本方案描述了从小鼠中制备表现出自发尖波涟漪活动的水平海马-内嗅皮层（HEC）切片的方法。切片在简化的界面式孵育室中孵育，并在浸没条件下用快速流动的人工脑脊液进行记录，以促进组织供氧及网络水平自发活动的出现。
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摘要
摘要
急性啮齿类脑切片提供了一种可行的实验方法，可通过电生理学、显微成像和药理学手段，在单细胞分辨率下深入研究神经环路的结构与功能。然而，在实验设计中一个主要的考虑因素是 体外 实验的关键在于不同脑片制备方法在多大程度上能够重现所观察到的自然神经活动模式 体内 在完整的大脑中，海马网络会产生高度同步的群体活动，反映动物的行为状态，例如在清醒的摄食状态或非快速眼动睡眠期间出现的尖波涟漪复合体（SWRs）。在适当条件下，SWRs及其他形式的网络活动可在离体海马脑片中自发产生。为了利用强大的脑片工具研究海马网络活动，必须采用一种能够优化组织健康状态并维持海马网络内功能连接性的方法。实验中对小鼠进行经心脏灌注，使用低温的蔗糖基人工脑脊液。制备包含海马的水平脑片，厚度为450 μm，以保留突触连接性。脑片在界面式孵育室中恢复，随后转移至浸没式记录室进行电生理记录。记录室采用双表面灌流设计，以高流速人工脑脊液灌注，从而改善脑片的氧供。该方案可获得状态良好的脑片组织，适用于复杂且自发性网络活动的研究。 关键词：海马, 脑片, 尖波涟漪, 网络活动, 人工脑脊液, 突触连接性, 小鼠 体外.
引言
活体海马脑片的电生理学测量 体外 是一种功能强大的实验方法，具有多种优势。研究者可利用显微镜、显微操作器和记录系统，直接观察并采集组织中单个神经元的测量数据。组织切片也便于进行光刺激或药物递送，适用于光遗传学、化学遗传学或药理学实验。
海马网络产生高度同步的群体活动 体内，表现为细胞外局部场电位中的振荡1,2,3,4,5脑片方法已被用于深入探究神经元网络振荡背后的细胞和环路机制。Maier 等人的奠基性工作表明，腹侧海马脑片中可自发产生尖波-涟波复合体（SWRs）。6,7后续来自多位研究者的研究逐步阐明了尖波涟漪（SWRs）的多个方面，包括神经调节物质在调控海马网络状态中的作用8,9,10 并驱动突触机制的 体....
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方案
本文所述所有方法均已获得哥伦比亚大学机构动物护理和使用委员会（AC-AAAU9451）的批准。
1. 准备溶液
- 按照表1所述配制用于切片的蔗糖切割溶液。
注意：配制1 L蔗糖溶液后，将少量（约100–200 mL）倒入冰格中冷冻。这些冷冻的蔗糖冰块将在后续步骤中被打碎成冰沙状混合物（见步骤4.3）。 - 按照表2所述配制用于记录的人工脑脊液（ACSF）。
- 通过将0.05844 g NaCl溶解于1 mL已过滤去除痕量金属及其他杂质的纯化水中，配制1 M NaCl溶液，用于刺激电极。
注意：每次实验均应新鲜配制蔗糖切割溶液和ACSF。
2. 准备琼脂斜面
- 通过将琼脂粉溶解于已过滤去除痕量金属及其他杂质的纯化水中，制备4%的琼脂溶液（例如，2 g琼脂加入50 mL水中）。将混合物放入微波炉加热至即将沸腾（约30–60秒）。将熔化的琼脂倒入模具中，并在冰箱中于4 °C、约12°倾斜条件下冷却并凝固。
注意：模具可使用任何倾斜放置的玻璃或塑料容器，倒入足量的熔化琼脂，以形成长度为4 cm、高度约为0.8 cm的斜面。
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结果
本文展示了按照本方案所述方法制备的海马脑片（HEC）的代表性记录结果。脑片在界面式孵育室中恢复后（图1C），被逐一转移至浸没式记录室（图2B）。记录室通过蠕动泵持续灌流经碳合气（carbogen）饱和的人工脑脊液（ACSF）（图2A）。蠕动泵首先将ACSF从储存烧杯抽入加热储液罐中。碳合气管路同时插入储存烧杯和加热储液罐，以确保灌流液持续氧合。在蠕动泵与记录室之间安装一个由多个充满空气的注射器组成的脉动阻尼器，以减少因快速蠕动引起的流速波动。每个注射器内的气腔可吸收泵每周期运行所产生的压力变化，从而使记录室获得平稳且稳定的ACSF灌流52,53。在脉动阻尼器之后设置的管路加热器可确保ACSF进入记录室时温度维持在32 °C。
在此示例中，双表面灌流记录室由三个3D打印层组成（
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讨论
本切片方案包含多个步骤，旨在促进组织健康并有利于自发性自然网络活动的出现：用预冷的蔗糖切片液对小鼠进行经心脏灌注；从中间或腹侧海马区切取厚度为450 μm的水平内嗅皮层（HEC）脑片；脑片在加温的人工脑脊液（ACSF）与湿润、富含碳合气（carbogen）的空气交界面进行恢复；记录过程中，脑片置于浸没式记录室中，采用双表面灌流方式，以较快流速持续灌注加热至32 °C的ACSF。
脑片的健康状态对于体外网络振荡的产生至关重要。in vitro。年轻动物能获得更健康的脑片，通常在幼年或青春期小鼠中可省略经心灌注步骤。随着动物年龄增长，制备健康脑片的难度逐渐增加，然而某些研究（如疾病模型或纵向研究）必须使用成年或衰老动物。例如，Dengler 等人在制备由匹鲁卡品处理的慢性癫痫成年小鼠的 HEC 脑片时，采用了经心灌注方法50。对于成年小鼠，使用预冷的蔗糖切割液进行经心灌注有助于冷却组织、清除脑内血液并降低代谢活性，从而在取出脑组织前改善脑片质量51。然而需要注意的是，经心灌.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 Steve Siegelbaum 提供的支持。本研究由项目 5R01NS106983-02 和 1 F31 NS113466-01 资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3D 打印机 | Lulzbot | LulzBot TAZ 6 | |
| 急性脑切片孵育支架 | NIH 3D 打印交换平台 | 3DPX-001623 | 由 ChiaMing Lee 设计，可从 https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623 获取 |
| 腺苷-5′-三磷酸镁盐 | Sigma Aldrich | A9187-500MG | |
| 银-氯化银接地电极颗粒 | Warner | 64-1309, (E205) | |
| 琼脂 | Becton, Dickinson | 214530-500g | |
| 抗坏血酸 | Alfa Aesar | 36237 | |
| 烧杯（250 mL） | Kimax | 14000-250 | |
| 烧杯（400 mL） | Kimax | 14000-400 | |
| 生物素标记物（biocytin） | Sigma Aldrich | B4261 | |
| 搅拌机 | Oster | BRLY07-B00-NP0 | |
| 小型邦氏剪刀 | Becton, Dickinson | 14184-09 | |
| 带丝硼硅酸盐玻璃毛细管（外径 1.5 mm，内径 0.86 mm，长度 10 cm） | Sutter Instruments | BF150-86-10HP | 建议使用火焰抛光的毛细管。 |
| 氯化钙溶液（1 M） | G-Biosciences | R040 | |
| 相机 | Olympus | OLY-150 | |
| 压缩碳合气（95% 氧气 / 5% 二氧化碳） | Airgas | X02OX95C2003102 | |
| 压缩氧气 | Airgas | OX 200 | |
| 恒压隔离刺激器 | Digitimer Ltd. | DS2A-Mk.II | |
| 盖玻片（22×50 mm） | VWR | 16004-314 | |
| 氰基丙烯酸酯粘合剂 | Krazy Glue | KG925 | 理想情况下使用刷涂型以提高精度 |
| 数据采集软件 | Axograph | N/A | 任何等效软件（例如 pClamp）均可使用。 |
| Dell Precision T1500 塔式工作站台式机 | Dell | N/A | 目录号取决于具体计算机型号——只要能运行电生理数据采集软件，任何计算机均可使用。 |
| Digidata 1440A | Molecular Devices | 1-2950-0367 | |
| 数字计时器 | VWR | 62344-641 | 4 通道 Traceable 计时器 |
| 一次性吸水垫 | VWR | 56616-018 | |
| 解剖剪刀 | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| 双刃剃须刀片 | Personna | BP9020 | |
| 双通道自动温度控制器 | Warner Instrument Corporation | TC-344B | |
| 双面或层流优化记录室 | N/A | N/A | 本方案中使用的记录室为定制。商业等效产品为 Warner Instruments 的 RC-27L。 |
| 设备机架 | Automate Scientific | FR-EQ70" | 机架并非绝对必要，但有助于组织电生理设备 |
| 乙二醇双（2-氨基乙醚）四乙酸（EGTA） | Sigma Aldrich | 324626-25GM | |
| 滤纸 | Whatman | 1004 070 | |
| 精密天平 | Mettler Toledo | XS204DR | |
| Flaming/Brown 微电极拉制仪 | Sutter Instruments | P-97 | |
| 玻璃培养皿（100 × 15 mm） | Corning | 3160-101 | |
| 葡萄糖 | Fisher Scientific | D16-1 | |
| 鸟苷-5′-三磷酸钠盐水合物 | Sigma Aldrich | G8877-250MG | |
| 冰桶 | Sigma Aldrich | BAM168072002-1EA | |
| 异氟烷蒸发器 | General Anesthetic Services | Tec 3 | |
| 实验室胶带 | Fisher Scientific | 15-901-10R | |
| 镜头纸 | Fisher Scientific | 11-996 | |
| 光源 | Olympus | TH4-100 | |
| 氯化镁溶液（1 M） | Quality Biological | 351-033-721EA | |
| 磁力搅拌子 | Fisher Scientific | 14-513-56 | 目录号取决于搅拌子的尺寸。 |
| 微操纵器 | Luigs & Neumann | SM-5 | |
| 微操纵器（手动） | Scientifica | LBM-2000-00 | |
| 显微镜 | Olympus | BX51WI | |
| 微型刮铲 | Fine Science Tools | 10089-11 | |
| 显示器 | Dell | 2007FPb | |
| MultiClamp 700B 微电极放大器 | Molecular Devices | MULTICLAMP 700B | MultiClamp 700B 应包含前置放大器、移液管夹持器和模型细胞。 |
| N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)（HEPES） | Sigma Aldrich | H3375-25G | |
| 针头（20 号，长度 1.5 英寸） | Becton, Dickinson | 305176 | |
| 尼龙丝线 | YLI Wonder Invisible Thread | 212-15-004 | 规格 0.004。此目录号来自 Amazon.com |
| 尼龙网 | Warner Instruments Corporation | 64-0198 | |
| 蠕动泵 | Harvard Apparatus | 70-2027 | |
| 磷酸肌酸二(三羟甲基氨基甲烷)盐 | Sigma Aldrich | P1937-1G | |
| 移液管夹持器 | Molecular Devices | 1-HL-U | |
| 铂丝 | World Precision | PT0203 | |
| 聚乳酸（PLA）耗材丝 | Ultimaker | RAL 9010 | |
| 氯化钾 | Sigma Aldrich | P3911-500G | |
| 葡萄糖酸钾 | Sigma Aldrich | 1550001-200MG | |
| 氢氧化钾 | Sigma Aldrich | 60377-1KG | |
| 剃须刀片 | VWR | 55411-050 | |
| 滚轴夹 | World Precision Instruments | 14041 | |
| 天平 | Mettler Toledo | PM2000 | |
| 手术刀柄 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| 切片固定架（slice harp） | Warner | SHD-26GH/2 | |
| 碳酸氢钠 | Fisher Chemical | S233-500 | |
| 氯化钠 | Sigma Aldrich | S9888-1KG | |
| 无水磷酸二氢钠 | Fisher Chemical | S369-500 | |
| 丙酮酸钠 | Fisher Chemical | BP356-100 | |
| 刮铲 | VWR | 82027-520 | |
| 大刮铲/药匙 | VWR | 470149-442 | |
| 无菌手术刀片 | Feather | 72044-10 | |
| 搅拌器/加热板 | Corning | 6795-220 | |
| 单向旋塞阀 | World Precision Instruments | 14054 | |
| 三通旋塞阀 | World Precision Instruments | 14036 | |
| 蔗糖 | Acros Organics | AC177142500 | |
| 旋转夹具支架 | Fisher Scientific | 14-679Q | |
| 锐/钝外科剪刀 | Fine Science Tools | 14001-12 | |
| 注射器（1 mL） | Becton, Dickinson | 309659 | |
| 注射器（60 mL，带鲁尔锁接头） | Becton, Dickinson | 309653 | |
| 三叉夹 | Fisher Scientific | 05-769-8Q | |
| 大组织镊 | Fine Science Tools | 11021-15 | |
| 小组织镊 | Fine Science Tools | 11023-10 | |
| 移液管 | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| 管路 | Tygon | E-3603 | 内径 1/16 英寸，外径 3/16 英寸 |
| 管路 | Tygon | R-3603 | 内径 1/8 英寸，外径 1/4 英寸 |
| 真空润滑脂 | Dow Corning | 14-635-5D | |
| 振动刀片切片机 | Leica | VT 1200S | |
| 带法拉第笼的减震台 | Micro-G / TMC-ametek | 2536-516-4-30PE | |
| 容量瓶（1 L） | Kimax | KIM-28014-1000 | |
| 容量瓶（2 L） | PYREX | 65640-2000 | |
| 温水浴 | VWR | 1209 |
参考文献
- Buzsáki, G., Lai-Wo, S., Vanderwolf, C. H. Cellular bases of hippocampal EEG in the behaving rat. Brain Research Reviews. 6, 139-171 (1983).
- Buzsáki, G. Hippocampal sharp waves: Their origin and significance. Brain Research. 398, 242-253 (1986).
- Buzsáki, G.....
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