使用患者特异性3D打印肺部模型评估区域性肺部沉积

摘要

我们介绍一种高通量的体外方法，利用基于CT扫描构建的3D打印肺部模型，结合可调节的气流分布，实现肺叶水平区域肺部沉积的定量分析。

摘要

肺部疾病靶向治疗的发展受到缺乏能够预测区域性气溶胶递送效果的临床前检测方法的限制。通过利用3D打印技术构建患者特异性肺部模型，我们提出了一种高通量体外实验装置的设计方案，用于定量分析肺叶级沉积情况。该系统由市售组件与3D打印部件组合而成，可独立调控通过肺部各叶的气流速率。通过荧光显微镜测量荧光气溶胶在各肺叶的递送量。该方案有望通过模拟多种患者人群特征和疾病状态，推动呼吸系统疾病个体化医疗的发展。3D打印肺模型的几何结构和气流分布参数均可便捷调节，以反映不同年龄、种族和性别的患者的临床数据。临床上常用的药物递送装置（例如本研究中展示的气管插管）可整合至该测试系统中，从而更准确地预测装置将治疗药物靶向递送至肺部病变区域的能力。该实验装置具有高度灵活性，可针对多种吸入条件进行定制化调整，从而提升临床前治疗测试的严谨性。

引言

许多肺部疾病，如肺癌和慢性阻塞性肺疾病（COPD），在不同区域表现出疾病特征的差异；然而，目前尚缺乏能够将药物递送精准靶向至肺部病变区域的治疗技术¹。多个计算流体动力学（CFD）模型已证明，通过识别肺内特定的流线，可以调节药物沉积的分布模式^2,3。我们实验室目前正在开发具备区域靶向能力的吸入器和气管内（ET）导管适配器，以控制气溶胶在肺部病变区域的分布。然而，将这些原理推广至临床应用受到当前临床前测试能力的限制。已知药物在肺内的精确沉积位置是疗效的最佳预测指标；但目前对可吸入治疗药物的药学评估，大多依赖体外-体内粒径相关性来粗略估算沉积情况⁴。该方法无法进行任何空间分析，以确定不同气道几何结构对肺部各叶区域分布的影响。此外，此类测试缺乏解剖学上准确的肺部几何模型，而研究人员已证实，气道几何结构对沉积分布具有显著影响⁵。尽管已有部分研究尝试通过加入上呼吸道来整合患者特异性的肺部几何结构进入测试流程，但大多数此类方法仅采样气溶胶递送至肺部不同代次的气道，而非针对各个肺叶^6,7,8。以下方案介绍了一种高通量生成患者特异性肺部模型的方法，能够定量分析颗粒在肺部五个肺叶中的相对沉积情况⁹。

通过3D打印患者的计算机断层扫描（CT）图像，可生成解剖结构精确的模型肺。当该模型与易于组装的气流系统结合使用时，可独立控制并调节通过模型肺各肺叶的相对气流速率，以模拟不同人群特征和/或疾病状态下的气流分布。利用该方法，研究人员可在与实际相符的肺部几何结构中测试潜在治疗手段的有效性，并将每种方法的效果与病变形态的进展进行关联分析。本文中，我们测试了实验室开发的两种装置设计，评估其通过控制气溶胶在口腔或气管中的释放位置，以增加目标肺叶沉积率的能力。该方案还有望显著推动个性化医疗方案的发展，通过基于患者特异性CT扫描数据构建的模型肺，快速预测治疗效果。

方案

1. 3D 打印实验组件的制备

注意：本实验方案中使用的所有软件均在材料表中列出。此外，所使用的切片软件针对材料表中列出的3D打印机而设计；然而，本方案可推广应用于多种立体光刻（SLA）3D打印机。

1. 将患者的CT扫描图像转换为三维对象（.stl文件）。
   注意：有关本研究中所用特定肺部模型几何 特征的更详细讨论，请参见Feng等人的研究⁵。
   1. 使用CT扫描软件（见材料表）将CT扫描图像渲染为三维对象。打开CT扫描图像，使用阈值工具对气道区域创建掩膜，阈值范围设置为-800至-1000。使用3D预览工具查看三维渲染结果，并将对象导出（文件 | 导出）为.stl文件。
   2. 将文件导入网格编辑软件（见材料表），使用选择工具（雕刻 | 笔刷："收缩/平滑" | 属性：强度(50)，大小(10)，深度(0)）去除任何锯齿状特征。对表面进行平滑处理（Ctrl+A | 变形 | 平滑 | 平滑度(0.2)，平滑尺度(1)）。
   3. 在网格编辑软件中，将这些对象的壁厚向外扩展2 mm（Ctrl+A | 编辑 | 偏移），并保持内部为空心结构，仅保留壁面。在气管处对对象进行切割（选择 | 编辑 | 平面切割）以形成入口，并在第2或第3代分支处（即通向各肺叶的位置）进行切割以形成出口（图1A）。
      注意：2 mm的壁厚是根据材料表中所列3D打印机制造商规定的可接受特征尺寸选定的。如果保持模型内部几何结构不变，可根据可用3D打印机的具体规格调整该厚度。
2. 修改患者肺部模型出口的几何结构，使其与先前设计的肺叶出口帽组件（见材料表，图1B,C）兼容。
   1. 将三维对象导入3D建模软件（见材料表），该对象内部复制了CT扫描结构，壁厚为2 mm，且入口和出口均开放，作为实体体导入（打开 | 网格文件 | 选项 | 实体体）。
   2. 基于每个出口处的面创建基准平面（插入 | 参考几何体 | 基准面）。使用拼接工具，在该平面上绘制出口内壁和外壁的轮廓（草图 | 样条曲线）。
   3. 通过放样方式连接一个圆柱体（外径18.5 mm，内径12.5 mm，高15.15 mm）至模型的内壁和外壁，从而使各肺叶出口延伸为统一尺寸（特征 | 放样凸台/基体）。在出口边缘添加一个凹槽，以与盖帽匹配（特征 | 拉伸切除 | 偏移）。
      注意：盖帽（图1D）为一空心圆柱体，其尺寸与出口匹配，并带有可与模型出口凹槽嵌合的凸缘。盖帽一端封闭，使其内径小于其余部分，从而确保与带倒刺的管路连接处紧密贴合（图1E）。带倒刺的管路连接部分呈锥形倒刺结构，倒刺可穿过盖帽开口，但其余部分无法通过，从而使管路连接牢固地固定在盖帽中。因此，盖帽能紧密贴合带倒刺的管路连接和肺部模型（图1F,G）。
   4. 根据所需的实验条件修改肺部模型的入口。可保留喉部和声门区域，以模拟自主呼吸的患者（图1B）。也可通过拉伸切除移除气管以上的区域，以模拟接受呼吸机支持的插管患者（特征 | 拉伸切除）（图1C）。
3. 在3D打印机制造商提供的切片软件中对实验组件进行定位并添加支撑结构。
   1. 将3D部件文件导入3D打印机切片软件，并选择合适的树脂材料。使用硬质树脂打印肺部模型和带倒刺的管路连接件，使用软质树脂打印盖帽。
      注意：用于打印盖帽的树脂必须具有弹性，以便能够拉伸覆盖肺叶出口并形成气密密封。
   2. 设置部件的打印方向，以最小化“孤岛”和未排气体积的出现。肺部模型的最佳打印方向为肺叶出口背离打印平台。确保带倒刺的管路连接件和盖帽的较宽部分朝向打印平台。
      注意：可逐层查看切片，检查是否存在“孤岛”——即在某一层切片中首次出现但未与部件主体相连的部分。可使用审查功能检查是否存在未排气体积，即在打印过程中未固化树脂可能被困在部件内部的区域。孤岛和未排气体积均会降低打印质量，可能导致打印失败。
   3. 逐层查看切片，为部件中剩余的“孤岛”以及存在显著悬垂的区域添加支撑结构。导出并查看打印切片，以确认所有区域均已得到适当支撑。
4. 按照制造商说明打印实验组件并完成后续处理。
   注意：以下所述所有后处理步骤均针对材料表中所列3D打印机。若使用其他打印机或材料，请根据制造商说明调整相应步骤。
   1. 对于使用软质树脂打印的部件，使用纯度≥99%的异丙醇（IPA）清洗以去除多余未固化树脂，并根据制造商规范在对流烘箱中进行8小时热固化。
      注意：软质树脂打印的部件在刚打印完成后可能非常脆弱，因此在清洗过程中应格外小心。IPA暴露时间应控制在材料溶剂暴露限值以下，以防止部件降解。
   2. 对于使用硬质树脂打印的部件，使用IPA清洗以去除多余未固化树脂，并在紫外烘箱中（365 nm波长，5–10 mW/cm²）每侧照射1分钟进行固化。
      注意：为评估3D打印复制品的准确性，建议对打印部件进行μCT扫描，并结合CT扫描软件定量比较原始3D渲染模型与3D打印复制品之间的差异。

2. 流速控制管路系统的组装

1. 将1/4”卡套管接头拧入具有6个端口的歧管侧面（图2A-6），并将一个3/8”卡套管接头拧入剩余端口。
2. 将1/4"管材截成所需长度，并插入快接阀的两端（图2A-5）。将每个阀门连接至歧管中已安装的1/4"接头之一。
3. 将流量计（图2A-4）连接至每个阀门的另一端。
4. 将管路系统放置在木板上方，使歧管上单独的3/8”接头伸出木板边缘。为固定装置，在木板侧面安装两颗螺丝，并用金属丝将歧管绑在螺丝上。
5. 在每个阀门和流量计周围安装四颗螺丝，并使用金属丝将它们分别固定在木板上（图2E）。
6. 使用约6英寸长、内径为3/8”的管材，将歧管连接至一个孔径为0.1 µm的真空级在线过滤器。再用另一段6英寸长、内径为3/8”的管材将过滤器的另一端连接至流量控制器。
   注意：该管路系统仅需组装一次。

3. 使用患者肺部模型组装叶出口帽

注意：本实验方案的此部分内容必须在每次实验运行前完成。

1. 将带倒刺的管路接头插入盖子中，使喷嘴从盖子底部的开口处伸出。首先，将椭圆形带倒刺管路接头的一端插入盖子中。然后，小心地将柔性的盖子拉伸覆盖到椭圆形接头的另一端，特别注意不要使较薄的基部产生裂纹。
   注意：新打印的盖子可能比预期更硬，可通过用两根手指沿盖子内侧轻轻摩擦使其适当延展。
2. 裁剪10 μm滤纸，使其略大于出口区域。将滤纸折叠覆盖在叶瓣出口上，并用一只手固定。
3. 另一只手使用镊子将带有倒刺管路接头的盖子拉伸并覆盖到出口上。向下按压盖子，直至盖子上的凹槽与叶瓣出口上的对应凹槽对齐（图2C）。
   注意：此步骤中若撕裂滤纸，可能导致结果无效，因此在将盖子压到出口上时应特别小心，避免施加过大的力。
4. 对所有其余的叶瓣出口重复上述操作（图2D）。

4. 生成临床相关气流曲线

注意：本实验方案的此部分内容必须在每次实验运行前完成。

1. 将每个肺模型叶出口连接到相应流量计和阀门的管路上，注意不要对带刺管路连接处施加过大的侧向压力。将电子流量计连接至肺模型的口部入口，以测量进入肺模型的总气流速率。
2. 打开流量控制器（图 2A-7）和真空泵（图 2A-8）。在流量控制器上选择“测试设置”模式，并缓慢增加流量，直至电子流量计显示所需的总流量。
3. 使用阀门（图 2E-5）调节通过五个肺叶的气流速率：右上叶（RU）、右中叶（RM）、右下叶（RL）、左上叶（LU）和左下叶（LL）。当各流量计（图 2E-4）显示的肺叶流量稳定在目标值后，再次检查电子流量计上的总流量，以确认系统无泄漏。
   1. 若总流量存在偏差，先通过流量控制器降低流量，将所有阀门调至完全打开状态，然后重复步骤 4.2 和 4.3。
      注：本文结果基于 Sul 等人报道的数据所设定的气流分布（Sul et al.¹⁰）。各肺叶的流量比例是通过全吸气和全呼气状态下患者的薄层计算机断层扫描图像计算得出，比较了各肺叶体积的相对变化。结果显示两种不同的气流条件，总体入口流量均为 1 L/min。健康肺叶出口流量分布按入口总流量的以下比例分配：LL-23.7%、LU-23.7%、RL-18.7%、RM-14.0%、RU-20.3%。慢性阻塞性肺病（COPD）肺叶出口流量分布按入口总流量的以下比例分配：LL-10.0%、LU-29.0%、RL-13.0%、RM-5.0%、RU-43.0%^9,10。
4. 退出流量控制器的“测试设置”功能，但保持真空泵开启。
   注：在设定流量与进行沉积实验之间关闭真空泵可能导致生成的流量分布不准确。建议在设定所需流量后保持真空泵持续运行，以完成气溶胶沉积测试。

5. 将气溶胶递送至肺部模型

注意：实验必须在通风橱内进行，且通风橱的移门应保持关闭，以尽量减少暴露于雾化器产生的气溶胶中。

1. 将雾化器中加入所需荧光颗粒的溶液（图2A-1），并连接至肺模型的入口（图2B）。
   注意：本文所示结果使用的是30 mL甲醇中1:100稀释的1 μm荧光聚苯乙烯颗粒溶液。
   1. 为验证实验装置，将雾化器直接连接至肺模型入口，不使用任何靶向装置。
   2. 为测量靶向装置的效率，将雾化器连接至该装置，并将装置插入肺模型中。
2. 将压缩空气管路连接至雾化器，并尽可能关闭通风橱的前窗。
3. 设置流量控制器运行一次10秒的试验。在按下启动按钮前，略微打开压缩空气阀门，以开始在雾化器内生成气溶胶。
4. 按下流量控制器上的启动按钮，并立即完全打开压缩空气阀门。当流量控制器运行至约9秒时，开始关闭压缩空气阀门。
5. 当压缩空气阀门完全关闭后，将雾化器从压缩空气管路断开，完全关闭通风橱前窗，关闭真空泵，并让通风橱内的气溶胶消散约10分钟。
   注意：完成一次运行后关闭真空泵非常重要，以防止管路系统内形成真空。
6. 等待足够时间后，将肺模型从管路系统上断开，特别注意不要损坏带凸缘的管路连接处。
7. 用一对镊子插入叶出口帽边缘下方，轻轻将其从肺模型上取下。
8. 从帽中取出滤纸，放入24孔板中，使颗粒沉积的一面朝下，面向孔底。对剩余的各个出口重复此操作，并标记对应肺叶的孔位。
   注意：为防止任何残留颗粒沉积影响后续实验，每次运行之间必须用异丙醇（IPA）或适当的溶剂冲洗肺模型和帽组件。如有需要，可收集冲洗液并纳入分析。此外，应保留记录，确保所用的所有复制品最少程度地接触IPA，以维持部件完整性 ，并在使用前建议进行目视检查。

6. 出口滤纸成像

1. 将孔板放入数字荧光显微镜中，并将显微镜设置为 4 倍放大倍数及相应的荧光通道。
2. 目视确定哪个肺叶的滤纸颗粒沉积量最多，使用“自动曝光”功能，并记录所得的曝光时间和积分时间值。
3. 将此曝光参数应用于该次运行中的所有滤纸，并评估该设置是否能为所有高沉积区域的滤纸生成满意的图像。
   注意：不同滤纸的焦距设置可以调整；但同一次运行中的所有滤纸必须在相同的曝光条件下进行分析。每次只能获得一个焦平面，因此滤纸上的弯曲或撕裂可能导致视野中沉积的颗粒无法全部清晰对焦。可通过确保滤纸平整贴合孔板底部来避免此问题。
4. 在每个肺叶滤纸的随机位置至少采集三幅图像，并保存为 .tiff 文件。

7. 颗粒沉积的定量分析

1. 将某次实验的所有滤纸图像导入 ImageJ 会话中。
2. 通过选择 图像 | 类型 | 8位，将每幅图像的类型更改为8位。
3. 打开荧光信号最强的图像，选择 图像 | 调整 | 阈值 以打开阈值窗口。调整阈值参数，以最小化滤纸背景信号，并清晰界定颗粒边缘。有关高质量和低质量阈值处理的示意图，参见 图3。
   注意：对于颗粒沉积量较高的滤纸，由于滤纸纤维对光的衍射作用，可能在颗粒聚集区域周围观察到荧光“光晕”现象。在对这类图像进行阈值处理时，若阈值范围过大，则会在这些聚集区域周围出现小点状或“羽毛状”结构，如 图3 中“低质量”阈值图像所示。可通过逐步提高阈值下限，使滤纸纤维产生的信号最小化，同时不遮蔽颗粒本身的信号，从而改善效果。
4. 将荧光信号最强图像的阈值设置应用到所有其他图像。
5. 通过选择 分析 | 分析颗粒，量化颗粒数量和总荧光面积。
   注意：数据集之间的比较采用 Sidak 多重比较检验和双因素方差分析（two-way ANOVA）。此外，针对感兴趣肺叶区域的沉积量比较，采用假设方差相等的 Student T 检验。

结果

在此粒径范围（1-5 μm）和流动条件（1-10 L/min）下，颗粒物根据其理论斯托克斯数（Stokes number）和体内数据均沿流体流线运动；因此，在无靶向递送装置的情况下，释放到肺部模型中的颗粒物预计会按照分配至各肺叶的总气流百分比进行沉积。随后可将各肺叶的颗粒物递送相对量与通过分析患者特异性高分辨率计算机断层扫描（HRCT）图像获得的临床肺叶气流数据进行比较¹⁰。经过验证的实验装置所得到的非靶向颗粒沉积分布应与临床气流分布之间无统计学显著差异。本文展示了两种不同流动条件下的验证数据：健康肺在1 L/min流速下的情况（图4A），以及慢性阻塞性肺疾病（COPD）肺在1 L/min流速下的情况（图4B）。在这两种条件下，实验测定的沉积分布与临床数据之间均无统计学显著差异，表明该装置能够准确模拟气流在各肺叶之间的分布。这些基础沉积分布作为对照，用于与靶向颗粒沉积分布进行比较。

为了说明本方案量化区域肺部沉积变化...

讨论

目前用于测试完整吸入剂量肺部药物的先进设备是下一代撞击器（Next Generation Impactor, NGI），其可测量气溶胶的空气动力学直径⁴。该粒径数据随后用于预测气溶胶在肺部沉积的支气管代数，其依据是基于健康成年男性建立的相关模型¹¹。然而，该方法在评估区域肺部沉积差异、确定疾病状态对药物递送的影响，以及预测不同年龄组、种族和性别人群的沉积分布方面存在局限性^12,13,14。本文所述方案能够满足上述测试需求，使研究人员能够构建可调节的、解剖结构精确的肺部模型，并基于先前在计算模型中已证实的流体流动行为，量化肺叶水平的相对沉积量^3,5,15。利用该方法，可在进入...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1/4" 塑料带刺管接头	McMaster Carr	5372K111
10 µm 滤纸	Fisher	1093-110
1 µm 荧光聚苯乙烯微粒	Polysciences	15702-10
1 µm 非荧光聚苯乙烯微粒	Polysciences	8226
2-丙醇	Fisher	A516-4	在实验方案中称为 "IPA"
3/8" 塑料带刺管接头	McMaster Carr	5372K117
空气流量计（1 - 280 mL/min）	McMaster Carr	41695K32	在实验方案中称为 "流量计"
Carbon M1 3D 打印机	Carbon 3D		https://www.carbon3d.com/，相关软件在实验方案中称为 "切片软件"
Collison 喷射雾化器	CH Technologies	ARGCNB0008 (CN-25)	六喷嘴 MRE 型水平碰撞式玻璃罐雾化器，在实验方案中称为 "雾化器"，http://chtechusa.com/Manuals/MRE_Collison_Manual.pdf
对流烘箱	Yamato	DKN602
Copley 关键流量控制器 TPK2000 Reve 120V	MSP Corp	0001-01-9810	在实验方案中称为 "流量控制器"
Copley 高容量泵 HCP5 型	MSP Corp	0001-01-9982	在实验方案中称为 "真空泵"
Cytation	BioTek	CYT5MPV	多功能分光光度计/荧光成像仪，配备 4x/20x/40x 物镜及 DAPI/GFP/TexasRed 激光/滤光立方体
EPU40 树脂	Carbon 3D		https://www.carbon3d.com/materials/epu-elastomeric-polyurethane/，在实验方案中称为 "软树脂"
真空泵用滤芯	Whatman	6722-5000
DFM 2000 型流量计	MSP Corp	0001-01-8764	在实验方案中称为 "电子流量计"
ImageJ 软件	ImageJ		https://imagej.nih.gov/ij/download.html
直插式空气流量控制阀（推入式连接）	McMaster Carr	62005K333	在实验方案中称为 "阀门"
管路在线滤器	Whatman	WHA67225000
船用级胶合板板片	McMaster Carr	62005K333	在实验方案中称为 "木板"
Materialise Mimics 软件	Materialise		https://www.materialise.com/en/medical/mimics-innovation-suite，在实验方案中称为 "CT 扫描软件"
Meshmixer 软件	Autodesk		http://www.meshmixer.com/，在实验方案中称为 "网格编辑软件"
甲醇	Fisher	A454-4
Opticure LED 立方体	APM Technica	102843	在实验方案中称为 "紫外烘箱"
PR25 树脂	Carbon 3D		https://www.carbon3d.com/materials/uma-urethanemethacrylate/，在实验方案中称为 "硬树脂"
化学品用 PVC 管	McMaster Carr	5231K161	内径 1/4"
螺丝
SolidWorks 软件	Dassault Systèmes SolidWorks Corporation		https://www.solidworks.com/，在实验方案中称为 "3D 建模软件"
直通流矩形歧管	McMaster Carr	1125T31
连接至流量控制器的管路	McMaster Carr	5233K65	内径 3/8"
导线