多重荧光联合检测 原位 新鲜或固定小鼠脑切片上的荧光免疫组织化学杂交

摘要

本方案描述了一种结合荧光的方法 原位 荧光原位杂交（FISH）和荧光免疫组织化学（IHC）在新鲜冷冻和固定的小鼠脑切片中的联合应用，旨在实现多重标记的FISH与荧光IHC信号检测。IHC靶向细胞质和膜结合蛋白。

摘要

荧光 原位 杂交（FISH）是一种分子技术，可鉴定细胞内特定RNA转录本的存在及其空间分布。对功能已知神经元进行神经化学表型分析通常需要结合免疫组织化学（IHC）方法，使用多种抗体（靶向蛋白质）进行同时标记，并优化 原位 杂交（靶向RNA），串联进行。A "神经化学特征" 对特定神经元进行表征是可行的，但存在一些复杂因素，包括在联合使用FISH和IHC方法前需验证各自靶标，以及在同一组织切片中可同时检测的RNA和蛋白质数量有限。

本文介绍了一种利用新鲜冷冻和固定的小鼠脑组织样本的实验方案，该方案在同一脑切片上依次通过RNAscope荧光原位杂交（FISH）检测多种mRNA，再通过荧光免疫染色检测蛋白质。我们采用这种联合方法，描述了在免疫组织化学鉴定出的脑干核团中低丰度mRNA（例如，甘丙肽受体1）和高丰度mRNA（例如，甘氨酸转运蛋白2）的表达模式。

在FISH检测之后进行蛋白标记时，需要考虑的因素不仅限于组织制备和FISH探针标记的优化。例如，我们发现FISH探针检测中的蛋白酶处理步骤可能对后续免疫组化（IHC）检测中抗体的结合及标记特异性产生不利影响。蛋白酶可催化肽键的水解性断裂，促进FISH探针进入细胞，但也可能同时降解后续IHC检测所针对的靶蛋白，导致非特异性结合。靶蛋白的亚细胞定位也是影响FISH检测后IHC成功与否的另一个因素。我们观察到，当靶蛋白位于细胞膜上时，IHC的特异性得以保持；而针对细胞质蛋白的IHC则需要进行大量排错优化。最后，我们发现与新鲜冷冻组织相比，载玻片上固定的冷冻组织更难处理，但当与RNAscope联合使用时，固定冷冻组织的IHC质量总体更优。

引言

通过免疫组织化学（IHC）和/或原位杂交等方法，常用于鉴定在神经化学上定义神经元亚群的蛋白质和mRNA。 原位 原位杂交（ISH）。将ISH与免疫组织化学（IHC）技术结合，可通过最大化多重标记能力，揭示功能神经元特有的共定位模式（神经化学编码）。

荧光原位杂交（FISH）方法（包括RNAscope）相比早期的RNA检测方法（如放射性原位杂交和非放射性显色原位杂交）具有更高的灵敏度和特异性。FISH能够将单个mRNA转录本可视化为点状染色信号¹。此外，RNAscope检测技术可同时使用不同的荧光标记物，实现更多数量RNA靶标的标记。尽管具有这些优势，技术上的限制仍可能影响单次实验中可使用的荧光染料或显色剂的数量。这些限制包括显微镜滤光片组的可用性；当进行神经化学鉴定时，若将FISH与免疫组织化学（IHC）联合使用，相较于单独使用任一技术，此类限制会更加复杂，因为某一方法的最佳操作步骤可能对另一方法产生不利影响。

先前将FISH与IHC结合的应用已证实可在人类B细胞淋巴瘤²、鸡胚³、斑马鱼胚胎⁴、小鼠视网膜⁵以及小鼠内耳细胞⁶

方案

组织预处理步骤的概述见图1。所有实验操作均遵循澳大利亚国家卫生与医学研究委员会关于科学用途动物的使用与护理指南，并符合新南威尔士大学动物护理与伦理委员会的规定。

1. 新鲜冷冻脑组织的样本制备

1. 心脏灌注
   1. 配制含肝素（2500 U/L）的 0.1 M 磷酸盐缓冲液（PB），pH 7.5。将干冰与乙醇混合制成干冰乙醇浆，温度约为 −72 °C，用于组织取材后的即刻冷冻。
   2. 使用戊巴比妥钠（70 mg/kg，腹腔注射）麻醉成年 C57BL/6 和 Phox2b-GFP¹¹（小鼠基因组信息数据库编号 MGI:5776545）小鼠以实施安乐死，注射针头规格为 27.5 号。
      警告：戊巴比妥属于巴比妥类药物，高剂量时具有急性毒性，可能因呼吸抑制导致死亡。使用前请查阅当地医疗、法律及材料安全指南。
   3. 暴露心脏，用抽吸针头（23 号）插管至左心室。以含肝素的 0.1 M PB 进行心脏灌注，流速为 11–13 mL/min，持续至血液清除（约 2–3 分钟）。通过观察肝脏颜色及右心房流出液的颜色判断血液是否清除¹²。
   4. 从颅腔中取出脑组织，立即包埋于冷冻切片包埋剂（OCT）中（使用冷冻模具或铝箔），并置于干冰乙醇浴中。将....

结果

本文概述了一种将多重荧光原位杂交（FISH）与荧光免疫组织化学（IHC）相结合的方法，分别利用新鲜冷冻组织和多聚甲醛固定组织，在小鼠孤束核（NTS）中定位 GalR1 和 GlyT2 的 mRNA 表达。方法中所述的组织处理、FISH 和 IHC 操作流程见图1和图2。表1总结了各图中使用的 FISH 探针与抗体组合。

对照探针通常与目标探针同时进行检测，以确保实验流程的完整性并确认样本质量。DapB标记的缺失表明组织质量良好且结构完整，并无细菌污染（图3A）。针对泛素C（UBC，高丰度）、肽基脯氨酰异构酶B（PPIB，中等丰度）和RNA聚合酶2a（POLR2A，低丰度）mRNA的阳性对照探针产生的标记信号可证实RNA的完整性，且不同检测之间的信号可用于校准检测间变异（图3B）。为验证FISH探针的表达特异性，我.......

讨论

在神经科学领域，荧光原位杂交（FISH）和免疫组织化学（IHC）被常规用于研究特定神经元亚群中 mRNA 或蛋白质的空间分布及其功能意义。本研究中描述的实验方案增强了在脑切片中同时检测 mRNA 和蛋白质的能力。我们整合的多重 FISH-IHC 检测方法能够在新鲜冷冻和固定处理的脑组织样本中，对孤束核（NTS）内不同的神经元亚群进行表型鉴定。在固定冷冻的组织样本中，FISH-IHC 获得了可靠的 IHC 结果。例如，针对低丰度和高丰度 mRNA（分别为 GalR1 和 GlyT2）的多重 FISH 与靶向酪氨酸羟化酶（TH）的 IHC 结果显示，GalR1 和 GlyT2 表达于非儿茶酚胺能的 NTS 神经元中。然而，在新鲜冷冻组织中 TH 的 IHC 染色未能成功，表明在新鲜冷冻样本中进行 FISH-IHC 的能力有限。

在多种情况下，原位杂交（ISH）可能比免疫组织化学（IHC）更为合适。首先，当检测低丰度蛋白（如受体）时，IHC 的检测效果可能不佳。通过 ISH 靶向这些蛋白相对高丰度的 mRNA，可提高检测灵敏度¹。其次，神经.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
动物
C57BL/6 小鼠	Australian BioResources, Moss Vale	MGI: 2159769
Phox2b-eGFP 小鼠	Australian BioResources, Moss Vale	MGI: 5776545
试剂
氰基丙烯酸酯	Loctite
乙二醇	Sigma-Aldrich	324558
肝素钠	Clifford Hallam Healthcare	1070760	请咨询当地兽药供应商或药房。
Lethabarb（戊巴比妥钠）安乐死注射液	Virbac (Australia) Pty Ltd	N/A	请咨询兽医，了解有关戊巴比妥钠的当地药品法规。
分子级琼脂糖粉末	Sigma Aldrich	5077
OCT 包埋剂，118 mL	Scigen Ltd	4586
多聚甲醛，颗粒状，95%	Sigma-Aldrich	441244-1KG
聚乙烯吡咯烷酮，平均分子量 40,000  (PVP-40)	Sigma-Aldrich	PVP40
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂	Invitrogen	P36930	可含或不含 DAPI
RNAscope 多重荧光试剂盒（最多支持三重检测）	Advanced Cell Diagnostics, Inc. (ACD Bio)	ADV320850	包含 50 倍洗涤缓冲液和蛋白酶 III
RNase Away	Thermo-Fisher Scientific	7003
三(羟甲基)氨基甲烷	Sigma-Aldrich	252859
Tween-20，分子生物学级	Sigma-Aldrich	P9416
设备
台式培养箱	Thermoline 科学微型培养箱	型号：TEI-13G
小鼠脑切片模具，30 g 成年鼠，冠状位，1 mm	Ted Pella	15050
冷冻切片机	Leica	CM1950
抽吸针头（23 号）	BD	0288U07
疏水屏障笔	Vector labs	H-4000
Kimtech Science Kimwipes 精细擦拭纸	Kimberley Clark Professional	34120
Olympus BX51	Olympus	BX-51
蠕动泵	Coleparmer Masterflex	L/S 系列
Retiga 2000R 数字相机	QImaging	RET-2000R-F-CLR	彩色相机
SuperFrost Plus 玻片（白色）	Thermo-Fisher Scientific	4951PLUS4
振动切片机（Vibratome）	Leica	VT1200S
Whatman 定性滤纸，1 级，直径 110 mm	Merck	WHA1001110
软件
CorelDRAW	Corel Corporation	版本 7
FIJI（ImageJ 分发版）	开源/GNU 通用公共许可证 (GPL)	N/A	ImageJ 2.x: Rueden, C. T.; Schindelin, J. & Hiner, M. C. 等 (2017), "ImageJ2: 面向下一代科学图像数据的 ImageJ", BMC Bioinformatics 18:529, PMID 29187165, doi:10.1186/s12859-017-1934-z   以及 Fiji: Schindelin, J.; Arganda-Carreras, I. & Frise, E. 等 (2012), "Fiji: 一个开源的生物图像分析平台", Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772, doi:10.1038/nmeth.2019
一抗
酪氨酸羟化酶抗体	Millipore Sigma	AB1542	绵羊多克隆（1:1000 稀释），RRID: AB_90755
酪氨酸羟化酶抗体，克隆 LNC1	Millipore Sigma	MAB318	小鼠单克隆（1:1000 稀释），RRID: AB_2201528
突触小泡乙酰胆碱转运蛋白 (VAchT) 抗体	Sigma-Aldrich	ABN100	山羊多克隆（1:1000 稀释），RRID: AB_2630394
GFP 抗体	Novus Biologicals	NB600-308	兔多克隆（1:1000 稀释），RRID: AB_10003058
Phox2b 抗体 (B-11)	Santa Cruz Biotechnology	sc-376997	小鼠单克隆（1:1000 稀释），RRID: AB_2813765
二抗
Alexa Fluor 488 AffiniPure 驴抗兔 IgG (H+L)（最小交叉反应：牛、鸡、山羊、豚鼠、叙利亚仓鼠、马、人、小鼠、大鼠、绵羊血清蛋白）	Jackson ImmunoResearch	711-545-152	驴抗兔（1:400 稀释），RRID: AB_2313584
AMCA AffiniPure 驴抗绵羊 IgG (H+L)（最小交叉反应：鸡、豚鼠、叙利亚仓鼠、马、人、小鼠、兔、大鼠血清蛋白）	Jackson ImmunoResearch	713-155-147	驴抗绵羊（1:400 稀释），RRID: AB_2340725
Cy5 AffiniPure 驴抗山羊 IgG (H+L)（最小交叉反应：鸡、豚鼠、叙利亚仓鼠、马、人、小鼠、兔、大鼠血清蛋白）	Jackson ImmunoResearch	705-175-147	驴抗山羊（1:400 稀释），RRID: AB_2340415
Cy5 AffiniPure 驴抗小鼠 IgG (H+L)（最小交叉反应：牛、鸡、山羊、豚鼠、叙利亚仓鼠、马、人、兔、大鼠、绵羊血清蛋白）	Jackson ImmunoResearch	715-175-151	驴抗小鼠（1:400 稀释），RRID: AB_2619678
Cy5 AffiniPure 驴抗绵羊 IgG (H+L)（最小交叉反应：鸡、豚鼠、叙利亚仓鼠、马、人、小鼠、兔、大鼠血清蛋白）	Jackson ImmunoResearch	713-175-147	驴抗绵羊（1:400 稀释），RRID: AB_2340730
RNASCOPE 探针
甘丙肽受体 1 寡核苷酸探针	ACDBio	448821-C1	靶向 bp 482 - 1669（GenBank 参考号：NM_008082.2）
甘氨酸转运蛋白 2 寡核苷酸探针	ACDBio	409741-C3	靶向 bp 925 - 2153（GenBank 参考号：NM_148931.3）
Phox2b 寡核苷酸探针	ACDBio	407861-C2	靶向 bp 1617 - 2790（GenBank 参考号：NM_008888.3）