本文介绍了两种实验方案：第一种用于扩增、提取、纯化和定量大量蜜蜂无包膜病毒颗粒，并包括一种去除蜜蜂蛹的方法；第二种用于通过高度可重复、高通量的蜂群生物测定法检测病毒感染效应。
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摘要
摘要
蜜蜂在全球范围内具有重要的生态和农业价值，但也面临多种不利因素的影响，包括暴露于病毒病原体，从而对蜜蜂健康造成负面影响。这些病毒可引发多种毁灭性效应，且由于多种因素的存在，往往难以将实验处理的效果与已有的背景感染区分开来，因而研究起来颇具挑战性。本文介绍一种可大规模生产大量病毒颗粒的方法，以及一种高通量生物测定法，用于检测病毒感染及其效应。由于目前尚无持续传代且无病毒的蜜蜂细胞系，因此需通过活体（in vivo）方式扩增病毒颗粒，即采用低应激方法从蜂巢中大量采集蜜蜂蛹用于病毒扩增。所获得的病毒颗粒可用于蜜蜂笼养生物测定实验，以检测接种物的感染活性，以及研究其他多种病毒感染动态，包括病毒与营养、杀虫剂及其他病原体之间的相互作用。使用此类病毒颗粒的主要优势在于，与现有替代方法（如通过感染蜂的血淋巴或组织匀浆进行感染）相比，可显著降低后续实验中引入未知变量的可能性；但在蜜蜂来源的选择上仍需谨慎，以尽量减少背景病毒污染。笼养实验并不能替代在群体水平上开展的大规模、接近田间真实条件的病毒感染效应研究，而是作为一种方法，用于建立基础的病毒应答数据。结合半纯化的病毒颗粒，该方法可成为研究蜜蜂与病毒之间生理相互作用多个维度的重要工具。
引言
蜜蜂（Apis mellifera）在现代全球农业体系中发挥着至关重要的作用，但目前正受到多种生物性和非生物性胁迫因素的共同影响，包括农药暴露、食物资源匮乏、寄生虫以及病原体感染1,2。其中最受关注的重要病原体之一是病毒，许多蜜蜂病毒由另一种主要胁迫因子——寄生性瓦螨（Varroa destructor）——传播。这些病毒可在蜜蜂个体或蜂群中引发一系列负面影响，包括幼虫存活率降低、发育异常和麻痹症状，甚至可能导致蜂群在越冬前后完全崩溃3,4,5。尽管在应对病毒感染的技术开发方面已取得一些有前景的进展6,7,8,9，但多数病毒在蜜蜂个体或蜂群内部的传播机制、扩散动态及其相互作用仍远未被充分阐明5,10。深入理解蜜蜂与病毒相互作用的基本生物学规律，以及这些相互作用与其他环境因素之间的关系，对于开发有效的病毒防控技术至关重要。
然而，研究蜜蜂与病毒的相互作用面临诸多挑战，许多已知和未知的因素使这一过程变得复杂。这些因素包括与饮食的相互作用11,12、农药暴露13以及蜜蜂的遗传背景14,15。即使仅关注病毒感染本身，也常存在困难，因为无论是人工饲养还是野生的蜜蜂种群，始终存在一定程度的基础病毒感染，尽管通常不表现出急性症状16,17，且病毒共感染的影响尚不明确18。这使得解析蜜蜂病毒感染效应的研究变得尤为复杂。
许多蜜蜂病毒研究曾利用间接的病毒感染来探究其与其他胁迫因素的相互作用，观察背景感染在其他处理下的变化情况12,19,20,21。尽管这种方法在识别重要效应方面已取得成功，尤其是在发现杀虫剂或饮食处理如何影响病毒水平和复制方面，但使用已知成分和浓度的病毒接种物对于实验性地检验病毒感染动态至关重要。即便如此，将实验处理与背景感染区分开来也可能带来挑战。在野外研究中，研究人员通过区分畸形翅病毒（DWV）的不同毒株，为蜜蜂病毒向熊蜂传播提供了证据22，但若仅在蜜蜂内部使用该方法则较为困难。病毒感染性克隆是一种强大工具，不仅可用于追踪感染23,24,25，还可用于蜜蜂病毒的反向遗传学研究以及病毒-宿主相互作用研究26,27,28。然而，在大多数情况下，感染性克隆仍需在细胞内完成感染周期以产生病毒颗粒。这类颗粒更适合作为实验处理的接种物，因为其感染性高于裸露的病毒RNA，且使用衣壳包裹的基因组进行接种可模拟自然感染过程。
制备纯净且无污染的蜜蜂病毒接种物（野生型病毒株或源自感染性克隆的病毒株）也存在诸多挑战。这主要归因于难以获得一种可靠且可持续复制的无病毒蜜蜂细胞系，以用于生产单一纯种病毒29,30。尽管已有部分细胞系被成功建立，但这些体系仍不完善；不过人们仍寄希望于未来能够开发出可行的细胞系29，从而实现对病毒生产的更精确控制和深入研究。在这一理想的细胞系尚未广泛可得之前，大多数病毒制备方案仍将继续依赖于体内（in vivo）病毒的生产与纯化方法18,31,32,33,34。这些方法包括鉴定并纯化目标病毒颗粒（或构建感染性克隆），随后将其用于感染蜜蜂，通常以蛹期个体为宿主。通过向蛹注射目标病毒，待其死亡后进一步提取并纯化新生成的病毒颗粒。然而，由于初始蜜蜂个体并非无病毒状态，因此所获得的任何病毒浓缩物中都不可避免地含有其他病毒的微量污染，因此在选择实验用蜂时必须格外谨慎，优先选用背景感染风险较低的个体。此外，现有从蜂巢中取出蛹以用于此类实验的方法33劳动强度大，且可能对蜜蜂造成机械性应激，从而限制了病毒的大规模生产18,32。本文中，我们报道了一种替代方法，可实现幼虫的大规模高效移除，所需人力较少，并显著降低对蜜蜂的机械性损伤。
获得蛹并接种起始病毒后，必须进行孵育，以提供病毒复制所需的时间。随后，可将产生的病毒颗粒处理成可用于感染实验蜂的形式。实现这一目的有几种简单方法，包括使用粗制匀浆35,36或来自病毒感染蜂的血淋巴作为感染源37。这些方法有效，但更容易引入背景基质中的未知变量（例如，死亡蜂匀浆中的其他因子）。此外，如果实验需要在短时间内给予大剂量且剂量明确的病毒，则最好对病毒颗粒进行浓缩。因此，为了更好地控制实验条件，优选能够实现一定程度病毒颗粒纯化和浓缩的方法。通常，通过一系列沉淀和离心步骤，可基本去除所有可能的非目标病毒物质33。
制备出该浓缩接种物后，定量检测病毒滴度（qPCR）并利用in vivo 生物测定对其特性进行表征，以评估其活性及致死能力，同时验证感染后病毒滴度是否确实升高，这具有重要意义。可通过注射实验（向蛹或成虫注射）或饲喂实验（向幼虫或成虫饲喂）实现这一目的。尽管上述方法均可行，但将接种物饲喂给蜂笼中成年蜜蜂群体通常是最快且最简便的方法。蜂笼测定法也广泛用于测试多种其他处理因素对蜜蜂的影响，包括农药毒性38、卵巢发育39以及营养对行为的影响40,41，因此该方法可为研究病毒感染与其他因素关联的实验提供良好基础42。
本文介绍了一种无需使用昂贵的超速离心机即可大量制备半纯化、高度富集病毒颗粒的可靠方法，包括一种可减少劳动力投入并降低对蜜蜂机械损伤的蛹去除方法，以及一种可重复性高、通量高的生物测定法，用于检测病毒感染及其效应。通过严格控制病毒接种物的纯度，研究人员能够较其他病毒接种方法显著降低蜜蜂对病毒反应的变异性。此外，该生物测定法可在小规模群体水平上，利用高度可重复的实验单元筛选病毒效应，之后再扩展至接近田间真实条件的实验环境，而后者管理起来要耗费更多人力。这两种方法相结合，为深入研究蜜蜂与病毒之间的生理相互作用提供了必要的技术工具。
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方案
1. 大规模蜜蜂提取方法一：幼虫自主脱离
- 将一只蜜蜂蜂王关入一个空的、已拉出巢脾的朗氏蜂框中，并将其放回原蜂群。让蜂王在此蜂框上产卵24小时。
- 24 小时后检查巢框，确保大多数巢房中已产下新卵。根据蜂王和蜂群的不同，有时在最初的 24 小时内产卵情况可能不理想。若出现此情况，可延长额外 24 小时，并根据需要调整时间。
- 在24小时产卵期后，释放蜂王。明确标记该巢框并将其放回蜂群。
- 在蜂王扣笼后精确经过192小时（8天）（假设蜂王在最初24小时内正常产卵；8天为封盖前的临界时间点），将标记的巢脾从蜂群中取出。刷去所有成年蜜蜂，并将该巢脾转移至模拟蜂巢内部环境的培养箱中（34 °C，相对湿度50%）。
- 检查以确保帧的大部分区域被5填充th 三龄幼虫，其特征为体型较大、呈白色、C形弯曲，紧贴巢房底部边缘。巢脾上可能还有少量巢房已被蜂蜡封盖，尤其靠近巢脾中心位置。
- 准备与装有幼虫的框体高度和宽度相匹配的容器，用于接收5th 用肥皂水彻底清洗容器的内外表面，随后用次氯酸钠溶液清洗，最后用乙醇处理。在进行下一步操作前，将容器彻底干燥。
- 在容器底部铺上多层纸巾，然后添加数层重叠的较薄且具有吸水性的清洁擦拭纸（例如精细操作擦拭纸）或滤纸。所用材料必须具备吸水性。最上层避免重叠，以方便后续幼虫的转移。
- 将框架正面朝下（使焦面朝下的幼虫朝下）放置在容器上方，以便幼虫能够落入清洁湿巾层中。
- 用铝箔纸或其他覆盖物将容器和框架罩住，形成帐篷状，以保持湿度，并将装置放回培养箱中。静置过夜。幼虫会因自然的觅食行为而爬出其巢室，掉落到下方的缓冲表面上。
- 按照1.4节所述步骤彻底清洁各自的转移培养皿，清洁后让培养皿自然晾干，并在底部铺上清洁湿巾。培养皿无需特定尺寸，但较浅的培养皿更便于幼虫操作。
- 开始将幼虫从容器转移到托盘中，小心地从容器顶部取出单个擦拭垫，轻轻将幼虫倒入托盘。幼虫应在过夜后落入容器中，形成多个黏性团块图1A).
- 使用钝头软镊子将幼虫分离，并平铺在托盘表面。幼虫无需均匀分布，可彼此靠近，但不应相互接触。参见 图1B 用于展示分离后幼虫的直观图像。
- 借此机会剔除任何受损（变色）或体型偏小的幼虫。这些幼虫在成熟过程中更易死亡，并可能引发整盘感染或真菌滋生。
- 用拱形铝箔覆盖托盘以保持湿度，并将装置放回培养箱中。
- 每天检查幼虫，移除任何变色（深棕色或黑色）的个体。
注意：幼虫/预蛹会将排泄物排到清洁湿巾上，表现为小的棕色斑块。在化蛹过程中，它们还可能产生少量白色絮状丝网。只要清洁湿巾仍具吸水性，这两种情况均无需更换湿巾。 - 让幼虫化蛹并发育至白眼期，此时其整体形态已与成年蜜蜂相似，但眼部及身体大部分仍缺乏色素沉积，可通过此特征进行识别。该阶段通常在蜂王关笼后14至15天出现。此时蛹已准备好用于病毒注射。 图1C，1D 白眼蛹的示例。
2. 蜜蜂大规模提取方法二：人工蛹体切除法
注意：尽管方法2（蛹体切除）是一种可行的蜜蜂提取方法，但与方法1（幼虫自行脱离）相比存在若干缺点。方法2劳动强度显著更高，难以控制蛹的发育年龄，且通常对蜜蜂本身造成更大的应激。在条件允许时，建议优先采用方法1。
- 从一个合适的蜂群中选取一框带有封盖的蜜蜂幼虫，其蛹应处于或接近复眼呈白色阶段（参见1.9节的描述）。去除蜂巢房中靠近框中心和边缘位置的封盖，以确认存在合适的发育阶段。
- 将蜂框转移至设定为34 °C、相对湿度50%的培养箱中。当不立即使用时，务必及时将蜂框放回培养箱。
- 准备并清洁与1.6节中所述相同的转移托盘。
- 从培养箱中取出蜂框，置于光源下方的倾斜支架上。用少量水润湿一小叠纸巾。
- 使用乙醇清洁一对钝头硬镊。用清洁后的镊子小心去除含有白眼期蛹的巢房封盖，注意操作过程中不要损伤蛹体。
- 逐个轻柔地将蛹从巢房中取出。若空间允许，最安全的方法是用镊子尖夹住蛹的胸部和腹部。若空间不足，也可夹住头部并缓慢左右晃动，直至足够拉出，再改夹身体部位。
- 在操作过程中，用湿润的纸巾覆盖蜂框上暂不处理的部分，以保持湿度。根据需要在取蛹过程中移除或更换纸巾。
- 将取出的蛹均匀摆放在转移托盘的清洁湿巾上，确保彼此不接触。任何形态异常或变色的蛹应予以丢弃。此时蛹已准备好用于病毒注射。
- 若蛹在接触湿巾时渗出液体，应将其丢弃，表明其可能已被刺破。有时，蛹在取出后1小时内，与镊子接触部位周围会出现小的黑色黑化点，此现象通常不影响存活率。若出现大面积黑化区域，则应丢弃受影响的蛹。
3. 蛹期病毒注射
注意：如果首次执行本方案（即尚无先前的病毒接种物储备），需首先从疑似感染的种群中的成虫、蛹或幼虫中提取并浓缩病毒颗粒。按照步骤5所述方法测定所得接种物中的病毒滴度，并确定需进一步扩增的病毒颗粒。
- 在开始处理蜜蜂病毒之前，使用漂白水和乙醇对所有工作表面进行消毒。整个操作过程中应佩戴丁腈手套。
- 准备一种能够以约 1 µL 体积注射液体的注射装置。
注意：一种经济且有效的做法是，使用柔性环氧树脂或其他液态粘合剂将 30 G 的皮下注射针头连接到 100 µL 多通道移液器吸头的末端（参见材料表），手工制作装置。确保针头帽边缘与多通道移液器吸头紧密密封，并让装置充分干燥。示例注射装置的图示参见图 2。 - 在 15 mL 圆锥形离心管中，将所需类型的病毒颗粒与灭菌的 1x PBS（磷酸盐缓冲盐水）混合，配制病毒注射稀释液。所需总体积取决于需要注射的蛹的数量，每只蛹需注射 1 µL（例如，500 只蛹 = 5 µL 病毒颗粒 + 495 µL PBS）。
- 将注射装置连接至手动多通道移液器，从另一个烧杯中吸取 100 µL 水并以 1 µL 剂量分装，测试其准确性。确保每次分装的体积相等，必要时更换注射装置。清除注射装置中残留的水分。
- 从培养箱中取出步骤 1 或步骤 2 所获得的蛹盘，移除铝箔覆盖物。
- 使用乙醇清洁一对钝头硬镊子。轻轻夹住蛹的胸部，施加适当压力使内部液体向腹部移动，从而使背板分节更加明显。
- 使用多通道移液器吸取 100 µL 病毒颗粒溶液，将针头插入腹部第三节与第四节背板之间，注入 1 µL 病毒溶液。对托盘上每只蛹重复此操作，注意避免重复注射。操作过程中受损的蛹应予以丢弃。
警告：所有与病毒制备相关的材料均属于生物危害物，应按照机构规定进行高压灭菌并妥善处理。针头也应按照机构规定进行处置。 - 用铝箔覆盖已注射的蛹盘，并放回培养箱。让病毒颗粒在蛹体内增殖 3–5 天。
- 每日检查蛹的状态，及时移除死亡或腐烂的个体，以防止细菌或真菌积聚。腹部注射部位可能出现少量黑色素沉积，但通常不影响存活率。
- 将蛹样品转移至 50 mL 圆锥形离心管中，涡旋振荡以充分匀浆，注意按蜂群来源分别取样，以减少非目标病毒的交叉污染。确保无完整蛹残留，随后将离心管转移至 -80 °C 超低温冰箱，待后续进行病毒颗粒的沉淀与浓缩。
4. 病毒颗粒浓度
注意：本方案尚未针对包膜病毒的回收进行测试。
- 使用前对所有材料和容器进行高压灭菌。整个操作过程中应佩戴腈手套、实验服和护目设备。开始前使用漂白水、乙醇和RNase失活溶液对所有工作表面进行消毒。
- 配制1x TES（Tris-EDTA-盐）缓冲液：混合10 mM Tris-HCl（pH 7.5）、2 mM EDTA和150 mM NaCl。通过高压灭菌进行灭菌。
- 解冻均质化的蛹样品，并转移至离心瓶中。加入约三倍体积的1x PBS（例如，将一整管50 mL的蛹样品加入150 mL的1x PBS中），并将各瓶体积调整至与最满的瓶子一致。
- 先手动混匀，然后在室温下置于摇床振荡10分钟。
- 在4 °C条件下以15,000 x g离心5分钟，以去除细胞碎片。若仍有细胞碎片残留，可根据需要重复此步骤。
- 如果上清液表面有大块脂肪团浮起，应在继续操作前通过纱布过滤至单独的无菌离心瓶中。
- 向上清液中加入0.3倍体积的24:1氯仿:异戊醇溶液（例如，190 mL上清液 + 57 mL氯仿:异戊醇），通过反复倒置混匀。在4 °C条件下以21,000 x g离心20分钟。
警告：避免氯仿与皮肤或眼睛直接接触。务必穿戴适当的个人防护装备（PPE）。所有含氯仿的废液应按照机构规定进行处理。 - 将上清液倾倒入置于冰浴或4 °C冷室中的无菌500 mL烧杯中，以回收各瓶中的水相。注意避免氯仿污染上清液，否则会使后续纯化过程更加困难；宁可损失少量水相。
- 加入无RNase水，使每个烧杯中的液体体积补足至200 mL。将烧杯置于磁力搅拌器上，放入中等大小的搅拌子，调节搅拌速度至中低档开始搅拌。
- 在持续轻柔搅拌下，缓慢向每个烧杯中加入NaCl，使最终浓度达到2.3%（例如，每200 mL上清液加入4.6 g NaCl）。再向每个烧杯中加入聚乙二醇8000（PEG），使其最终浓度达到7%（例如，每200 mL上清液加入14 g PEG）。
- 用铝箔覆盖烧杯，在冰上或冷室中以中低速继续搅拌1–5小时，以溶解PEG。搅拌时间越长，PEG溶解越充分。
- 关闭搅拌器。将覆盖的烧杯在冰上或冷室中孵育1–3天，使病毒颗粒和蛋白质充分沉淀。孵育时间越长，沉淀的颗粒越多。
- 将每个烧杯中的内容物转移至各自的洁净离心瓶中，在4 °C条件下以15,000 x g离心30分钟，以获得PEG-颗粒沉淀。弃去上清液。
- 小心地将PEG-颗粒沉淀从瓶壁刮下，在洁净烧杯中用最小体积的1x TES缓冲液重悬，缓慢加入少量TES缓冲液至沉淀中（约每100只原始蜜蜂使用10 mL）。
- 将重悬的沉淀通过18 G针头至少推注十次，然后分装至2 mL离心管中。所有管子在进行步骤4.14前应始终保持在冰上。
- 在4 °C条件下以13,000 x g离心2 mL离心管15分钟，以进一步去除PEG。使用1,000 µL移液器将上清液转移至另一2 mL离心管中，并重复离心步骤，确保完全去除所有PEG。
- 使用超滤离心装置（截留分子量100 kDa）对剩余上清液中的颗粒进行浓缩，将溶液转移至新的离心管中，在室温（RT）下以14,000 x g离心10分钟，重复多次，直至体积约为原始体积的五分之一（例如，将10 mL颗粒-TES溶液浓缩至约2 mL浓缩颗粒）。滤器有多种规格，应根据处理样品数量选择最合适的型号。通常适用于15 mL锥形管的型号最为合适。
- 将浓缩后的颗粒通过26 G皮下注射针头重悬，并在室温下以14,000 x g离心5分钟，进行最后一次PEG去除。若液体仍浑浊，需重复该步骤直至所有PEG沉淀完全去除。
- 将黏稠的上清液分装至所需体积，于-80 °C保存，直至使用。
5. 病毒RNA提取与定量
- 使用任何合适的RNA提取方法（例如TRIzol RNA提取试剂，随后进行DNase处理）从整只蜜蜂或浓缩的病毒颗粒中提取RNA。
- 通过RT-qPCR定量第5.1步中制备的接种物中的病毒滴度，建议采用基于标准曲线的方法，该方法不依赖于宿主基因表达18，尽管其他方法也可能用于估算。
6. 病毒摄食生物测定
- 在框架采集步骤（6.2）之前或蜜蜂羽化24小时期间（6.3），准备好生物测定所需的所有材料。
- 准备干净的蜂笼或其他能够容纳生物测定所需数量蜜蜂的围栏装置（例如，尺寸为 10.16 cm × 10.16 cm × 7.62 cm 的丙烯酸盒式蜂笼），并用大小合适的离心管封堵所有饲喂孔图3确定各笼子的处理方案并进行随机分组，为每只笼子贴上指定处理标签，以便日后参考。
- 通过在各自的中型称量皿上标注对应的笼具编号和处理方式，准备接种用托盘。
- 将适量蔗糖与去离子水混合配制饲喂溶液（例如，每1升水加入300克蔗糖，制成30%蔗糖溶液），在加入蔗糖前后均需对水进行灭菌处理。灭菌后的蔗糖溶液可置于4 °C冰箱中保存数周，若出现任何浑浊现象则应弃用。
- 通过将6.1.3中制备的饲喂液部分装入15 mL离心管，倒置后用图钉在管尖周围刺出1-2个小孔，制备饲喂管。也可使用在火焰上加热的18G皮下注射针头熔出小孔。确保存储饲喂管的管盖拧紧，松动的管盖可能导致缓慢渗漏，从而在夜间淹死饲养盒中的生物。
注意：可根据实验需求调整喂养溶液和饲管体积。 - 为收集新羽化的蜜蜂，准备一个大型容器，并在其边缘轻轻涂抹植物油或类似的油性物质。另用相同方法准备若干小型杯子。
- 从至少三个不同的蜂巢中选取并移除即将羽化的蜜蜂幼虫巢脾。适当日龄的蜜蜂在巢房封盖下呈现出完全着色的成虫形态。蜜蜂正在羽化的明确迹象包括观察到巢房内的个体正在缓慢啃咬封盖以破茧而出，和/或发现近期被清空的巢房，其蜡质封盖边缘带有典型的锯齿状咬痕。
注意：所需巢框的确切数量取决于实验规模、每框出房幼蜂数量以及一年中的具体时间。一个标准的郎氏深框每面约含 3,000 个巢房；若巢框主要为封盖蛹，且可见部分蜜蜂正在出房，则在 24 小时内可轻易产出 400 只以上工蜂。应根据季节情况适时调整。 - 将蜂框放入羽化盒前，先刷去所有成年蜜蜂，并将羽化盒转移至模拟蜂巢内部环境的培养箱中（34 °C，50% 相对湿度）。让蜜蜂羽化 24 小时。
- 从培养箱中取出羽化盒，将所有新羽化的蜜蜂刷入收集容器中。务必彻底清除羽化盒中的全部蜜蜂，以防止在后续刷取过程中混入年龄不准确的蜜蜂。任何能够飞行的蜜蜂均已羽化。 > 24 小时前的样本应排除在生物测定之外。
- 通过手工轻轻混合收集容器中的新羽化蜜蜂（此阶段蜜蜂无法蜇人），制备均质的蜜蜂混合样本，以尽量减少来自任一单个蜂群的遗传效应。对于特定应用，可采用其他蜂群来源的组合方式。
- 数出35只单独的蜜蜂，将每只蜜蜂依次放入同一个涂油的杯子中，然后将全部蜜蜂转移至一个亚克力蜂笼中。或者，为避免计数错误，也可将较少数量的蜜蜂分装到多个涂油的杯子中（例如，5个杯子，每个杯子放入7只蜜蜂）。所用蜜蜂的数量可根据具体需求和实验应用进行调整。
- 将蜂群蜂箱转移至培养箱中（34 °C，50% 相对湿度），并确保按照 6.1.1 步骤中生成的随机放置顺序进行摆放，以尽量减少潜在的微气候影响。
- 在开始实验前，使用含氯漂白剂水溶液、乙醇和RNase失活溶液清洁所有台面和移液器，以准备适用于病毒操作的工作环境。处理病毒颗粒时务必佩戴腈手套。
- 准备所需浓度的病毒接种液：将适量浓缩的病毒颗粒（步骤 4.17）在无菌容器中解冻，并与足量蔗糖溶液（步骤 6.1.3）充分混匀。每笼 35 只蜜蜂需接种液 600 µL。若目标病毒浓度为 0.1% 或更低，建议进行系列稀释。
- 例如，若一个实验涉及40个笼子，每个均需接种1%的病毒接种液，则共需要24 mL病毒溶液，可通过将240 µL浓缩病毒颗粒与23.76 mL蔗糖溶液混合制备。由于黏稠液体在操作过程中可能存在损耗，建议初始配制时增加约15%的余量。
- 将6.1.2步骤中制备的接种物托盘按处理类型分类摆放，并用移液器向每个托盘加入600 µL相应的接种物。
- 小心地将接种盘插入对应的蜂笼中，注意不要意外释放蜜蜂。借此机会扫描蜜蜂，并替换在转移过程中可能死亡的个体。
- 让接种物完全消耗完毕（约12–14小时）后再移除堵塞顶部加料孔的离心管，并插入6.1.4步骤中准备好的相应加料管。这有助于确保蜂群中的蜜蜂在整个群体中均匀分配接种物。提供蔗糖溶液 随意摄取 在实验过程中，应根据需要随时补充试管中的内容物。
- 以每12小时为间隔，记录每次实验开始后前72小时每个蜂笼内的死亡率，此后改为每24小时记录一次。通过向上滑动蜂笼门至仅够镊子伸入的程度，用镊子取出死蜂，以便于后续计数。每次更换蜂笼操作之间，须将镊子在酒精灯上灭菌，以防病毒交叉污染。
- 随机选取每个蜂箱中的活体蜜蜂样本，放入预冷的离心管中，并立即置于干冰上，用于病毒滴度测定（5.1–5.2）。通常，在任一时间点采集三只蜜蜂即可获得足够的病毒滴度数据，同时避免蜂群数量显著减少。
- 根据需要持续进行常规死亡率测量。
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结果
成功遵循实验方案（图1用于蛹期注射和病毒提取的样本应能产生大量病毒颗粒。然而，通过在多个时间点从多个蜂群中采集并注射蛹，可最大限度地提高获得目标病毒且污染程度较低的概率。目前对病毒在蜜蜂体内复制及其相互作用的动态机制尚不完全清楚；加之可能存在预先感染的情况，即使来自同一原始蜂群的蛹，也无法保证所注射的（目标）病毒能够在任意个体蛹中成为优势病毒。 图4 展示了提取后可能观察到的病毒比例范围。图中显示的四个菌落是更大规模病毒采集工作的一部分，其中每只蛹最初均被注射了约95%的以色列急性麻痹病毒（IAPV）接种物。尽管参与这些提取的16个菌落样本中有10个含有高纯度的IAPV（> 95%），包括一些 > 99%（例如，蜂群1），其他样本的IAPV比例各不相同（例如，蜂群2-3），其中一些样本甚至以其他病毒为主，例如畸形翅病毒（DWV）（例如，蜂群4）。
表1以RT-qPCR扩增阈值循环（Ct值，即PCR靶标达到检测阈值的循环数）...
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讨论
本文概述了病毒扩增及接种物制备过程的每一步骤，包括幼虫采集、病毒增殖、提取与浓缩，以及以笼内饲喂实验形式进行的病毒处理方法。这些方法可用于制备半纯化的病毒颗粒（图4），对于可导致成年蜜蜂死亡的病毒，其有效性可通过剂量-反应致死率检测进行持续量化评估（图5）。在确认病毒的感染能力及/或致病性后，所获得的病毒颗粒即可用于生物测定，以阐明蜜蜂与蜜蜂病毒之间的相互作用。
所述方案最具特色的优势之一是，无论采集的蛹、产生的颗粒还是进行的生物测定，每个步骤均可轻松扩展至大规模操作。采用蛹体切除方法33，预计每小时可移除约100只蛹，具体数量将随操作熟练程度而增加。然而，本文报道的幼虫自移除方法虽然需要不同的规划和时间安排，却能在一夜之间轻松获得比前者多10至20倍的移除蜂量，且所需人工操作较少，对蜜蜂的机械损伤也更小。
该方法的主要局限性在于，无法保证自行爬出的幼虫此前未受...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 Julia Fine 博士在方案制定过程中提出的想法和讨论，同时也感谢 Cassondra Vernier 博士在编辑过程中提供的有益意见。这些材料用于部分由农业与食品研究基金会资助的项目（资助编号 549025）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10% 次氯酸钠溶液 | |||
| 24:1 氯仿:异戊醇 | SigmaAldrich | C0549 | |
| 70% 乙醇溶液 | |||
| 用于生物测定的蜂箱 | 根据实验设置而定 | ||
| Combitips Advanced 0.1 mL | Eppendorf | 30089405 | 可选（若无注射装置可用） |
| 幼虫自清除用容器 | 尺寸应约为 19" × 9-1/8"（与朗氏深框尺寸相近） | ||
| 镊子 | 用于分离幼虫的钝头软镊；用于切除蛹的钝头硬镊 | ||
| 通风橱 | |||
| 培养箱 | 能够维持 34 ºC 和 50% 相对湿度 | ||
| Kimwipes 擦拭纸 | Fisher Scientific | 06-666 | 任何吸水性擦拭纸均可使用 |
| 中等大小称量舟 | 用作接种盘 | ||
| Microcon-100kDa（含 Biomax 膜） | MilliporeSigma | MPE100025 | |
| NaCl | |||
| 腈类手套 | |||
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | SigmaAldrich | P5119 | |
| 聚乙二醇 8000（PEG） | SigmaAldrich | 1546605 | |
| 台式冷冻离心机 | 可达到 15,000 × g | ||
| 冷冻离心机 | 可达到 21,000 × g | ||
| Repeater M4 多通道移液器 | Eppendorf | 4982000322 | 可选（若无注射装置可用） |
| RNAse Away | ThermoFisher | 7000TS1 | |
| 无 RNase 水 | SigmaAldrich | W4502 | |
| 蔗糖 | |||
| TES | SigmaAldrich | T1375 |
参考文献
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