的最前部脑组织（图1）。
  5. 在琼脂斜坡上涂抹氰基丙烯酸酯粘合剂。用大号组织镊子将脑组织短暂地放置在一片干燥滤纸上，随后立即转移至琼脂斜坡上，使脑腹侧面贴附于粘合剂上。
    注意：若需制备中间部位海马体切片，应将脑组织朝向斜坡上方放置（即前部朝上），后部靠近刀片；若需制备腹侧海马体切片，则应将脑组织前部朝下指向斜坡方向，后部位于斜坡顶端，离刀片更远。无论哪种情况，脑组织均应置于斜坡顶部，使脑的冠状切面与琼脂背衬块接触（图1）。
  6. 将带有琼脂和脑组织的切片平台放入切片机的切片室中，并完全浸入冰冷的蔗糖溶液中。使用大号刮刀/勺子向切片室中加入一些蔗糖浆液，搅拌以融化可能冻结的蔗糖，并迅速将混合液温度降至约1–2 °C。
    注意：在整个切片过程中密切观察温度计。若蔗糖溶液温度超过3 °C，应添加更多浆液并搅拌，使温度重新降低。
  7. 使用切片机以450 μm厚度、0.07 mm/s的切片速度进行切片。每当一片组织被切下时，使用小型组织镊子和锋利的手术刀片，先将两个半球分开，然后切除多余组织，直至切片主要包含海马体及旁海马区域（图1）。
  8. 使用塑料移液管将切片逐一转移至界面式恢复室中，确保切片位于人工脑脊液（ACSF）与空气的交界处，仅有薄层弯月面的ACSF覆盖切片表面。紧密关闭恢复室盖子，使切片在32 °C条件下恢复30分钟。
  9. 在32 °C初始恢复后，将界面式恢复室从水浴中取出，放置于低速搅拌器上，使磁力搅拌子在室内促进ACSF循环。让其随切片继续恢复过程逐渐冷却至室温，持续90分钟。确保恢复室持续通入碳合气（carbogen），并避免大气泡滞留在切片下方。

6. 记录自发活动的局部场电位（LFP）

  1. 开启所有必要的设备以准备局部场电位（LFP）记录，包括运行采集软件的计算机、连接至计算机的显示器、刺激器、显微操作器、温度控制器、显微镜光源、显微镜连接的相机、微电极放大器、数字化器以及蠕动泵。若使用中央真空系统，请打开墙壁阀门，以准备用于从记录室中移除人工脑脊液（ACSF）的真空管路。
  2. 将加热储液槽用 ACSF 注满，然后将一段导管的一端插入盛有持续通氧 ACSF 的 400 mL 烧杯中。启动蠕动泵，使 ACSF 从 400 mL 烧杯流入加热储液槽，并进一步输送至记录室。轻敲或捏压导管以排出任何滞留的气泡。
  3. 调节蠕动泵，确保通过记录室的 ACSF 流速较快（约 8–10 mL/min）。使用温度探头确保记录室中心位置的 ACSF 温度为 32 °C。
    注意：若使用蠕动泵向记录室输送 ACSF，较高的流速可能导致流量显著波动。可通过在管路中集成一组空注射器构成简单的脉动阻尼器，以实现稳定的流速（图2）。
  4. 使用加热丝拉制仪从硼硅酸盐玻璃毛细管制备刺激电极和记录电极。拉制程序应设置为获得电阻为 2–3 MΩ 的电极，适用于刺激或局部场电位记录。
  5. 用 1 M NaCl 填充刺激电极，用 ACSF 填充 LFP 记录电极。
  6. 短暂夹闭导管并关闭泵以暂停 ACSF 流动。使用精细镊子夹住切片下方的滤纸一角，将脑片转移至记录室（切片会粘附在滤纸上）。将滤纸与脑片一同放入记录室，使脑片朝下，然后“剥离”滤纸，使脑片完全浸没于记录室中。使用固定网（harp）固定脑片。
    注意：固定网可购买成品，也可在实验室内使用U形不锈钢或铂金丝及细尼龙丝自制。
  7. 将装有 NaCl 溶液的刺激电极置于手动显微操作器上，并以约 30–45° 的角度缓慢将其尖端推进至脑片表面（例如进入stratum radiatum层）。一旦电极尖端进入组织，应缓慢向前推进，避免在横向或垂直方向进行大幅度移动，以防对切片内轴突造成不必要的损伤。将电极尖端置于脑片下至少 50–100 μm 深度，以避开切片过程中受损的表层细胞。
  8. 将装有 ACSF 的 LFP 电极插入连接至电动显微操作器的电极夹持器中。通过口吸压力或连接三通阀及短段导管的 1 mL 注射器，对电极施加轻微的正压。
    注意：为记录目标信号，应将 LFP 电极置于脑片内的适当位置：例如在记录尖波涟漪（sharp wave ripples）时，一个 LFP 电极应置于stratum pyramidale（SP）层，另一个电极置于stratum radiatum（SR）层。该配置可同时记录 SR 层的负向尖波和 SP 层的高频涟漪振荡（图3）。
  9. 使用显微操作器以约 30–45° 的角度缓慢将 LFP 电极尖端推进至目标区域（例如 CA1 锥体细胞层）。将电极尖端置于脑片下至少 50–100 μm 深度，以避开切片过程中受损的表层细胞。在推进 LFP 电极过程中，持续通过采集软件施加小电压测试脉冲，并观察电极电阻是否突然升高。该现象可能提示电极被堵塞或压紧在细胞上。
  10. 当 LFP 电极定位至目标区域后，通过打开连接电极夹持器的导管阀门，小心释放正压。
  11. 为在第二个位置同时记录 LFP，使用第二个电极和显微操作器重复步骤 6.8–6.10。
  12. 使用微电极放大器在电流钳模式下记录局部场电位的自发活动，需先通过采集软件中的桥平衡功能校正电极的串联电阻。自发尖波涟漪（SWRs）在 SP 层的细胞外电位中表现为正向偏转（图3）。
  13. 为记录诱发电位，使用连接至数字化器的刺激器，通过装有 NaCl 的刺激电极施加短暂（200 μs）的方波电压脉冲。调节刺激电压旋钮，以诱发不同幅度的反应 。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

本文展示了按照本方案所述方法制备的海马脑片（HEC）的代表性记录结果。脑片在界面式孵育室中恢复后（图1C），被逐一转移至浸没式记录室（图2B）。记录室通过蠕动泵持续灌流经碳合气（carbogen）饱和的人工脑脊液（ACSF）（图2A）。蠕动泵首先将ACSF从储存烧杯抽入加热储液罐中。碳合气管路同时插入储存烧杯和加热储液罐，以确保灌流液持续氧合。在蠕动泵与记录室之间安装一个由多个充满空气的注射器组成的脉动阻尼器，以减少因快速蠕动引起的流速波动。每个注射器内的气腔可吸收泵每周期运行所产生的压力变化，从而使记录室获得平稳且稳定的ACSF灌流52,53。在脉动阻尼器之后设置的管路加热器可确保ACSF进入记录室时温度维持在32 °C。

在此示例中，双表面灌流记录室由三个3D打印层组成（

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本切片方案包含多个步骤，旨在促进组织健康并有利于自发性自然网络活动的出现：用预冷的蔗糖切片液对小鼠进行经心脏灌注；从中间或腹侧海马区切取厚度为450 μm的水平内嗅皮层（HEC）脑片；脑片在加温的人工脑脊液（ACSF）与湿润、富含碳合气（carbogen）的空气交界面进行恢复；记录过程中，脑片置于浸没式记录室中，采用双表面灌流方式，以较快流速持续灌注加热至32 °C的ACSF。

脑片的健康状态对于体外网络振荡的产生至关重要。in vitro。年轻动物能获得更健康的脑片，通常在幼年或青春期小鼠中可省略经心灌注步骤。随着动物年龄增长，制备健康脑片的难度逐渐增加，然而某些研究（如疾病模型或纵向研究）必须使用成年或衰老动物。例如，Dengler 等人在制备由匹鲁卡品处理的慢性癫痫成年小鼠的 HEC 脑片时，采用了经心灌注方法50。对于成年小鼠，使用预冷的蔗糖切割液进行经心灌注有助于冷却组织、清除脑内血液并降低代谢活性，从而在取出脑组织前改善脑片质量51。然而需要注意的是，经心灌...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢 Steve Siegelbaum 提供的支持。本研究由项目 5R01NS106983-02 和 1 F31 NS113466-01 资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3D 打印机LulzbotLulzBot TAZ 6
急性脑切片孵育支架NIH 3D 打印交换平台3DPX-001623由 ChiaMing Lee 设计，可从 https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623 获取
腺苷-5′-三磷酸镁盐Sigma AldrichA9187-500MG
银-氯化银接地电极颗粒Warner64-1309, (E205)
琼脂Becton, Dickinson214530-500g
抗坏血酸Alfa Aesar36237
烧杯（250 mL）Kimax14000-250
烧杯（400 mL）Kimax14000-400
生物素标记物（biocytin）Sigma AldrichB4261
搅拌机OsterBRLY07-B00-NP0
小型邦氏剪刀Becton, Dickinson14184-09
带丝硼硅酸盐玻璃毛细管（外径 1.5 mm，内径 0.86 mm，长度 10 cm）Sutter InstrumentsBF150-86-10HP建议使用火焰抛光的毛细管。
氯化钙溶液（1 M）G-BiosciencesR040
相机OlympusOLY-150
压缩碳合气（95% 氧气 / 5% 二氧化碳）AirgasX02OX95C2003102
压缩氧气AirgasOX 200
恒压隔离刺激器Digitimer Ltd.DS2A-Mk.II
盖玻片（22×50 mm）VWR16004-314
氰基丙烯酸酯粘合剂Krazy GlueKG925理想情况下使用刷涂型以提高精度
数据采集软件AxographN/A任何等效软件（例如 pClamp）均可使用。
Dell Precision T1500 塔式工作站台式机DellN/A目录号取决于具体计算机型号——只要能运行电生理数据采集软件，任何计算机均可使用。
Digidata 1440AMolecular Devices1-2950-0367
数字计时器VWR62344-6414 通道 Traceable 计时器
一次性吸水垫VWR56616-018
解剖剪刀Fine Science Tools14082-09
双刃剃须刀片PersonnaBP9020
双通道自动温度控制器Warner Instrument CorporationTC-344B
双面或层流优化记录室N/AN/A本方案中使用的记录室为定制。商业等效产品为 Warner Instruments 的 RC-27L。
设备机架Automate ScientificFR-EQ70"机架并非绝对必要，但有助于组织电生理设备
乙二醇双（2-氨基乙醚）四乙酸（EGTA）Sigma Aldrich324626-25GM
滤纸Whatman1004 070
精密天平Mettler ToledoXS204DR
Flaming/Brown 微电极拉制仪Sutter InstrumentsP-97
玻璃培养皿（100 × 15 mm）Corning3160-101
葡萄糖Fisher ScientificD16-1
鸟苷-5′-三磷酸钠盐水合物Sigma AldrichG8877-250MG
冰桶Sigma AldrichBAM168072002-1EA
异氟烷蒸发器General Anesthetic ServicesTec 3
实验室胶带Fisher Scientific15-901-10R
镜头纸Fisher Scientific11-996
光源OlympusTH4-100
氯化镁溶液（1 M）Quality Biological351-033-721EA
磁力搅拌子Fisher Scientific14-513-56目录号取决于搅拌子的尺寸。
微操纵器Luigs & NeumannSM-5
微操纵器（手动）ScientificaLBM-2000-00
显微镜OlympusBX51WI
微型刮铲Fine Science Tools10089-11
显示器Dell2007FPb
MultiClamp 700B 微电极放大器Molecular DevicesMULTICLAMP 700BMultiClamp 700B 应包含前置放大器、移液管夹持器和模型细胞。
N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)（HEPES）Sigma AldrichH3375-25G
针头（20 号，长度 1.5 英寸）Becton, Dickinson305176
尼龙丝线YLI Wonder Invisible Thread212-15-004规格 0.004。此目录号来自 Amazon.com
尼龙网Warner Instruments Corporation64-0198
蠕动泵Harvard Apparatus70-2027
磷酸肌酸二(三羟甲基氨基甲烷)盐Sigma AldrichP1937-1G
移液管夹持器Molecular Devices1-HL-U
铂丝World PrecisionPT0203
聚乳酸（PLA）耗材丝UltimakerRAL 9010
氯化钾Sigma AldrichP3911-500G
葡萄糖酸钾Sigma Aldrich1550001-200MG
氢氧化钾Sigma Aldrich60377-1KG
剃须刀片VWR55411-050
滚轴夹World Precision Instruments14041
天平Mettler ToledoPM2000
手术刀柄Fine Science Tools10004-13
切片固定架（slice harp）WarnerSHD-26GH/2
碳酸氢钠Fisher ChemicalS233-500
氯化钠Sigma AldrichS9888-1KG
无水磷酸二氢钠Fisher ChemicalS369-500
丙酮酸钠Fisher ChemicalBP356-100
刮铲VWR82027-520
大刮铲/药匙VWR470149-442
无菌手术刀片Feather72044-10
搅拌器/加热板Corning6795-220
单向旋塞阀World Precision Instruments14054
三通旋塞阀World Precision Instruments14036
蔗糖Acros OrganicsAC177142500
旋转夹具支架Fisher Scientific14-679Q
锐/钝外科剪刀Fine Science Tools14001-12
注射器（1 mL）Becton, Dickinson309659
注射器（60 mL，带鲁尔锁接头）Becton, Dickinson309653
三叉夹Fisher Scientific05-769-8Q
大组织镊Fine Science Tools11021-15
小组织镊Fine Science Tools11023-10
移液管Fisher Scientific13-711-7M
管路TygonE-3603内径 1/16 英寸，外径 3/16 英寸
管路TygonR-3603内径 1/8 英寸，外径 1/4 英寸
真空润滑脂Dow Corning14-635-5D
振动刀片切片机LeicaVT 1200S
带法拉第笼的减震台Micro-G / TMC-ametek2536-516-4-30PE
容量瓶（1 L）KimaxKIM-28014-1000
容量瓶（2 L）PYREX65640-2000
温水浴VWR1209
 

参考文献

  1. Buzsáki, G., Lai-Wo, S., Vanderwolf, C. H. Cellular bases of hippocampal EEG in the behaving rat. Brain Research Reviews. 6, 139-171 (1983).
  2. Buzsáki, G. Hippocampal sharp waves: Their origin and significance. Brain Research. 398, 242-253 (1986).
  3. Buzsáki, G., Horváth, Z., Urioste, R., Hetke, J., Wise, K. High-frequency network oscillation in the hippocampus. Science. 256, 1025-1027 (1992).
  4. Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents — EEG, ECoG, LFP and spikes. Nature Reviews Neuroscience. 13, 407-420 (2012).
  5. Buzsáki, G. Hippocampal sharp wave-ripple: A cognitive biomarker for episodic memory and planning. Hippocampus. 25, 1073(2015).
  6. Maier, N., et al. Reduction of high-frequency network oscillations (ripples) and pathological network discharges in hippocampal slices from connexin 36-deficient mice. Journal of Physiology. 541, 521-528 (2002).
  7. Maier, N., Nimmrich, V., Draguhn, A. Cellular and network mechanisms underlying spontaneous sharp wave-ripple complexes in mouse hippocampal slices. Journal of Physiology. 550, 873-887 (2003).
  8. ul Haq, R., et al. Adrenergic modulation of sharp wave-ripple activity in rat hippocampal slices. Hippocampus. 22, 516-533 (2012).
  9. ul Haq, R., et al. Serotonin dependent masking of hippocampal sharp wave ripples. Neuropharmacology. 101, 188-203 (2016).
  10. Maier, P., Kaiser, M. E., Grinevich, V., Draguhn, A., Both, M. Differential effects of oxytocin on mouse hippocampal oscillations in vitro. European Journal of Neuroscience. 44, 2885-2898 (2016).
  11. Mizunuma, M., et al. Unbalanced excitability underlies offline reactivation of behaviorally activated neurons. Nature Neuroscience. 17, 503-505 (2014).
  12. Hájos, N., et al. Spike timing of distinct types of GABAergic interneuron during hippocampal gamma oscillations in vitro. Journal of Neuroscience. 24, 9127-9137 (2004).
  13. Geschwill, P., et al. Synchronicity of excitatory inputs drives hippocampal networks to distinct oscillatory patterns. Hippocampus. , (2020).
  14. Rutecki, P. A., Grossmann, R. G., Armstrong, D., Irish-Loewen, S. Electrophysiological connections between the hippocampus and entorhinal cortex in patients with complex partial seizures. Journal of Neurosurgery. 70, 667-675 (1989).
  15. Lothman, E. W., Bertram, E. H., Stringer, J. L. Functional anatomy of hippocampal seizures. Progress in Neurobiology. 37, 1-82 (1991).
  16. Carter, D. S., Deshpande, L. S., Rafiq, A., Sombati, S., Delorenzo, R. J. Characterization of spontaneous recurrent epileptiform discharges in hippocampal - cortical slices prepared from chronic epileptic animals. Seizure: European Journal of Epilepsy. 20, 218-224 (2011).
  17. Karlócai, M. R., et al. Physiological sharp wave-ripples and interictal events in vitro: What's the difference. Brain. 137, 463-485 (2014).
  18. Leroy, F., et al. Input-timing-dependent plasticity in the hippocampal CA2 region and its potential role in social memory. Neuron. 95, 1089-1102 (2017).
  19. Sun, Q., et al. Proximodistal heterogeneity of hippocampal CA3 pyramidal neuron intrinsic properties, connectivity, and reactivation during memory recall. Neuron. 95, 656-672 (2017).
  20. Masurkar, A. V., et al. Medial and lateral entorhinal cortex differentially excite deep versus superficial CA1 pyramidal neurons. Cell Reports. 18, 1-13 (2017).
  21. Papatheodoropoulos, C., Kostopoulos, G. Spontaneous, low frequency (∼2-3 Hz) field activity generated in rat ventral hippocampal slices perfused with normal medium. Brain Research Bulletin. 57, 187-193 (2002).
  22. Papatheodoropoulos, C., Kostopoulos, G. Spontaneous GABAA-dependent synchronous periodic activity in adult rat ventral hippocampal slices. Neuroscience Letters. 319, 17-20 (2002).
  23. Kubota, D., Colgin, L. L., Casale, M., Brucher, F. A., Lynch, G. Endogenous waves in hippocampal slices. Journal of Neurophysiology. 89, 81-89 (2003).
  24. Behrens, C. J., Van Den Boom, L. P., De Hoz, L., Friedman, A., Heinemann, U. Induction of sharp wave - complexes in vitro and reorganization of hippocampal networks. Nature Neuroscience. 8, 1560-1567 (2005).
  25. Kouvaros, S., Papatheodoropoulos, C. Prominent differences in sharp waves, ripples and complex spike bursts between the dorsal and the ventral rat hippocampus. Neuroscience. 352, 131-143 (2017).
  26. Strange, B. A., Witter, M. P., Lein, E. S., Moser, E. I. Functional organization of the hippocampal longitudinal axis. Nature Reviews Neuroscience. 15, 655-669 (2014).
  27. Patel, J., Fujisawa, S., Berényi, A., Royer, S., Buzsáki, G. Traveling Theta Waves along the Entire Septotemporal Axis of the Hippocampus. Neuron. 75, 410-417 (2012).
  28. Patel, J., Schomburg, E. W., Berényi, A., Fujisawa, S., Buzsáki, G. Local generation and propagation of ripples along the septotemporal axis of the hippocampus. Journal of Neuroscience. 33, 17029-17041 (2013).
  29. Fricke, R., Cowan, W. M. An autoradiographic study of the commissural and ipsilateral hippocampo-dentate projections in the adult rat. Journal of Comparative Neurology. 181, 253-269 (1978).
  30. Ishizuka, N. O. R., Weber, J., Amaral, D. G. Organization of intrahippocampal projections originating from CA3 pyramidal cells in the rat. The Journal of Comparative Neurology. 623, 580-623 (1990).
  31. Papatheodoropoulos, C. Electrophysiological evidence for long-axis intrinsic diversification of the hippocampus. Frontiers in Bioscience - Landmark. 23, 109-145 (2018).
  32. Gilbert, M., Racine, R. J., Smith, G. K. Epileptiform burst responses in ventral vs dorsal hippocampal slices. Brain Research. 361, 389-391 (1985).
  33. Papatheodoropoulos, C., Moschovos, C., Kostopoulos, G. Greater contribution of N-methyl-D-aspartic acid receptors in ventral compared to dorsal hippocampal slices in the expression and long-term maintenance of epileptiform activity. Neuroscience. 135, 765-779 (2005).
  34. Jones, R. S. G., Heinemann, U. Synaptic and intrinsic responses of medial entorhinal cortical cells in normal and magnesium-free medium in vitro. Journal of Neurophysiology. 59, (1988).
  35. Rafiq, A., Delorenzo, R. J., Coulter, D. A. Generation and propagation of epileptiform discharges in a combined entorhinal cortex / hippocampal slice. Journal of Neurophysiology. 70, 1962-1974 (1993).
  36. Stoop, R., Pralong, E. Functional connections and epileptic spread between hippocampus, entorhinal cortex and amygdala in a modified horizontal slice preparation of the rat brain. European Journal of Neuroscience. 12, 3651-3663 (2000).
  37. Roth, F. C., Beyer, K. M., Both, M., Draguhn, A., Egorov, A. V. Downstream effects of hippocampal sharp wave ripple oscillations on medial entorhinal cortex layer V neurons in vitro. Hippocampus. 26, 1493-1508 (2016).
  38. Bertsche, A., Bruehl, C., Pietz, J., Draguhn, A. Region- and pattern-specific effects of glutamate uptake blockers on epileptiform activity in rat brain slices. Epilepsy Research. 88, 118-126 (2010).
  39. Wu, C., Shen, H., Luk, W. P., Zhang, L. A fundamental oscillatory state of isolated rodent hippocampus. Journal of Physiology. 540, 509-527 (2002).
  40. Colgin, L. L., Jia, Y., Sabatier, J. M., Lynch, G. Blockade of NMDA receptors enhances spontaneous sharp waves in rat hippocampal slices. Neuroscience Letters. 385, 46-51 (2005).
  41. Ellender, T. J., Nissen, W., Colgin, L. L., Mann, E. O., Paulsen, O. Priming of hippocampal population bursts by individual perisomatic-targeting interneurons. The Journal of Neuroscience. 30, 5979-5991 (2010).
  42. Xiong, G., Metheny, H., Johnson, B. N., Cohen, A. S. A. Comparison of different slicing planes in preservation of major hippocampal pathway fibers in the mouse. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 1-17 (2017).
  43. Maier, N., Morris, G., Johenning, F. W., Schmitz, D. An approach for reliably investigating hippocampal sharp wave-ripples in vitro. PLoS One. 4, 6925(2009).
  44. Schlingloff, D., Kali, S., Freund, T. F., Hajos, N., Gulyas, A. I. Mechanisms of sharp wave initiation and ripple generation. Journal of Neuroscience. 34, 11385-11398 (2014).
  45. McCloskey, D. P., Scharfman, H. E. Progressive, potassium-sensitive epileptiform activity in hippocampal area CA3 of pilocarpine-treated rats with recurrent seizures. Epilepsy Research. 97, 92-102 (2011).
  46. McMahon, L. L., Williams, J. H., Kauer, J. A. Functionally distinct groups of interneurons identified during rhythmic carbachol oscillations in hippocampus in vitro. Journal of Neuroscience. 18, 5640-5651 (1998).
  47. Pöschel, B., Heinemann, U., Draguhn, A. High frequency oscillations in the dentate gyrus of rat hippocampal slices induced by tetanic stimulation. Brain Research. 959, 320-327 (2003).
  48. Hájos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. European Journal of Neuroscience. 29, 319-327 (2009).
  49. Hájos, N., Mody, I. Establishing a physiological environment for visualized in vitro brain slice recordings by increasing oxygen supply and modifying aCSF content. Journal of Neuroscience Methods. 183, 107-113 (2009).
  50. Dengler, C. G., Yue, C., Takano, H., Coulter, D. A. Massively augmented hippocampal dentate granule cell activation accompanies epilepsy development. Nature Publishing Group. , 1-17 (2017).
  51. Ting, J. T., et al. Preparation of acute brain slices using an optimized N -methyl-D-glucamine protective recovery method. Journal of Visualized Experiments. 132, 1-13 (2018).
  52. Westerhof, N., Lankhaar, J. W., Westerhof, B. E. The arterial windkessel. Medical and Biological Engineering and Computing. 47, 131-141 (2009).
  53. Shi, W. X., Bunney, B. S. A small volume chamber for electrical recording from submerged brain slices and a pulse-free medium supply system using a peristalic pump. Journal of Neuroscience Methods. 35, 235-240 (1990).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

自发性尖波涟漪经心灌注水平脑切片界面式孵育室浸没式记录双表面灌流局部场电位记录碳酸氢盐人工脑脊液（ACSF）通碳酰气饱和
急性小鼠脑切片以研究海马区自发性网络活动
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。