基于样品腔的光片荧光显微镜中对多个昆虫胚胎进行同步活体成像

摘要

光片荧光显微镜是发育生物学中最有价值的工具。在比较研究中，一个主要问题是环境变异。我们的实验方案描述了一种可同时对多个样本进行活体成像的实验框架，从而主动解决了这一问题。

摘要

基于光片的荧光显微镜技术为在多个生物学相关尺度上研究复杂过程提供了高效的解决方案。在发育生物学中，基于样品腔的成像系统是最佳选择，这类系统专门设计用于保持样品的三维完整性，通常还具备样品旋转功能。例如，此类系统已被用于记录黑腹果蝇Drosophila melanogaster和赤拟谷盗Tribolium castaneum的整个胚胎形态发生过程。然而，目前许多可用的活体成像方案仅提供针对单个胚胎的实验框架。对于比较研究而言，这类方法存在诸多不便，因为依次成像的样品会受到环境差异的影响。此外，这种方法也限制了在特定时间内可检测的样品数量。我们提供了一种可实现同步活体成像的实验框架，可在基于样品腔的成像系统中提高通量，从而确保所有样品处于 相似的环境条件下。首先，我们提供了光片荧光显微镜的校准指南；其次，我们提出了一种适用于多个胚胎的固定方法，该方法兼容样品旋转；第三，我们提供了果蝇Drosophila的示例性三维活体成像数据集，其中并列展示了三个荧光标记细胞核的转基因品系，同时也提供了赤拟谷盗Tribolium的数据集，比较了携带相同转基因但插入基因组位置不同的三个转基因亚系的成像效果。本实验方案专为比较研究设计，能够主动应对始终存在于顺序活体成像中的环境差异。这一点对于定量分析以及异常表型的表征尤为重要，例如由基因敲除实验所导致的表型变化。此外，该方案显著提高了整体通量，当光片 荧光显微镜的使用机会有限时，这一点尤为便利。最后，所提出的固定方法可轻松适配于其他昆虫物种及其他模式生物，例如斑马鱼，基本无需额外优化。

引言

荧光显微镜是生命科学领域中最基本的成像技术之一，尤其在细胞生物学和发育生物学中应用广泛。自20世纪90年代中期以来，共聚焦荧光显微镜¹已成为三维荧光成像的先进手段，其使用同一物镜进行荧光团激发和发射光检测。照明激光束会激发照明/检测轴线上所有的荧光团，而相应的离焦信号则在 检测前通过针孔被排除。因此，每获取一幅二维图像时，整个样品都会被照射一次。相应地，每获得一幅三维图像（即一系列空间上连续的二维图像堆叠而成）时，整个样品会被照射数十次至数百次²，这容易导致光漂白和光毒性³。

近二十年前，基于光片的技术⁴ 已成为三维荧光成像的一种有前景的替代方法，因而成为发育生物学中的重要工具⁵在此方法中，照明与检测相互解耦。照明物镜用于生成具有特定深度的光片 仅为几微米的范围，位于垂直排列的检测物镜的焦平面内。因此，对于每幅二维图像，仅焦平面附近的一个薄层平面体积被照明。相应地，对于每幅三维图像，整个样品仅被照明一次，这显著降低了光漂白和光毒性⁶因此，光片荧光显微镜（LSFMs）提供 在发育生物学中，需要在亚细胞水平上分析长达数毫米的样本，因此，能够在多个生物学相关尺度上高效研....

方案

1. 准备工作

1. 根据科学问题选择适合的光片显微镜（LSFM）照明物镜/检测物镜/相机组合，并设置显微镜。视场大小等于相机芯片尺寸除以检测物镜的放大倍数。应选择照明物镜，使整个视场被一个近似平面的光片覆盖³⁴。三种推荐组合见表1。
2. 制备琼脂糖分装样品和回收培养皿时，将2 g低熔点琼脂糖加入200 mL经高压灭菌的自来水，于微波炉中以600–800 W加热，直至所有琼脂糖颗粒完全溶解。将若干份1 mL琼脂糖溶液分装至1.5 mL或2 mL离心管中，再将若干90 mm Ø培养皿倒入3–5 mm高的琼脂糖。将凝固后的分装样品和培养皿于4 °C保存。
3. 对于Drosophila：为准备新鲜培养管，煮制适量自制或市售的Drosophila培养基，将5–15 mL转移至宽口培养管中，并于4 °C保存。为制备产卵培养皿，将1 g低熔点琼脂糖加入50 mL高压灭菌自来水中，于微波炉中以600–800 W加热至琼脂糖完全溶解。待溶液冷却至45 °C后，加入50 mL果汁（推荐苹果汁或红葡萄汁），充分混匀。将混合液倒入35 mm Ø培养皿中，凝固后于4 °C保存。
4. 对于Tribolium：为制备生长培养基，将全麦面粉和失活干酵母分别过710 µm孔径筛网，然后在过筛后的面粉中添加5%（w/w）过筛酵母。为制备产卵培养基，将细麦粉和失活干酵....

结果

本方案描述了一种基于样品腔的激光扫描荧光显微镜（LSFM）中进行比较性活体荧光成像的实验框架。例如，该框架可用于并列比较：（i）两种或多种物种的胚胎，（ii）一种或多种基因被敲除的品系胚胎及其野生型对照，（iii）同一转基因品系的多个胚胎，（iv）不同转基因品系的胚胎，或（v）携带相同转基因但插入基因组位置不同的亚系胚胎。在本节中，我们将以前述最后两种情况为例进行说明。

在我们的首个示范应用中，我们展示了来自不同转基因品系的三个胚胎的荧光信号动态变化 果蝇 线条（表 2约1天的时间内（图4, 补充视频 1）。对于这些品系，我们原本预期其荧光模式较为相似，因为它们均在不同启动子的调控下表达核定位的EGFP/GFP，而这些启动子据信均为普遍表达且组成型活跃。然而，我们的比较性活体成像结果显示，其表达模式存在显著的时空差异，这些差异显然并非由环境变异引起的继发效应。

在我们的第二个应用实例.......

讨论

光片荧光显微镜（LSFM）的独特应用领域之一是发育生物学。在该学科中，观察活体样本至关重要，否则无法以动态方式描述形态发生过程。本文所述的基于样品腔的 LSFM 同时进行活体成像的实验框架具有两个主要优势，因而十分便捷。

在连续活体成像过程中，环境变异是不可避免的，但可以主动加以应对。在与昆虫胚胎相关的活体成像中，我们观察到如下一些易受影响的因素：卵收集培养物在胚胎采集时可能具有不同的年龄。在Drosophila中已证明，这会影响后代的质量⁴⁵。尽管可以采用适当去同步化的培养物进行实验，但使用同步化培养物进行同时成像则要方便得多。基于Drosophila和Tribolium的代表性结果均来自同步化卵收集培养物，因此我们可以有把握地排除荧光特性的差异是由亲代衰老所导致的非预期效应。

去壳是关键步骤，因为胚胎长时间暴露于次氯酸钠会降低其活力。然而，次氯酸钠的离子强度会随时间下降，带来不便。尽管可以测定其离子强度

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6孔板	Orange Scientific	4430500
24孔板	Orange Scientific	4430300	仅用于涉及Tribolium的活体成像
35 mm Ø 培养皿	Fisher Scientific	153066	仅用于涉及Drosophila的活体成像。
90 mm Ø 培养皿	Fisher Scientific	L9004575
100 µm 孔径细胞筛	BD Biosciences	352360
250 µm 孔径筛网	VWR International	200.025.222-038	仅用于涉及Tribolium的活体成像
300 µm 孔径筛网	VWR International	200.025.222-040	仅用于涉及Tribolium的活体成像
710 µm 孔径筛网	VWR International	200.025.222-050	仅用于涉及Tribolium的活体成像
800 µm 孔径筛网	VWR International	200.025.222-051	仅用于涉及Tribolium的活体成像
405细小麦粉	Demeter e.V.	SP061006	仅用于涉及Tribolium的活体成像
市售果蝇培养基	Genesee Scientific	66-115	仅用于涉及Drosophila的活体成像 / 也可使用自制Drosophila培养基
荧光微球，1.0 µm Ø	Thermo Fisher Scientific	T7282
灭活干酵母	Genesee Scientific	62-108
低熔点琼脂糖	Carl Roth	6351.2
窄瓶	Genesee Scientific	32-109	仅用于涉及Drosophila的活体成像
小型画笔	VWR International	149-2121
次氯酸钠（NaOCl），约12%有效氯	Carl Roth	9062.3	注意：次氯酸钠具有腐蚀性
全麦面粉	Demeter e.V.	SP061036	仅用于涉及Tribolium的活体成像 / 英国：全麦粉（wholemeal flour）
宽瓶	Genesee Scientific	32-110	仅用于涉及Drosophila的活体成像