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方法文章

多重荧光联合检测 原位 新鲜或固定小鼠脑切片上的荧光免疫组织化学杂交

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DOI：

10.3791/61709

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2021年6月25日

 ,  , 
1Department of Pharmacology, School of Medical Sciences, University of New South Wales

本文内容

摘要

本方案描述了一种结合荧光的方法 原位 荧光原位杂交（FISH）和荧光免疫组织化学（IHC）在新鲜冷冻和固定的小鼠脑切片中的联合应用，旨在实现多重标记的FISH与荧光IHC信号检测。IHC靶向细胞质和膜结合蛋白。

摘要

荧光 原位 杂交（FISH）是一种分子技术，可鉴定细胞内特定RNA转录本的存在及其空间分布。对功能已知神经元进行神经化学表型分析通常需要结合免疫组织化学（IHC）方法，使用多种抗体（靶向蛋白质）进行同时标记，并优化 原位 杂交（靶向RNA），串联进行。A "神经化学特征" 对特定神经元进行表征是可行的，但存在一些复杂因素，包括在联合使用FISH和IHC方法前需验证各自靶标，以及在同一组织切片中可同时检测的RNA和蛋白质数量有限。

本文介绍了一种利用新鲜冷冻和固定的小鼠脑组织样本的实验方案，该方案在同一脑切片上依次通过RNAscope荧光原位杂交（FISH）检测多种mRNA，再通过荧光免疫染色检测蛋白质。我们采用这种联合方法，描述了在免疫组织化学鉴定出的脑干核团中低丰度mRNA（例如，甘丙肽受体1）和高丰度mRNA（例如，甘氨酸转运蛋白2）的表达模式。

在FISH检测之后进行蛋白标记时，需要考虑的因素不仅限于组织制备和FISH探针标记的优化。例如，我们发现FISH探针检测中的蛋白酶处理步骤可能对后续免疫组化（IHC）检测中抗体的结合及标记特异性产生不利影响。蛋白酶可催化肽键的水解性断裂，促进FISH探针进入细胞，但也可能同时降解后续IHC检测所针对的靶蛋白，导致非特异性结合。靶蛋白的亚细胞定位也是影响FISH检测后IHC成功与否的另一个因素。我们观察到，当靶蛋白位于细胞膜上时，IHC的特异性得以保持；而针对细胞质蛋白的IHC则需要进行大量排错优化。最后，我们发现与新鲜冷冻组织相比，载玻片上固定的冷冻组织更难处理，但当与RNAscope联合使用时，固定冷冻组织的IHC质量总体更优。

引言

通过免疫组织化学（IHC）和/或原位杂交等方法，常用于鉴定在神经化学上定义神经元亚群的蛋白质和mRNA。 原位 原位杂交（ISH）。将ISH与免疫组织化学（IHC）技术结合，可通过最大化多重标记能力，揭示功能神经元特有的共定位模式（神经化学编码）。

荧光原位杂交（FISH）方法（包括RNAscope）相比早期的RNA检测方法（如放射性原位杂交和非放射性显色原位杂交）具有更高的灵敏度和特异性。FISH能够将单个mRNA转录本可视化为点状染色信号1。此外，RNAscope检测技术可同时使用不同的荧光标记物，实现更多数量RNA靶标的标记。尽管具有这些优势，技术上的限制仍可能影响单次实验中可使用的荧光染料或显色剂的数量。这些限制包括显微镜滤光片组的可用性；当进行神经化学鉴定时，若将FISH与免疫组织化学（IHC）联合使用，相较于单独使用任一技术，此类限制会更加复杂，因为某一方法的最佳操作步骤可能对另一方法产生不利影响。

先前将FISH与IHC结合的应用已证实可在人类B细胞淋巴瘤2、鸡胚3、斑马鱼胚胎4、小鼠视网膜5以及小鼠内耳细胞6中检测特定细胞靶标的表达。在这些研究中，组织制备方法包括福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）2,3,5或新鲜整体装片4,6。其他研究则在固定的小鼠和大鼠脑组织样本上应用了显色RNAscope技术7,8,9。特别是Baleriola et al.8描述了两种用于ISH-IHC联合检测的组织制备方法：固定的小鼠脑切片和FFPE人脑切片。在最近的一项研究中，我们在新鲜冷冻切片上结合使用FISH与荧光IHC，同时可视化了脑干网状结构中低丰度mRNA（甘丙肽受体1，GalR1）、高丰度mRNA（甘氨酸转运蛋白2，GlyT2）以及囊泡型乙酰胆碱转运蛋白（vAChT）蛋白10。

孤束核（NTS）是参与自主功能的主要脑区之一。该神经元群体位于后脑，具有异质性，能够接收并整合大量自主神经信号，包括调节呼吸的信号。NTS包含多种神经元群体，可通过特定mRNA靶标的表达模式（如GalR1和GlyT2）以及酪氨酸羟化酶（TH）和Paired-like homeobox 2b（Phox2b）转录因子等蛋白质标志物进行表型鉴定。

RNAscope 专利技术推荐使用新鲜冷冻组织制备样本，但许多实验室通常采用全动物经心脏灌注固定后，对固定冷冻组织切片进行长期抗冻保护（在 -20 °C 下储存）的方法。因此，我们旨在建立适用于新鲜冷冻和固定冷冻组织样本的荧光原位杂交（FISH）与免疫组织化学（IHC）联合检测的实验方案。本文针对新鲜冷冻和固定冷冻的脑组织切片提供了：（1）FISH 与荧光 IHC 联合检测的实验流程；（2）使用上述两种样本制备方法时，mRNA 与蛋白质标记效果的质量描述；（3）NTS 中 GalR1 与 GlyT2 表达情况的描述。

我们的研究发现，当与RNAscope技术联用时，免疫组化（IHC）在新鲜冷冻和固定冷冻样本中的成功率存在差异，且取决于靶蛋白在细胞内的定位。在我们实验中，膜结合蛋白的标记始终成功。相比之下，即使在转基因动物（Phox2b-GFP）中过表达胞质蛋白的情况下，针对胞质蛋白的免疫组化仍需进行条件优化。11最后，虽然GalR1在NTS的非儿茶酚胺能神经元中有表达，但GlyT2在NTS中无表达。

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方案

组织预处理步骤的概述见图1。所有实验操作均遵循澳大利亚国家卫生与医学研究委员会关于科学用途动物的使用与护理指南，并符合新南威尔士大学动物护理与伦理委员会的规定。

1. 新鲜冷冻脑组织的样本制备

  1. 心脏灌注
    1. 配制含肝素（2500 U/L）的 0.1 M 磷酸盐缓冲液（PB），pH 7.5。将干冰与乙醇混合制成干冰乙醇浆，温度约为 −72 °C，用于组织取材后的即刻冷冻。
    2. 使用戊巴比妥钠（70 mg/kg，腹腔注射）麻醉成年 C57BL/6 和 Phox2b-GFP11（小鼠基因组信息数据库编号 MGI:5776545）小鼠以实施安乐死，注射针头规格为 27.5 号。
      警告：戊巴比妥属于巴比妥类药物，高剂量时具有急性毒性，可能因呼吸抑制导致死亡。使用前请查阅当地医疗、法律及材料安全指南。
    3. 暴露心脏，用抽吸针头（23 号）插管至左心室。以含肝素的 0.1 M PB 进行心脏灌注，流速为 11–13 mL/min，持续至血液清除（约 2–3 分钟）。通过观察肝脏颜色及右心房流出液的颜色判断血液是否清除12。
    4. 从颅腔中取出脑组织，立即包埋于冷冻切片包埋剂（OCT）中（使用冷冻模具或铝箔），并置于干冰乙醇浴中。将包埋后冷冻的组织样本密封保存于 −80 °C 环境中，最长可保存 3 个月。
  2. 新鲜冷冻组织切片
    1. 将冷冻切片机温度设定为 −20 °C。将 OCT 包埋的组织样本和冷冻切片机持样器一同放入冷冻切片机中，平衡约 30 分钟，使其达到设定温度。
      注意：组织必须始终保持冷冻状态；从 −80 °C 冰箱转移至冷冻切片机时应使用干冰运输。
    2. 使用 OCT 包埋剂将组织固定于预冷的冷冻切片机持样器上。本实验方案中，组织块以冠状面方向安装于持样器上。
      注意：使用剃须刀片去除组织周围多余的 OCT，以减少冷冻切片过程中 OCT 的切割量，避免其转移至载玻片上。
    3. 切取厚度为 14 µm 的冠状面切片，并将其贴附于带电荷的显微镜载玻片上。
      1. 贴片前将载玻片恢复至室温。切片贴附后，将载玻片置于冷冻切片机内的玻片盒中保存。
      2. 若需在同一张载玻片上贴附多个切片，可在玻片背面轻触手指 5–10 秒，使待贴附区域略微升温，有助于后续切片粘附。冷切片无法粘附于冷载玻片上。切片应平整贴附于载玻片表面；若发生折叠，将在洗涤步骤中脱落。
      3. 若观察到切片出现裂纹，可将冷冻切片机温度升高 1–5 °C 以避免该现象。在同一张载玻片上应尽量将组织切片紧密排列，以减少 FISH 探针和试剂在实验过程中的浪费。
    4. 将贴有组织切片的载玻片密封保存于 −80 °C 环境中，最长可保存 6 个月。
      注意：切片必须始终保持冷冻状态，避免反复冻融，以防 RNA 降解。从冷冻切片机转移至 −80 °C 冰箱时，应将玻片盒置于干冰上运输。
  3. 新鲜冷冻组织的固定
    1. 在进行 FISH 探针实验当天，配制 4% 多聚甲醛（PFA）于 0.1 M PB 中，pH 7.5（4% PFA 溶液）。使用布氏漏斗或坩埚过滤器，经滤纸（Grade 1：11 µm，材料表）过滤。
      警告：PFA 通过皮肤接触或吸入具有危害性和毒性。所有涉及 PFA 溶液的操作均应在通风橱内进行。PFA 溶液废弃物应按照机构安全规程妥善处理。
    2. 将 4% PFA 溶液冷却至 4 °C。将载有组织的载玻片从 −80 °C 冰箱中取出，用干冰运输，并立即浸入预冷的固定液中固定 15 分钟。
      注意：此固定步骤时间不得超过 15 分钟，过度固定会导致非特异性背景染色。
  4. 新鲜冷冻组织的脱水
    1. 通过将载玻片浸入梯度浓度乙醇中对组织切片进行脱水。在 Coplin 染色缸中，依次于 50%、70% 和无水乙醇中各浸泡 5 分钟（室温）。最后一步无水乙醇处理重复一次。
    2. 将载玻片自然晾干，使用疏水屏障笔围绕切片区域画圈，确保所围区域尽可能小。
      注意：绘制疏水屏障前必须确保载玻片完全干燥。疏水屏障应完整包围组织切片，不得留有间隙，且必须在后续处理前完全干燥。

2. 固定冷冻脑组织的样本制备

  1. 心脏灌注固定
    1. 通过腹腔注射戊巴比妥钠（70 mg/kg）麻醉小鼠后实施安乐死，随后进行经心脏灌注，先灌注0.1 M磷酸盐缓冲液（PB），再灌注4%多聚甲醛（PFA）溶液。以11–13 mL/min的速度持续灌注10分钟进行固定。
    2. 灌注固定后，从颅腔中分离脑组织，并将其浸入4% PFA溶液中，于4 °C下过夜固定。
  2. 固定组织的切片
    1. 在去除脑膜前，先用无菌0.1 M磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗脑组织，借助解剖显微镜并使用精细镊子操作。
    2. 使用脑切片模具（材料表）将脑组织精确切割成块状（在振动切片前将脑干与前脑分离）。具体操作：在锥体交叉处尾侧切断脑干，并剔除小脑；同样地，在视交叉前方立即进行前脑切割。
    3. 使用氰基丙烯酸酯将组织固定在振动切片机的夹持器上，并包埋于2%琼脂溶液中。
    4. 使用振动切片机切割30 µm厚的组织切片，并将切下的切片保存于冷冻保护液中（含30%无RNase的蔗糖、30%乙二醇、1%聚乙烯吡咯烷酮（PVP-40）的0.1 M PB溶液，pH 7.4）。组织切片可在-20 °C的冷冻保护液中保存长达6个月。
  3. 荧光原位杂交（FISH）前固定切片的准备
    1. 在进行FISH实验当天，用0.1 M PBS将漂浮切片清洗三次，每次10分钟，以去除冷冻保护液。清洗时将切片置于12孔细胞培养板中，并在旋转平台摇床上振荡（90–100 rpm）。
    2. 清洗后，使用画笔将切片贴附于玻璃载玻片上，室温下晾干至少2小时。
      注意：切片应平整贴附于载玻片上，任何明显褶皱都可能导致其在后续洗涤过程中脱落。
    3. 使用疏水屏障笔在切片周围绘制屏障，以限制FISH试剂仅覆盖切片区域。同样需要注意的是，应尽量减小屏障笔所画轮廓的内部面积。
      ​可能的暂停点：切片可在室温下保存过夜，以便次日继续实验。

3. FISH 检测

注意：本方案其余步骤适用于新鲜冷冻组织和固定冷冻组织。

  1. 准备杂交和扩增步骤所需的试剂和仪器。
    1. 将台式恒温孵育器和水浴锅预热至 40 °C。
    2. 准备一个加湿、避光的孵育盒用于孵育载玻片。加湿可防止组织干燥——将载玻片稳妥地放置在湿润的储水层上方。理想情况下，孵育盒由耐用的聚苯乙烯制成，具有避光性和密封性，以维持饱和水蒸气环境。盒盖闭合时应尽量减少摩擦，避免移动载玻片。我们使用底部铺有湿润实验室擦拭纸（材料表）的载玻片盒，并将该盒放入孵育器中预热至 40 °C。
    3. 使用水浴锅将 50x 洗涤缓冲液（材料表）和探针预热至 40 °C，持续 10 分钟，随后冷却至室温。
    4. 用 50x 储备液配制 1 L 的 1x 洗涤缓冲液。
    5. 配制探针混合液（材料表）：C1 探针为即用型原液浓度，而 C2 和 C3 探针以 50x 浓度提供，需使用试剂盒中提供的稀释液进行稀释。
      注意：探针混合液可在 4 °C 下保存长达 6 个月。
  2. 蛋白酶处理
    1. 在室温下用蛋白酶 III（材料表）孵育切片 30 分钟。
      注意：确保蛋白酶 III 以及后续步骤中的孵育试剂（探针混合液、扩增溶液、封闭缓冲液和抗体血清）完全覆盖切片区域。可使用移液器吸头将试剂均匀铺展至疏水屏障内的整个切片区域。
    2. 在大型塑料方形培养皿中用 0.1 M PBS 洗涤载玻片两次，每次 2 分钟。此处使用的是 245 mm × 245 mm 的方形生物测定培养皿（材料表）。握住培养皿一侧，轻轻倾斜 3–5 次。洗涤后迅速甩去多余的 0.1 M PBS，并立即加入下一试剂。切勿让组织切片干燥。
      注意：每次洗涤时，载玻片均在室温下浸入溶液中。此流程适用于所有后续洗涤步骤。固定后的 30 µm 厚切片比 14 µm 厚切片更容易从载玻片上脱落，因此洗涤时应轻柔操作。
  3. 杂交与扩增
    1. 洗去蛋白酶溶液后，将载玻片放入已预热的加湿孵育盒中。在台式恒温孵育器内于 40 °C 下用探针混合液（材料表）孵育切片 2 小时。
      注意：应至少保留两个切片分别用于阳性对照和阴性对照探针，以评估样本 RNA 质量和通透化效果。阳性对照探针靶向看家基因；此处使用的是靶向泛素 C（UBC；高丰度）、肽基脯氨酰异构酶 B（PPIB；中等丰度）和 RNA 聚合酶 2a（POLR2A；低丰度）的 RNA 混合探针。阴性对照探针靶向细菌的 4-羟基四氢二吡啶酸还原酶（DapB）基因，该基因通常不存在于小鼠脑组织样本中。若检测到 DapB 阳性信号，提示存在非特异性信号和/或样本细菌污染。
    2. 完成探针混合液杂交后，依次进行信号扩增步骤：在 40 °C 下分别孵育 Amp 1-FL（30 分钟）、Amp 2-FL（15 分钟）、Amp 3-FL（30 分钟）和 Amp 4-FL（15 分钟）。使用提供的滴瓶将扩增溶液完全覆盖组织切片。完成最后一次扩增步骤后，继续进行免疫组化（IHC）检测。
    3. 在探针杂交与每一步扩增之间，用洗涤缓冲液冲洗载玻片两次，每次 2 分钟。

4. 免疫组化检测

  1. 免疫组化封闭步骤
    1. 为防止抗体非特异性结合，在FISH实验后，将切片置于含有10%正常马血清、0.3% Tween20的1× TBSm（50 mM Tris-Cl，pH 7.5，150 mM NaCl，0.05% merthiolate）封闭液中，室温孵育1小时。将一抗用稀释液（含1× TBSm、5%正常马血清和0.1% Tween20）配制。一抗供应商列于材料表中。
  2. 免疫组化
    1. 轻弹载玻片去除多余封闭液，加入一抗溶液，4 °C过夜孵育。
    2. 用1× TBSm洗涤载玻片3次，每次5分钟，在含1× TBSm、1%正常马血清和0.1% Tween20的稀释液中加入二抗，室温孵育2小时。本实验方案所用二抗列于材料表中。
    3. 用1× TBSm洗涤载玻片3次，每次5分钟，随后用含或不含DAPI的封片介质（材料表）封片。

5. 成像

  1. 使用配备相机的落射荧光显微镜观察免疫染色结果（详见材料表）。以20倍放大倍数采集代表性图像，并保存为TIFF文件。
  2. 将代表性图像导出至图像处理软件（材料表），调整亮度/对比度，以提高图像清晰度并真实呈现实际染色效果。

6. 可选：靶标转录本的定量分析

注意：本文为方法学文章，未提供定量结果。此处介绍的定量方法引自 Dereli et al.10。

  1. 按照 5.1 节所述方法获取感兴趣区域的图像，并对同一荧光染料的所有图像应用相同的显微镜和相机设置（如曝光时间和光照强度）。
  2. 使用图像分析软件（材料表）绘制神经元轮廓。
  3. 根据立体定位脑图谱13，以 Bregma 水平为参考对切片进行对齐。
  4. 对同一荧光染料的所有图像应用相同的亮度和对比度。仅统计具有 DAPI 染色细胞核的神经元。
  5. 在感兴趣区域内，手动计数 mRNA 表达细胞、蛋白表达细胞、mRNA/mRNA 共表达细胞、蛋白/蛋白共表达细胞以及 mRNA/蛋白共表达细胞的数量。
  6. 为减少实验结果中的偏倚，负责量化实验结果的人员应盲法处理实验分组信息。
  7. 使用以下 Abercrombie 公式对总细胞计数进行 Abercrombie 校正14：
    校正后细胞数 = 手动计数细胞数 × 切片厚度 / (切片厚度 + 细胞核大小)
    例如，对于 14 µm 厚的切片，基于 5 只动物中的 30 个细胞和 10 个切片，计算得出平均细胞核宽度为 7.7 ± 0.3 µm，平均切片厚度为 14 ± 1 µm10。根据 Abercrombie 公式，校正后细胞数为手动计数细胞数 × 14/(14+7.7)。

组织灌注-提取示意图；经心脏灌注法；FISH实验准备步骤。
图1：新鲜冷冻组织与多聚甲醛固定组织样本预处理步骤的并行工作流程。新鲜冷冻组织的处理步骤显示在红色边框的方框中，而多聚甲醛（PFA）固定组织的处理步骤显示在蓝色边框的方框中。请点击此处查看该图的放大版本。

FISH 和免疫组织化学流程图；包括杂交、扩增步骤、蛋白质标记。
图2：FISH探针与免疫组织化学联合检测流程概要。 组织预处理完成后，将载玻片上的组织用疏水屏障笔圈出（如第一帧所示），并在室温下于蛋白酶溶液中孵育。洗涤后，将组织转移至台式孵育仪中，在2小时内完成杂交，随后进行一系列扩增步骤。原位杂交系统采用专有的“Z探针”设计，以及预扩增剂和扩增剂，如第3–6帧所示6。完成FISH探针处理后，组织经洗涤并用正常马血清封闭。一抗孵育在4 °C过夜进行，以最大化抗体-抗原结合效率。二抗孵育在室温下进行，持续2小时。请点击此处查看该图的放大版本。

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结果

本文概述了一种将多重荧光原位杂交（FISH）与荧光免疫组织化学（IHC）相结合的方法，分别利用新鲜冷冻组织和多聚甲醛固定组织，在小鼠孤束核（NTS）中定位 GalR1 和 GlyT2 的 mRNA 表达。方法中所述的组织处理、FISH 和 IHC 操作流程见图1和图2。表1总结了各图中使用的 FISH 探针与抗体组合。

对照探针通常与目标探针同时进行检测，以确保实验流程的完整性并确认样本质量。DapB标记的缺失表明组织质量良好且结构完整，并无细菌污染（图3A）。针对泛素C（UBC，高丰度）、肽基脯氨酰异构酶B（PPIB，中等丰度）和RNA聚合酶2a（POLR2A，低丰度）mRNA的阳性对照探针产生的标记信号可证实RNA的完整性，且不同检测之间的信号可用于校准检测间变异（图3B）。为验证FISH探针的表达特异性，我...

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讨论

在神经科学领域，荧光原位杂交（FISH）和免疫组织化学（IHC）被常规用于研究特定神经元亚群中 mRNA 或蛋白质的空间分布及其功能意义。本研究中描述的实验方案增强了在脑切片中同时检测 mRNA 和蛋白质的能力。我们整合的多重 FISH-IHC 检测方法能够在新鲜冷冻和固定处理的脑组织样本中，对孤束核（NTS）内不同的神经元亚群进行表型鉴定。在固定冷冻的组织样本中，FISH-IHC 获得了可靠的 IHC 结果。例如，针对低丰度和高丰度 mRNA（分别为 GalR1 和 GlyT2）的多重 FISH 与靶向酪氨酸羟化酶（TH）的 IHC 结果显示，GalR1 和 GlyT2 表达于非儿茶酚胺能的 NTS 神经元中。然而，在新鲜冷冻组织中 TH 的 IHC 染色未能成功，表明在新鲜冷冻样本中进行 FISH-IHC 的能力有限。

在多种情况下，原位杂交（ISH）可能比免疫组织化学（IHC）更为合适。首先，当检测低丰度蛋白（如受体）时，IHC 的检测效果可能不佳。通过 ISH 靶向这些蛋白相对高丰度的 mRNA，可提高检测灵敏度1。其次，神经...

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致谢

本工作由澳大利亚研究理事会发现项目基金（DP180101890）和丽贝卡·L·库珀医学研究基金会项目基金（PG2018110）资助

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
动物
C57BL/6 小鼠Australian BioResources, Moss ValeMGI: 2159769
Phox2b-eGFP 小鼠Australian BioResources, Moss ValeMGI: 5776545
试剂
氰基丙烯酸酯Loctite
乙二醇Sigma-Aldrich324558
肝素钠Clifford Hallam Healthcare1070760请咨询当地兽药供应商或药房。
Lethabarb（戊巴比妥钠）安乐死注射液Virbac (Australia) Pty LtdN/A请咨询兽医，了解有关戊巴比妥钠的当地药品法规。
分子级琼脂糖粉末Sigma Aldrich5077
OCT 包埋剂，118 mLScigen Ltd4586
多聚甲醛，颗粒状，95%Sigma-Aldrich441244-1KG
聚乙烯吡咯烷酮，平均分子量 40,000  (PVP-40)Sigma-AldrichPVP40
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂InvitrogenP36930可含或不含 DAPI
RNAscope 多重荧光试剂盒（最多支持三重检测）Advanced Cell Diagnostics, Inc. (ACD Bio)ADV320850包含 50 倍洗涤缓冲液和蛋白酶 III
RNase AwayThermo-Fisher Scientific7003
三(羟甲基)氨基甲烷Sigma-Aldrich252859
Tween-20，分子生物学级Sigma-AldrichP9416
设备
台式培养箱Thermoline 科学微型培养箱型号：TEI-13G
小鼠脑切片模具，30 g 成年鼠，冠状位，1 mmTed Pella15050
冷冻切片机LeicaCM1950
抽吸针头（23 号）BD0288U07
疏水屏障笔Vector labsH-4000
Kimtech Science Kimwipes 精细擦拭纸Kimberley Clark Professional34120
Olympus BX51OlympusBX-51
蠕动泵Coleparmer MasterflexL/S 系列 
Retiga 2000R 数字相机QImagingRET-2000R-F-CLR彩色相机
SuperFrost Plus 玻片（白色）Thermo-Fisher Scientific4951PLUS4
振动切片机（Vibratome）LeicaVT1200S
Whatman 定性滤纸，1 级，直径 110 mmMerckWHA1001110
软件
CorelDRAW Corel Corporation版本 7
FIJI（ImageJ 分发版）开源/GNU 通用公共许可证 (GPL)N/AImageJ 2.x: Rueden, C. T.; Schindelin, J. & Hiner, M. C. 等 (2017), "ImageJ2: 面向下一代科学图像数据的 ImageJ", BMC Bioinformatics 18:529, PMID 29187165, doi:10.1186/s12859-017-1934-z   以及 Fiji: Schindelin, J.; Arganda-Carreras, I. & Frise, E. 等 (2012), "Fiji: 一个开源的生物图像分析平台", Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772, doi:10.1038/nmeth.2019 
一抗
酪氨酸羟化酶抗体Millipore SigmaAB1542绵羊多克隆（1:1000 稀释），RRID: AB_90755
酪氨酸羟化酶抗体，克隆 LNC1Millipore SigmaMAB318小鼠单克隆（1:1000 稀释），RRID: AB_2201528
突触小泡乙酰胆碱转运蛋白 (VAchT) 抗体Sigma-AldrichABN100山羊多克隆（1:1000 稀释），RRID: AB_2630394
GFP 抗体Novus BiologicalsNB600-308兔多克隆（1:1000 稀释），RRID: AB_10003058
Phox2b 抗体 (B-11)Santa Cruz Biotechnologysc-376997小鼠单克隆（1:1000 稀释），RRID: AB_2813765
二抗
Alexa Fluor 488 AffiniPure 驴抗兔 IgG (H+L)（最小交叉反应：牛、鸡、山羊、豚鼠、叙利亚仓鼠、马、人、小鼠、大鼠、绵羊血清蛋白） Jackson ImmunoResearch711-545-152驴抗兔（1:400 稀释），RRID: AB_2313584
AMCA AffiniPure 驴抗绵羊 IgG (H+L)（最小交叉反应：鸡、豚鼠、叙利亚仓鼠、马、人、小鼠、兔、大鼠血清蛋白）Jackson ImmunoResearch713-155-147驴抗绵羊（1:400 稀释），RRID: AB_2340725
Cy5 AffiniPure 驴抗山羊 IgG (H+L)（最小交叉反应：鸡、豚鼠、叙利亚仓鼠、马、人、小鼠、兔、大鼠血清蛋白）Jackson ImmunoResearch705-175-147驴抗山羊（1:400 稀释），RRID: AB_2340415
Cy5 AffiniPure 驴抗小鼠 IgG (H+L)（最小交叉反应：牛、鸡、山羊、豚鼠、叙利亚仓鼠、马、人、兔、大鼠、绵羊血清蛋白）Jackson ImmunoResearch715-175-151驴抗小鼠（1:400 稀释），RRID: AB_2619678
Cy5 AffiniPure 驴抗绵羊 IgG (H+L)（最小交叉反应：鸡、豚鼠、叙利亚仓鼠、马、人、小鼠、兔、大鼠血清蛋白）Jackson ImmunoResearch713-175-147驴抗绵羊（1:400 稀释），RRID: AB_2340730
RNASCOPE 探针
甘丙肽受体 1 寡核苷酸探针ACDBio448821-C1靶向 bp 482 - 1669（GenBank 参考号：NM_008082.2）
甘氨酸转运蛋白 2 寡核苷酸探针ACDBio409741-C3靶向 bp 925 - 2153（GenBank 参考号：NM_148931.3）
Phox2b 寡核苷酸探针ACDBio407861-C2靶向 bp 1617 - 2790（GenBank 参考号：NM_008888.3）

参考文献

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RNAscope FISH新鲜冷冻组织固定脑切片多重标记蛋白质亚细胞定位蛋白酶处理落射荧光显微镜脑干核团
多重荧光联合检测 原位 新鲜或固定小鼠脑切片上的荧光免疫组织化学杂交
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