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方法文章

基于线性判别分析效应量（LEfSe）的微生物组数据生物标志物辅助筛选

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DOI：

10.3791/61715

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2022年5月16日

 ,  , 
1Marine Resources Research Centre, Tianjin Research Institute for Water Transport Engineering, M.O.T., 2Key Laboratory of Regional Energy Systems Optimization, Ministry of Education, College of Environmental Science and Engineering, North China Electric Power University, 3School of Environmental Science and Engineering, Huazhong University of Science and Technology

* These authors contributed equally

本文内容

Retraction Notice

The article <em>基于线性判别分析效应量（LEfSe）的微生物组数据生物标志物辅助筛选</em> (10.3791/61715) has been retracted by the journal upon the authors' request due to a conflict regarding the data and methodology.

摘要

LEfSe（LDA效应大小）是一种用于高维生物标志物挖掘的工具，可识别在微生物组数据中显著表征两个或多个组的基因组特征（如基因、通路和分类群）。

摘要

目前，人们对环境和健康中封闭生物基因组的关注日益增加。为了探索并揭示不同样本或环境之间的组间差异，发现具有统计学差异的生物标志物至关重要。应用线性判别分析效应量（LEfSe）方法有助于寻找优良的生物标志物。基于原始基因组数据，首先根据分类单元或基因对不同序列进行质量控制和定量分析。接着，采用Kruskal-Wallis秩和检验来识别统计学和生物学组之间的特异性差异；然后，在前一步获得的两组之间进行Wilcoxon秩和检验，以评估差异是否具有一致性；最后，通过线性判别分析（LDA）根据LDA得分评估生物标志物对显著不同组别的影响程度。综上所述，LEfSe为识别表征生物组间统计学差异的基因组生物标志物提供了便利。

引言

生物标志物是可以测量的生物学特征，能够指示某些现象，如感染、疾病或环境变化。其中，功能生物标志物可能为单一物种特有的生物学功能，或为某些物种共有的功能，例如基因、蛋白质、代谢物及代谢通路。此外，分类学生物标志物指示异常的物种、生物类群（界、门、纲、目、科、属、种）、扩增子序列变异体（ASV）1，或操作分类单元（OTU）2。为了更快速、准确地发现生物标志物，有必要使用一种用于分析生物数据的工具。类群丰度差异可通过LEfSe结合统计显著性标准检验，以及编码生物学一致性和效应相关性的附加检验加以解释3。LEfSe可作为Galaxy模块、Conda公式、Docker镜像使用，并集成于bioBakery（虚拟机和云平台）中4。通常，微生物多样性分析常采用非参数检验方法，以应对样本群落分布的不确定性。秩和检验是一种非参数检验方法，通过使用样本的秩次代替原始数值进行分析。根据样本组数的不同，可分为用于两组样本比较的Wilcoxon秩和检验，以及用于多组样本比较的Kruskal-Wallis检验5,6。值得注意的是，当多组样本间存在显著差异时，应进一步进行多组间的成对比较秩和检验。LDA（即线性判别分析，Linear Discriminant Analysis），由Ronald Fisher于1936年提出，是一种监督学习方法，亦称为Fisher线性判别7，是当前机器学习与数据挖掘领域中经典且广泛应用的算法。

此处，LEfSe 分析已通过 Conda 和 Galaxy 服务器进行了优化。分析了三组 16S rRNA 基因序列，以展示不同组间微生物群落的 LDA 分值差异及可视化结果。

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方案

注意：本实验方案源自 Segata 等人的研究3，并进行了修改。该方法可在 https://bitbucket.org/biobakery/biobakery/wiki/lefse 获取。

1. 分析用输入文件的准备

  1. 准备LEfSe的输入文件（表1），该文件可通过多种工作流程8或先前的实验方案9，利用原始文件（样本文件及相应的物种注释文件）轻松生成。

2. LEfSe 本地分析（仅限于 Linux 服务器）

  1. LEfSe 安装
    注意：建议使用 Conda10 安装 LEfSe 分析流程。
    1. 运行以下命令以排除依赖冲突的可能性。为 LEfSe 创建一个 conda 环境（此步骤为推荐操作，非必需）。-n 表示环境名称。
      $ conda create -n LEfSe-env
    2. 要激活已创建的 LEfSe 环境，请运行：
      $ source activate LEfSe-env
    3. 通过 bioBakery 通道安装 LEfSe，其中 -c 表示通道名称，请运行：
      $ conda install -c biobakery lefse
  2. 为 LEfSe 格式化数据
    1. 运行以下命令，将原始文件格式转换为 LEfSe 的内部格式。Table.txt 为输入文件，Table-reformat.in 为输出文件。-c 用于设置作为分类（默认值为 1）的特征，-o 用于设置标准化值（默认值为 -1.0，表示不进行标准化）。
      $ format_input.py Table.txt Table-reformat.in -c 1 -o 1000000
  3. 计算线性判别分析（LDA）效应量
    1. 运行以下命令。此步骤的目的是对上一步结果执行 LDA 分析，并生成用于可视化的结果文件。Table-reformat.in 由前一步生成，作为本步骤的输入文件，Table-reformat.res 为输出结果文件。
      $ run_lefse.py Table-reformat.in Table-reformat.res
  4. 绘图可视化
    1. 绘制 LEfSe 结果。将生物标志物的效应量绘制成 PDF 文件，Table-reformat.res 由上一步生成，LDA.pdf 为输出图形文件。--format 用于设置输出文件格式。
      $ plot_res.py Table-reformat.res LDA.pdf --format pdf
    2. 绘制进化分支图（cladogram）。用于绘制物种树并在进化分支图中展示生物标志物。cladogram.pdf 为输出文件。
      $ plot_cladogram.py Table-reformat.res cladogram.pdf --format pdf
    3. 绘制单个特征（可选） 用于绘制单个生物标志物在不同组之间的差异。-f 用于设置绘图特征。若设置为 one，则必须提供 --feature_name 参数。
      $ plot_features.py -f one --feature_name "k__Bacteria.p__Firmicutes.c__Bacilli.o__Bacillales" --format pdf Table-reformat.in Table-reformat.res Bacillales.pdf
    4. 绘制差异特征（可选），用于绘制所有特征，但内容较多需谨慎使用。--archive 用于选择是否压缩结果。./ 表示结果的存储路径。
      $ plot_features.py -f diff --archive none --format pdf Table-reformat.in Table-reformat.res ./

3. LEfSe 在线分析（galaxy）

  1. 访问 Huttenhower Galaxy 服务器11：http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy。
  2. 上传文件。点击左侧窗格中的上传箭头按钮，上传文件。点击选择本地文件以选择输入文件，并将格式设置为表格形式（tabular），然后点击开始按钮。
    注意：参考网页（https://bitbucket.org/biobakery/biobakery/wiki/lefse），使用脚本（taxonomy_summary.R）生成 LEfSe 的输入文件，所需格式为（每一列对应一个组名，每一行以“|”分隔不同层级的注释信息），如表 1所示。上传过程的示意图见图 1。
  3. 为 LEfSe 格式化数据。在左侧窗格中点击LEfSe | 为 LEfSe 格式化数据（Format Data for LEfSe）链接，选择文件中用于分类的特定行，然后点击执行（Execute）按钮。操作流程及所用参数的示意图见图 2。
  4. 计算 LDA 效应值。在左侧窗格中点击LEfSe | LDA 效应大小（LEfSe）链接，根据分析需求设置参数值，然后点击执行（Execute）按钮。操作流程及所用参数的示意图见图 3。
  5. 绘制 LEfSe 结果图。在左侧窗格中点击LEfSe | 绘制 LEfSe 结果（Plot LEfSe Results）链接，然后点击执行（Execute）按钮。操作流程及所用参数的示意图见图 4。
  6. 绘制进化树图（cladogram）。在左侧窗格中点击绘制进化树（Plot Cladogram），设置参数值后点击执行（Execute）按钮。操作流程及所用参数的示意图见图 5。
  7. 绘制单个特征图。在左侧窗格中点击绘制单个特征（Plot One Feature），设置参数值后点击执行（Execute）按钮。操作流程及所用参数的示意图见图 6。
  8. 绘制差异特征图。在左侧窗格中点击绘制差异特征（Plot Differential Features），设置参数值后点击执行（Execute）按钮。操作流程及所用参数的示意图见图 7。
    注意：生成的图像可在右侧窗格的结果输出中进行可视化查看并下载。

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结果

通过分析三个样本的16S rRNA基因序列，获得各组间存在显著差异的微生物群落的LDA得分，结果如图8所示。柱状图的颜色代表不同的组别，柱长表示LDA得分，反映的是不同组间具有显著差异物种的影响程度。图中展示的是LDA得分高于预设阈值的显著差异物种。默认的预设阈值为2.0，因此图中仅显示LDA得分绝对值（横坐标）大于2.0的结果。

不同分类层级间具有显著差异的生物标志物及物种树如图9所示。从内到外的同心圆环代表从门到属的分类层级（最内侧的黄色圆环为界）。在不同分类层级上每个小圆的直径表示其相对丰度的大小。无显著差异的物种统一用黄色表示，具有显著差异的物种生物标志物则以相应组别的颜色标注。A、B 和 C 类为所采集微生物样本的分组名称。红色节点表示在红色组（A）中起重要作用的微生物类群；绿色节点表示在绿色组（B）中起重要作用的微生物类群；蓝色节点表示在蓝色组（C）中起重要作用的微生物类群。图中未直接标出的生物标志物对应物种名称显示在右侧，字母编号与图中相对应（默认仅...

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讨论

本文描述了在不同组别中识别和表征生物标志物的实验方案。该方案可轻松适用于其他类型的样本，例如微生物的操作分类单元（OTUs）。LEfSe 统计方法可用于发现各组中的特征性微生物（默认为 LDA >2），即在该组中相对于其他组更为丰富的微生物12。LEfSe 提供本地版和基于网页的 Linux 版本，用户也可在网页上直接进行 LEfSe 分析。LEfSe 基于线性判别分析（LDA）算法，需要物种层级信息以构建物种进化树。通过该工具的应用，可比较组间的相对丰度。所有差异性生物标志物均可在同一张图中展示，也可批量绘制单个或全部生物标志物的图表。

无论通过本地服务器还是在线网站执行LEfSe分析，都需要设置大量可调节参数以生成所需的图表。由于输入文件结构复杂，且需要将其转换为LEfSe进一步分析所要求的数据格式，因此已开发出一些一站式服务工具。尽管如此，实现操作简便性的优化仍具有挑战性。另一方面，使用LEfSe分析复杂数据时存在一些局限性。线性判别分析（LDA）所投影的特征维度比类别数少一维，若需要更多特征，则需引入其他方法。LDA的...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金（TKS170205）、科学技术发展基金以及交通运输部天津水运工程科学研究院（TIWTE）（KJFZJJ170201）资助。

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参考文献

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  2. Knight, R., et al. Best practices for analysing microbiomes. Nature Reviews. Microbiology. 16 (7), 410-422 (2018).
  3. Segata, N., et al. Metagenomic biomarker discovery and explanation. Genome Biology. 12 (6), 60(2011).
  4. McIver, M., Sayoldin, B., Shafquat, A. Biobakery / lefse [tool]. , Available from: https://bitbucket.org/biobakery/biobakery/wiki/lefse (2019).
  5. Kruskal, W. H. A nonparametric test for the several sample problem. The Annals of Mathematical Statistics. 23 (4), 525-540 (1952).
  6. Wilcoxon, F. Individual comparisons by ranking methods. Biometrics Bulletin. 1 (6), 80-83 (1945).
  7. Fisher, R. A. The use of multiple measurements in taxonomic problems. Annals of Eugenics. 7 (1), 179-188 (1936).
  8. Liu, Y. X., et al. A practical guide to amplicon and metagenomic analysis of microbiome data. Protein and Cell. 41 (7), 1-16 (2020).
  9. Shahi, S. K., Zarei, K., Guseva, N. V., Mangalam, A. K. Microbiota analysis using two-step PCR and next-generation 16S rRNA gene sequencing. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (152), e59980(2019).
  10. Grüning, B., et al. Bioconda: sustainable and comprehensive software distribution for the life sciences. Nature Methods. 15 (7), 475-476 (2018).
  11. Blankenberg, D., Chilton, J., Coraor, N. Galaxy external display applications: closing a dataflow interoperability loop. Nature Methods. 17 (2), 123-124 (2020).
  12. Langille, M. G. I., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814-821 (2013).
  13. Shilei, Z., et al. Reservoir water stratification and mixing affects microbial community structure and functional community composition in a stratified drinking reservoir. Journal of Environmental Management. 267, 110456(2020).

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