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方法文章

使用四维（x, y, z 和 λ）高光谱FRET成像与分析技术测量活细胞中三维cAMP分布

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DOI：

10.3791/61720

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2020年10月27日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, University of South Alabama, 2Center for Lung Biology, University of South Alabama, 3Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of South Alabama

本文内容

摘要

由于基于 Förster 共振能量转移（FRET）的传感器本身信噪比（SNR）较低，cAMP 信号的测量一直具有挑战性，尤其是在三维空间中。本文介绍了一种高光谱 FRET 成像与分析方法，可实现三维空间内 cAMP 分布的测量。

摘要

环磷酸腺苷（cAMP）是一种参与多种细胞和生理活动的第二信使。多项研究表明，cAMP信号具有区室化特征，而这种区室化有助于cAMP信号通路中的信号特异性。基于 Förster 共振能量转移（FRET）的生物传感器的发展，增强了在细胞内测量和可视化cAMP信号的能力。然而，这些测量通常局限于二维空间，可能导致数据的误读。迄今为止，由于FRET传感器本身信噪比（SNR）较低的技术限制，对cAMP信号在三维空间（x、y和z）中的测量仍极为有限。此外，传统的基于滤光片的成像方法在准确测量局部亚细胞区域的cAMP信号时往往效果不佳，原因包括光谱串扰、信号强度有限以及自发荧光等多种因素。为了克服这些局限性，并使基于FRET的生物传感器能够与多种荧光团联合使用，我们开发了高光谱FRET成像与分析方法，该方法通过光谱特异性计算FRET效率，并能够将FRET信号与干扰性的自发荧光和/或额外荧光标记物的信号在光谱上分离。本文介绍了实施高光谱FRET成像的方法，以及构建适当光谱库的必要性——该光谱库既不能欠采样，也不能过采样，以实现准确的光谱解混。尽管本文以肺微血管内皮细胞（PMVECs）中三维cAMP分布的测量为例展示该方法，但该方法也可用于研究多种细胞类型中cAMP的空间分布。

引言

环磷酸腺苷（cAMP）是一种第二信使，参与多种关键的细胞和生理过程，包括细胞分裂、钙离子内流、基因转录和信号转导。越来越多的证据表明，细胞内存在cAMP区室化结构，从而实现信号传导的特异性1,2,3,4,5,6,7。直到最近，cAMP的区室化现象主要是根据不同的G蛋白偶联受体激动剂所诱导的特异性生理或细胞效应间接推断得出的8,9,10,11。近年来，基于荧光共振能量转移（FRET）的荧光成像探针为直接测量和观察细胞内cAMP信号提供了新的方法12,13,14。

荧光共振能量转移（FRET）是一种物理现象，当供体和受体分子彼此靠近时，能量以非辐射方式在两者之间发生转移15,16。随着基于FRET的荧光探针的发展，这一物理现象已被广泛应用于生物学研究中，用于检测蛋白质-蛋白质相互作用17、蛋白质共定位18、Ca+2信号传导19、基因表达20、细胞分裂21以及环核苷酸信号通路。基于FRET的cAMP探针通常包含一个cAMP结合域、一个供体荧光团和一个受体荧光团22。例如，本方法中使用的H188 cAMP传感器12,22由来自Epac的cAMP结合域构成，并夹在Turquoise（供体）和Venus（受体）荧光团之间。在基础状态（未结合cAMP时），Turquoise与Venus的空间取向使得两者之间发生FRET；当cAMP结合到结合域后，分子构象发生变化，导致Turquoise与Venus彼此分离，从而引起FRET信号减弱。

基于FRET的成像方法为研究和可视化细胞内的cAMP信号提供了一种有前景的工具。然而，目前基于FRET的显微成像技术在实现足够信号强度以在亚细胞空间分辨率下测量FRET方面往往只能部分成功。这主要归因于多个因素，包括许多FRET报告分子的信号强度有限、精确量化FRET效率变化所需的高精度要求，以及诸如细胞自发荧光等干扰因素的存在23,24。其结果通常是FRET图像信噪比（SNR）较低，使得亚细胞水平上FRET变化的可视化极为困难。此外，对空间定位的cAMP信号的研究几乎完全局限于二维空间，而轴向cAMP分布很少被考虑25。这很可能是因为低信噪比阻碍了在三维空间中测量和可视化cAMP梯度的能力。为了克服使用低信噪比FRET传感器的局限性，我们采用了高光谱成像与分析方法来在单个细胞中测量FRET25,26,27。

高光谱成像技术最初由美国国家航空航天局（NASA）开发，用于区分卫星图像中地表存在的不同物体28,29。这些技术随后被引入荧光显微镜领域30，目前已有多种商用共聚焦显微镜系统配备了光谱探测器。在传统的（非光谱）荧光成像中，样品通过带通滤光片或激光谱线激发，并使用第二个带通滤光片收集发射光，该滤光片通常选择与荧光团的峰值发射波长相匹配。相比之下，高光谱成像技术旨在以特定波长间隔，对荧光发射26,31,32或激发33,34进行完整的光谱轮廓采样。在我们之前的研究中，我们已证明，与传统的基于滤光片的FRET成像技术相比，高光谱成像与分析方法能够更准确地量化细胞中的FRET信号26。本文中，我们介绍了一种用于执行四维（x、y、z和λ）高光谱FRET成像与分析的方法，以在三个空间维度中测量并可视化cAMP的分布情况。这些方法使我们能够在单个细胞中观察到激动剂诱导产生的cAMP空间梯度25。有趣的是，根据所使用的激动剂不同，细胞中可能出现明显的cAMP梯度。本文所述方法利用光谱解混技术，对非均匀背景和细胞自发荧光进行分离，从而提高FRET测量的准确性。尽管本方法以cAMP FRET生物传感器在肺微血管内皮细胞（PMVECs）中的应用为例进行展示，但该方法可轻松修改后适用于其他FRET报告分子或不同细胞系。

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方案

本方案遵循南阿拉巴马大学机构动物照护与使用委员会批准的程序。

1. 成像用细胞、样品和试剂的准备

  1. 按照先前所述方法分离大鼠肺微血管内皮细胞（PMVECs）35。
    注：细胞由位于美国阿拉巴马州莫比尔市的南阿拉巴马大学细胞培养核心实验室分离并培养于100 mm细胞培养皿中。
  2. 将分离的PMVECs接种于25 mm圆形玻璃盖玻片上，并在37 °C培养箱中培养至细胞融合度至少达到80%（至少24小时）。
    注：不同研究中所用细胞及其类型可能有所不同，因此应遵循特定细胞的培养操作规程进行接种和培养。本研究所用的细胞接种与培养方案详见名为“补充文件_细胞培养与转染”的补充信息文件。
  3. 用FRET生物传感器转染PMVECs，并在37 °C下孵育48小时。
    注：PMVECs的转染方案亦见于名为“补充文件_细胞培养与转染”的补充信息文件中。
  4. 成像当天，将Tyrode缓冲液置于水浴中预热至37 °C。
    注：Tyrode缓冲液的成分为145 mM NaCl、4 mM KCl、10 mM HEPES、10 mM葡萄糖、1 mM MgCl2和1 mM CaCl2。
  5. 将含有转染细胞的盖玻片安装至细胞腔室中，并用密封垫圈固定顶部，防止泄漏。
  6. 使用精细擦拭纸轻轻擦拭盖玻片底部，去除多余的培养基或附着的细胞。
  7. 向细胞腔室中加入800 µL工作缓冲液和4 µL 5 mM核染料，轻轻晃动5–10秒。
    注：向安装在细胞腔室中的盖玻片添加缓冲液或试剂溶液时，应轻柔地沿腔室侧壁加入，避免冲落贴壁细胞。将4 µL 5 mM核染料加入800 µL缓冲液中，最终核染料浓度为25 µM。对于贴壁较松散的细胞（如HEK293细胞），应先将核染料与缓冲液在离心管中混合，再加入安装于细胞腔室中的盖玻片，以防止细胞从盖玻片上脱落。
  8. 用铝箔覆盖细胞腔室以避光，并在室温下孵育10分钟。
  9. 试剂配制：将1 µL 50 mM佛司可林（forskolin）加入199 µL缓冲液中。当该溶液加入已用800 µL缓冲液处理的细胞时，佛司可林的终浓度为50 µM。同时应配制1 µL DMSO溶于199 µL缓冲液，作为溶剂对照。
    注：在本研究中，佛司可林作为腺苷酸环化酶激活剂，用于刺激cAMP生成。如有需要，该方法可轻松修改，以适用于其他刺激或抑制腺苷酸环化酶、磷酸二酯酶等的试剂处理。

2. 图像采集

  1. 使用配备光谱检测器的共聚焦显微镜。
    注意：此处所述的所有图像采集步骤均使用 commercially available Nikon A1R 显微镜系统开发。若使用其他光谱显微镜，这些步骤可能需要调整。确保所有设备在实验开始前至少提前 30 分钟开启，以达到稳定的运行状态。
  2. 选择 60x 水浸物镜，并在物镜上滴加一滴水。
    注意：对于高分辨率活细胞成像，建议使用高数值孔径物镜。有关本研究中所用物镜的信息，请参见材料列表。
  3. 将已加载细胞的腔室（来自步骤 1.7）放置于显微镜载物台上。
  4. 通过调节显微镜右侧的滤光片旋钮，选择 DFT（DAPI/FITC/TRITC）滤光片组。
  5. 使用目镜以荧光宽场模式操作显微镜，选择一个包含表达 cAMP FRET 传感器细胞的视野。
    注意：确保所选细胞中供体或受体发射峰波长处的 FRET 信号平均强度至少为 100 强度单位（A.U.），或至少为无表达细胞区域基线信号的 4 倍。可通过 NIS Elements 软件中的光谱轮廓查看器确认此条件。在寻找信号良好的细胞时，建议弃用过亮的细胞（可能已受损）。
  6. 打开 NIS 软件，切换至共聚焦模式，解锁激光联锁按钮，然后点击 Live。
  7. 使用调焦旋钮，通过观察屏幕上的预览图像对细胞进行聚焦。
  8. 按照以下说明在软件中配置设备、采集和 z-stack 设置。
  9. 采集设置：
    注意：相机和设备采集设置可基于先前采集的图像进行应用。打开图像后，右键单击并选择 Reuse Camera Settings。
    1. 打开 A1 设置菜单，勾选对应 405 nm 和 561 nm 激光线的选项，为光谱检测器选择 SD，将分辨率设为 10，通道数设为 31。
      注意：A1 设置菜单显示为 A1 Plus Settings 窗口左上角的小齿轮图标。405 nm 激光用于供体激发，561 nm 激光用于核标记物激发。
    2. 通过选择起始和终止波长值，设置波长范围（410 – 730 nm）。
    3. 点击 A1 设置菜单中的 binning/skip 图标，选择编号为 15 的方框，然后点击 A1 设置菜单中的 OK。
      注意：此操作旨在移除对应于 561 nm 激发激光的波长通道（通常为第 15th 波长通道）。避免使用该波段至关重要，以防人为导致信号偏低，从而产生光谱伪影。该波段信号较低的原因是机械挡片覆盖了检测器元件，以防止激光损伤。
    4. 将 405 nm 和 561 nm 激光的激光强度分别设为 8% 和 2%，Si Hv（检测器增益）设为 149，针孔半径设为 2.4 airy disk units（AU）。
      注意：激光强度可能需要根据仪器使用年限和激光状态进行调整。若在不同样本或实验组之间调整激光强度，应保持激光强度比例一致（例如 8:2）。此外，应选择不会导致快速光漂白的激光强度。检测器增益应调整至在最小化检测器噪声的同时最大化信号强度。本研究中使用了 149 的增益值。选择 2.4 AU 的针孔尺寸是为了在获得足够信噪比（SNR）的图像与保持光学切片能力（共焦性）之间取得平衡。增大针孔尺寸可提高 SNR，但会降低共焦性。
    5. 将扫描速度设为每秒 0.25 个光谱帧，选择对应单向扫描的图标，输入计数为 4，并将扫描尺寸设为 1024 x 1024。
      注意：FRET 信号较弱，通常需要较慢的扫描速度。使用 0.25 的扫描速度时，完成一个光谱 z-stack 采集约需 3 分钟。扫描速度可根据所用荧光团进行调整。例如，对于 eGFP 等较亮的荧光团，可使用更快的扫描速度（2 帧/秒）。输入的计数值对应帧平均值为 4，有助于在图像采集过程中降低噪声。对于非常稳定的样本且时间不受限制时，可使用更高的平均值（最高达 16）以获得信噪比更优的图像。
  10. 定义 z-stack 采集参数：
    注意：步骤 2.10 中输入的数值可能需要调整，以适应荧光标记物结合或浓度变化、标记物类型、所用标记物数量、细胞系以及可能影响细胞标记密度和/或细胞自发荧光的其他样本制备变化。调整采集参数时，应注意在最小化光漂白的同时实现足够的信噪比。此外，在配置光谱 FRET 检测时，应确保参数在所有处理组中均能良好工作。建议对每种处理组使用拟议的参数设置进行试运行，以确保信噪比足够且光漂白最小化。
    1. 点击 view → acquisition control → ND acquisition，打开 ND 采集窗口。
    2. 在弹出窗口中输入路径/目标位置及文件名，用于保存 ND 文件。
    3. 勾选对应 z-series 的复选框。
    4. 点击 A1 Plus Settings 窗口中的 live，这将打开一个实时预览窗口。
    5. 调节显微镜上的调焦旋钮以选择细胞顶部，并在 ND 采集窗口中点击 Top，将当前位置设为顶部。
      注意：建议将焦点略调至细胞顶部之上，以确保 z 序列中能采集到整个细胞。
    6. 调节显微镜上的调焦旋钮以选择细胞底部，并在 ND 采集窗口中点击 Bottom，将当前位置设为底部。
      注意：建议将焦点略调至细胞底部之下，以确保整个细胞均被采样。
    7. 输入步长为 1 µm，选择 top-bottom 作为 z 扫描方向，然后点击 ND 采集窗口中的 run 以采集 z-stack。
      注意：步长决定了根据顶部和底部位置（即移动距离）将采集的 z 切片数量。选择 1 µm 步长是在成像速度、z 轴采样和光漂白之间的一种折衷。使用 2.4 AU 的共焦针孔直径和 60x 水浸物镜，得到的光学切片厚度为 1.73 µm。因此，1 µm 步长略低于奈奎斯特采样标准，但这是为了减少采集 z-stack 所需时间而做出的折衷。对于非常稳定的样本，若速度不是关键因素，可使用更小的 z 轴步长，甚至可能使用更小的共焦针孔直径，以提高 z 轴分辨率。bottom-top 方向应产生类似结果，可用于评估 z 扫描过程中可能发生的光漂白效应。
  11. 如有 Perfect Focus System（PFS），请进行设置：
    注意：PFS 可使系统在图像采集期间补偿焦深波动。以下步骤可用于设置 PFS，具体步骤可能因 Nikon A1R 型号和所用 NIS Elements 版本略有不同。
    1. 在 ND 采集窗口中，高亮显示由范围图标定义的对称模式。
    2. 打开显微镜正面的 PFS 按钮（确保样品台下方区域的二向色镜旋钮处于“in”位置）。
    3. 使用 PFS 偏移控制器正面的旋钮，重新定义顶部（逆时针旋转）和底部（顺时针旋转）。
    4. 在 ND 采集窗口中点击“relative”，定义相对 z 位置/z 深度。
    5. 点击显微镜正面的 memory 按钮，使软件记住该相对 z 深度。
  12. 完成 z-stack 采集后，使用移液器轻轻加入所需试剂（forskolin 或溶剂对照），并等待 10 分钟。
    注意：加入试剂时应非常轻柔，以免扰动细胞或移动细胞腔室在显微镜 XY 载物台上的位置；建议在后续实时观察或图像中验证视野是否在加样过程中发生偏移。10 分钟等待时间是为了使 forskolin 处理发挥作用。若使用其他处理方式，等待时间可能需要调整。
  13. 10 分钟后，更改文件名，并在 ND 采集窗口中点击 run。
  14. 重复上述步骤 2.11 – 2.13，至少对 5 个盖玻片进行操作，以获得足够用于统计分析的结果（每种处理组——forskolin 和溶剂对照——n=5）。
  15. 制备样本及样本空白，用于构建光谱库，并使用与步骤 2.9 和 2.10 中所述相似的采集设置获取光谱图像。

3. 图像分析

注意：这些图像将用于构建一个光谱库，其中包含研究中所有单个端元组分的纯光谱。如果使用不同的荧光团，光谱库中的端元组分可能因研究而异。构建光谱库的详细步骤见补充信息文件“Supplemental File_Spectral Library”。本文描述了数据导出为.tiff文件、线性光谱解混、FRET效率测量、三维重建以及cAMP水平估算的方法。图像分析可使用不同的图像分析和编程平台进行，例如ImageJ、Python、MATLAB或CellProfiler。在本研究中，使用了MATLAB脚本。

  1. 导出图像数据：
    1. 创建新的文件夹，文件夹名称与步骤 2.13 和 2.14 中获取的光谱 z 堆栈图像的文件名相同。
      注意：以下导出数据的步骤专用于 NIS Elements AR 版本 4.30.01。根据软件版本的不同，这些步骤可能略有差异。
    2. 点击 文件，将打开一个文件窗口。浏览并选择步骤 2.12 中获取的光谱图像文件，然后点击 打开。
    3. 文件加载后，点击 文件→ 导入/导出→ 导出 ND 文档。
    4. 在弹出窗口中：浏览并选择步骤 3.1.1 中创建的文件夹，将“文件类型”选择为“标记图像格式 (TIF)”，然后选择 每个通道的单色图像 和 保持位深度。
      注意：“文件前缀”将自动生成；可根据需要更改该值。“索引顺序”将根据所选通道而变化，应显示为“z, c”，即首先按 z 切片位置索引，其次按波长带编号索引。请确保取消选中与 应用调色板 (Apply LUTs)、插入叠加 (Insert Overlays) 或 使用点名称 (Use Point Names) 对应的复选框。
    5. 点击 导出，将 tiff 文件作为独立的 tiff 文件导出至目标文件夹。
    6. 重复步骤 3.1.2 – 3.1.5，以导出步骤 2.13 中获取的光谱图像文件。
  2. 线性光谱解混：
    1. 打开编程软件。
      注意：用于解混原始光谱图像的自定义编程脚本可在南阿拉巴马大学生物成像与生物系统网站的“资源”标签下获取（https://www.southalabama.edu/centers/bioimaging/resources.html）。
    2. 打开名为“Linear Unmixing.m”的文件，然后点击编辑器工具栏中的 运行 按钮。
    3. 浏览并选择包含由 NIS Elements 软件生成的导出 *.tif 文件序列的文件夹。
    4. 点击 确定 继续，将打开一个名为 波长与 Z 切片 的新窗口。
    5. 复制在步骤 3.2.4 中选择的文件夹内第一个文件的文件名（不含 z 切片和通道编号），并将其粘贴到对话框中“输入图像名称”标签下的第一步中。
    6. 在第二步“输入波长带数量”中输入通道数量，在第三步“输入 Z 切片数量”中输入 z 切片数量，然后点击 确定。
      注意：如果对采集设置进行了更改（例如调整波长范围或波长步长），波长带数量可能会发生变化。Z 切片数量也可能因细胞高度不同而变化。
    7. 在弹出的“选择波长信息文件”窗口中，浏览并选择名为“Wavelength.mat”的波长文件，然后点击 打开。
    8. 在新的弹出窗口“选择光谱库文件”中，浏览并选择“Library.mat”文件，点击 打开，并等待切片解混完成。
      注意：“Library.mat”文件包含每种端元荧光团的纯光谱，以及细胞自发荧光和背景光谱特征。本例中，端元荧光团包括 Turquoise、Venus 和 DRAQ5。背景光谱特征包括细胞或基质的自发荧光、盖玻片荧光和盖玻片衍射。“Wavelength.mat”文件包含用于采集光谱图像的波长通道信息。示例光谱库文件和波长文件可在生物成像与生物系统网站获取（参见 3.2.1 节下的注释）。有关如何生成光谱库和波长文件的更多信息，请参阅名为“Supplemental File_Spectral Library”的补充信息文件。解混后的图像将对应每个 z 切片，并保存到在步骤 3.2.3 中选择的文件夹内、解混过程中创建的名为“Unmixed”的文件夹中。
  3. FRET 效率计算：
    1. 打开名为“multiFRRCF.m”的编程脚本，然后点击 运行。
      注意：该编程文件可从南阿拉巴马大学生物成像与生物系统网站获取（参见步骤 3.2.1 下的注释）。
    2. 在弹出的对话框“需重切片的文件夹数量”中输入要分析的实验重复次数，然后点击 确定。
      注意：每个实验的图像数据应保存在独立的解混图像文件夹中。此步骤仅允许分析代码循环处理多个文件夹，以节省时间。
    3. 浏览并选择解混后的文件夹，然后点击 确定。
      注意：“浏览文件夹”弹出窗口打开的次数取决于上一步中“需重切片的文件夹数量”对话框中输入的数值。请依次浏览并选择各个文件夹。
    4. 在新的弹出窗口中，将以下信息分别填入对应输入框：缩放因子 为 12.4，阈值 为 5.6，X、Y 和 Z 频率 分别为 5、5 和 1，平滑算法 为高斯滤波。
      注意：缩放因子的单位为像素/µm，用于将 Z 方向的采样缩放至与 XY 方向一致。缩放因子由图像像素尺寸获得，通常作为元数据包含在大多数共聚焦显微镜系统的图像中。例如，若图像采集时像素间距为 0.08 µm/像素，则缩放因子应为 12.5 像素/µm。阈值用于对图像进行阈值分割，并生成细胞的二值掩膜。我们根据图像供体+受体强度列出了最优值：若图像供体+受体信号强且背景低，使用 4.5 作为阈值；若图像供体+受体信号中等和/或背景较高，使用 5.6 至 6.5 之间的值；若图像供体+受体信号低于背景，则使用 7.5 或更高值。频率值表示后续步骤中切片操作的间隔（以像素数为单位）。例如，若细胞 Z 深度为 17 µm，步长为 1 µm，XY 方向缩放因子为 12.5 像素/µm，则三维图像数据集的深度将被重采样为 212 像素（Z 方向）。根据输入的 Z 频率值（例如 1 像素），三维图像数据集将从图像数据集顶部开始，以 1 像素为步长向下重切片，从而生成 212 张重切片图像。若输入更大的 Z 频率值间隔，则生成的重切片图像数量将减少。重切片图像将在后续步骤中保存。
    5. 点击 运行，并等待所有 FRET 测量和重切片完成。
      注意：将在父目录中创建一个独立文件夹，用于保存重切片后的灰度 FRET 效率图像和彩色（应用调色板）FRET 效率图像。例如，所有在 X 方向（YZ 平面）重切片的灰度和调色板 FRET 图像将保存到名为“Resliced_XFRET”的文件夹中。
    6. 使用相似设置对所有实验（包括佛斯科林处理前后及溶剂对照组）重复分析。
      注意：第 3.3 节中提到的步骤描述了为自定义 FRET 分析编程脚本输入的参数值，以生成三维 FRET 图像数据。然而，该脚本在运行时执行多个操作，包括：加载图像数据、创建图像堆栈、平滑处理、FRET 效率计算、创建并应用细胞边界掩膜、三维图像重建、按指定间隔（频率）对三维图像进行重切片、应用调色板以可视化 FRET 变化，以及将重切片图像数据保存至同一目录。程序脚本中已包含更多详细注释。

4. 将FRET效率映射至cAMP水平

  1. 打开名为“Mapping_FRET Efficiency_to_cAMP_concentration.m”的程序文件并点击 运行 在主窗口中。
    注意：该文件可在BioImaging和BioSystems网站获取（见3.2.1节下方的说明）。此文件读取灰度FRET效率图像，并根据特征曲线将其转换为cAMP水平。该特征曲线基于文献中记载的cAMP与FRET关系建立。15,36 由Hill方程（如下所示的第三个方程）描述。然而，Kd 探针在完整细胞内的浓度难以准确估计，因此我们在计算中假设其浓度为1 μM。故结果以K值的函数形式呈现d。（即 [cAMP] = x* Kd用于测量FRET效率以及将FRET映射至cAMP水平的方程式如下所示：
    Equation showing static equilibrium; includes formulas related to apparent forces and constants.
    其中 E 为 FRET 效率，且 a明显的 和 d明显的 分别为受体和供体图像的未混合像素强度。
    Qa 和 Qd 是受体和供体的量子产率。请注意 Qa 和 Qd 抵消方程中的项当 kλ 被纳入FRET效率方程中， kλ 是一个校正因子：
    Static equilibrium equation; formula: k^λ=ε^λ(Qd/Qa); educational use in physics or engineering.
    Mathematical symbol "ε^id," representing a dielectric constant or complex permittivity. 和 Equation of emissivity symbol εᵢₐ for thermal radiation studies. 分别为供体激发波长下供体和受体的消光系数， i (405 nm)
    Equation for cAMP concentration related to binding affinity, shown as a scientific formula.
    E 是 FRET 效率，KD 解离常数 = 1 μM。
  2. 导航并选择第一张灰度 FRET 图像（保存于步骤 3.3.5），然后点击确定。
  3. 打开FRET/cAMP图像，以检查cAMP信号在三维空间中的分布情况。

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结果

本方案描述了利用高光谱FRET成像与分析方法，在活细胞中三维空间内测量cAMP梯度的技术。获得这些结果涉及若干关键步骤，在数据分析与定量过程中需格外注意。这些关键步骤包括构建适当的光谱库、背景光谱解混、设定阈值以识别细胞边界，以及FRET效率的计算。图1展示了在活细胞中测量FRET效率和cAMP水平所涉及各步骤的示意图流程。若操作得当，这些成像与分析步骤将能够在考虑非均匀背景信号的前提下，实现对单个细胞内三维空间中FRET效率的测量及cAMP空间梯度的估算。

图2展示了使用尼康A1R共聚焦显微镜在基础条件下（图2A）以及佛司可林处理后10分钟（图2B）获取的伪彩原始高光谱图像数据的三维视图。请注意，为保持定量分析的一致性，处理前后图像堆栈的采集均采用了相似的探测器和系统参数。还需注意，该图像中FRET的变化并不明显，因为这仅仅是计算FRET效率之...

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讨论

FRET生物传感器的发展使得单细胞内环核苷酸信号的测量和可视化成为可能，并在亚细胞水平信号事件的可视化方面展现出巨大潜力13,22,37,38。然而，FRET生物传感器的应用仍存在若干局限性，包括许多基于荧光蛋白的FRET报告分子信噪比较低，以及FRET报告分子转染效率或表达效率较弱（这在某些细胞系中可能尤为突出，例如PMVECs）23,24。弱表达的荧光蛋白成像结合比率法FRET计算，常常导致所计算的FRET效率具有较高的不确定性或波动性。为了提高FRET测量的可靠性，我们及其他研究者此前已证明，可采用高光谱成像与分析技术来检测FRET信号，并减少荧光标记之间以及自发荧光效应引起的串扰或荧光渗漏26,

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披露

Leavesley 博士和 Rich 博士披露其对一家初创公司 SpectraCyte, LLC 拥有财务利益，该公司成立的目的是将光谱成像技术商业化。然而，本方案中描述的所有操作均使用与 SpectraCyte, LLC 无关的市售产品完成。

致谢

作者谨此感谢荷兰阿姆斯特丹荷兰癌症研究所及范·李文先进显微镜中心的 Kees Jalink 博士提供了 H188 cAMP FRET 生物传感器，以及美国南阿拉巴马大学工程学院的 Kenny Trinh 在缩短我们自行开发的编程脚本运行时间方面提供的技术支持。

作者谨此致谢以下资助来源：美国心脏协会（16PRE27130004）、美国国家科学基金会（1725937）、美国国立卫生研究院（S100D020149、S10RR027535、R01HL058506、P01HL066299）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Attofluor 细胞培养腔室InvitrogenA7816Attofluor 包含钢制细胞腔室和橡胶 O 型圈。细胞腔室用于固定盖玻片，O 型圈则提供密封机制，防止缓冲液在腔室内泄漏
二甲基亚砜（DMSO）Fisher ScientificBP231-100用于配制佛司可林储备液的溶剂
DRAQ5 荧光探针溶液Thermo Scientific62252细胞核染色剂
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）Gibco11965-092含有细胞在培养皿中生长和分裂所需的营养物质和生长因子
胎牛血清（FBS）SigmaF6178添加至培养基 DMEM 中的生长因子补充物
佛司可林SigmaF3917腺苷酸环化酶激活剂
H188 环磷酸腺苷 FRET 生物传感器Netherland Cancer Institute, Dr. K. Jalink赠品质粒编码青色荧光蛋白（供体荧光基团）、Venus（受体荧光基团）以及来自 Epac 的结合域
Image Jimage.net免费下载另一种用于提取光谱信息和图像处理的图像处理平台
积分球Ocean OpticsFOIS-1用于测量不同激光强度下激光谱线的照明强度（？）
小鼠层粘连蛋白，天然Invitrogen23017-015盖玻片经层粘连蛋白包被，有助于细胞的贴附、生长和运动
Lipofectamine 3000 转染试剂盒InvitrogenL3000-015用于将 H188 FRET 生物传感器转染入细胞的转染试剂
MATLABMathworksR2019a图像处理操作（线性解混和 FRET 效率计算）通过在 MATLAB 编程环境中编写自定义程序完成
Nikon A1R 共聚焦显微镜Nikon InstrumentsNikon A1R使用共聚焦显微镜进行光谱图像采集
Nikon Elements 软件Nikon Instruments软件加密狗用于导出和处理使用 Nikon A1R 获取的 nd2 图像文件（多维图像文件）
NIST 可追溯校准灯Ocean OpticsLS-1-CAL-INT具有已知光谱的光源标准灯
PBS pH 7.4 (1X)Gibco10010-023细胞培养过程中常用的缓冲液
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预清洁 Gold Seal 显微载玻片Clay Adams3010用于细胞固定的显微载玻片
ProLong Diamond 抗荧光淬灭封片剂InvitrogenP36961若使用抗荧光淬灭封片剂对样品进行固定，则该封片剂可保护荧光染料和发色团免于褪色
光谱仪Ocean OpticsQE65000用于测量光源的光谱响应（？）
胰蛋白酶-EDTA（0.25%）Gibco25200-056消化细胞与细胞外基质之间的蛋白质-蛋白质键，有助于在细胞接种过程中使细胞解离并脱落
台氏缓冲液本实验室配制本实验室配制台氏缓冲液用于配制工作液，并在图像采集期间维持细胞处于水溶液环境中
6 孔细胞培养板Corning3506将经层粘连蛋白包被的盖玻片置于 6 孔培养板中（每孔一片盖玻片），向每个孔中加入细胞及培养基
25 mm 圆形显微盖玻片Fisher Scientific12545102细胞在圆形玻璃盖玻片上培养
60X 物镜Nikon InstrumentsPlan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27水浸物镜，常用于细胞成像

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cAMP FRET
使用四维（x, y, z 和 λ）高光谱FRET成像与分析技术测量活细胞中三维cAMP分布
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