原子力显微镜-红外光谱法（AFM-IR）为细菌研究提供了强大的平台，能够实现纳米级分辨率。该技术可在单细胞水平上对细菌进行亚细胞结构变化的成像（例如细胞分裂过程中）以及化学成分的比较研究（例如由药物耐药性引起的差异）。
本文内容
摘要
摘要
原子力显微镜-红外光谱法（AFM-IR）是一种新型的联用技术，能够以纳米级分辨率同时表征样品的物理特性和化学组成。通过将原子力显微镜（AFM）与红外光谱（IR）相结合，克服了传统红外光谱空间分辨率的限制，实现了20–100 nm的分辨率。这为红外光谱在微米以下样品探测中的广泛应用开辟了道路，而此类应用此前无法通过传统红外显微镜实现。AFM-IR非常适用于细菌研究，可在单细胞及细胞内水平提供光谱和空间信息。由于全球健康问题日益严峻，且细菌感染尤其是抗菌耐药性的快速发展的前景不容乐观，迫切需要一种能够在单细胞和亚细胞水平进行表型探测的研究工具。AFM-IR有望满足这一需求，通过实现对单个细菌化学组成的精细表征。本文提供了针对细菌研究应用的AFM-IR单光谱采集和映射模式的完整样品制备与数据采集方案。
引言
细菌是单细胞原核生物，形态和大小各异，通常尺寸范围为几百纳米至几微米。它们存在于多种环境中，对生命的存在至关重要。在人体内，肠道中的大多数细菌是无害的，其中许多实际上是有益的1。然而，某些细菌种类具有致病性，可引起多种感染性疾病。细菌感染可能导致脓毒症和感染性休克：这是一种危及生命的状况，由机体对感染的反应所引发2。脓毒症是全球主要的健康威胁， worldwide 患病率高，且死亡率严重。仅在2017年，全球估计记录了5000万例脓毒症病例，其中1100万例死亡（约占20%）2。此外，治疗延迟会以每小时为单位持续降低患者的生存几率3,4。
细菌感染通常使用抗生素进行治疗。由于细菌性血流感染（BSI）可能带来的严重后果，以及及时启动抗菌治疗的明确重要性，临床上需要立即使用抗生素。然而，目前临床实践中使用的诊断方法（例如血培养）耗时较长，因此抗生素的使用往往在确诊BSI之前就已经开始5。这一因素导致了抗生素的广泛过度使用，加之农业等其他领域对抗生素的过量使用，共同对微生物耐药性（AMR）的发展形成了强烈的进化压力6,7。AMR目前是全球最紧迫的公共卫生问题之一7,8，预计到2050年将成为首要的死亡原因9。耐药性的产生以及耐药菌株的传播正以惊人的速度发展7,8,9，远远超过了新型抗生素的发现速度10。新的耐药表型在全球范围内不断 出现，而
针对理解AMR相关 变化的研究却常常因现有技术手段的局限 而进展缓慢 11。此外，常用的方法如聚合酶链式反应（PCR）和全基因组测序（WGS）仅关注基因型变化，不足以揭示耐药机制11，因此迫切需要一种能够解析细菌化学组成的研究工具。
红外光谱法（IR）可提供样品的分子表征，因此是细菌表型探测的有力候选技术。自其早期应用以来12，文献中已展示了大量其应用实例13,14这些包括基于表型的细菌属水平鉴定15物种16，以及菌株17,18 然而，由于波长衍射极限的限制，传统红外光谱的空间分辨率被限制在数微米范围内19由于大多数细菌的尺寸低于该极限（例如， Staphylococcus aureus ≈ 直径为400 nm时，常规红外光谱法不适用于单细胞或细胞内水平的探测。
通过将红外光谱技术与原子力显微镜（AFM-IR）相结合，最近克服了空间分辨率的限制。在此方法中，红外吸收通过材料的热膨胀被间接检测19,20,21,22。简而言之，红外辐射的吸收会导致局部温度升高。该变化可通过直接测量23，或通过测量由红外吸收产生的力脉冲所引发的原子力显微镜悬臂探针的振荡来检测20,21。这种联用的AFM-IR技术能够实现接近20 nm的空间分辨率，同时提供样品局部物理特性（AFM）及其化学组成（AFM-IR）的信息。既可采集选定位置的单点光谱，也可对选定区域内特定波数强度进行成像 mapping。
鉴于AFM-IR可实现的空间分辨率，该技术显然为单个细菌细胞及其细胞内成分的化学/表型探测提供了可能24。迄今为止，文献中已报道了若干AFM-IR应用于单个细菌的研究实例19,20,21,22,25,26,27,28，包括单点光谱分析19,21,22以及亚细胞水平的成像 mapping19,22,25,26,27,28。例如，已有研究描述了在单个细菌内检测细胞内脂质囊泡27和病毒28的能力。这些结果表明，AFM-IR在单个细菌及临床相关病原体的纳米尺度研究中具有重要应用价值19。
因此，我们提出了一种用于多层、单层及单细胞细菌样品的原子力显微镜-红外光谱（AFM-IR）数据的样品制备与采集方法。本方案已应用于研究不同种类细菌22及其化学成分的变化。特别是，已利用该方法研究了临床分离的S. aureus菌株对万古霉素耐药性及达托霉素非敏感性的体内演化过程19。万古霉素间歇性耐药和达托霉素非敏感性（VISA 和 DpR）在S. aureus中出现时间相对较晚，是在这些抗生素在临床广泛使用和引入后逐渐出现的，已成为重要的医学难题。此外，尤其是达托霉素非敏感性的机制至今仍不明确，阻碍了替代药物的研发19,29。本方案的重点在于获取可靠的单个细菌AFM-IR光谱，后续可根据实验目标采用多种化学计量学方法进行分析。此外，方案还包括适用于细胞内研究的成像映射方法。
方案
所有涉及病原菌的操作均应在具备适当安全措施的条件下进行。这些措施包括在具备足够生物安全等级的实验室和生物安全柜（PC2）中操作，使用适当的消毒剂（如80%乙醇溶液）仔细消毒工作区域。全程必须穿戴适当的个人防护装备。
1. 溶剂和材料的准备
- 溶剂：使用超纯水作为溶剂。实验前使用经高压灭菌的纯化水，以避免任何潜在的交叉污染。
- 基底：可使用以下任意一种基底用于 AFM-IR，例如 ZnSe、CaF2、BaF2 等。由于 AFM-IR 原则上是一种非破坏性技术，因此可在 AFM-IR 分析后对同一样品应用多种其他研究工具。例如，若使用拉曼级 CaF2 或 BaF2 载玻片，则可进一步进行与拉曼光谱的结果比对分析。
- 使用玻璃小瓶而非塑料管，因为塑料可能造成样品污染。
2. AFM-IR 样品制备
- 样品的培养/孵育
- 在液体培养基或固体平板上培养细菌。根据所研究细菌种类的具体要求，选择培养基类型、培养条件（如温度、氧气供应）和培养时间。例如，对于 S. aureus 脑心浸液（Heart Infusion, HI）琼脂平板可用于培养，在37℃下培养16小时 ˚在有氧条件下培养。
注意：为了获得最佳结果，细菌的培养/孵育应产生足够数量的细菌，以便收集到微量的样品沉淀。具体的菌落形成单位数或细菌细胞数量取决于细菌的种类和大小。
- 在液体培养基或固体平板上培养细菌。根据所研究细菌种类的具体要求，选择培养基类型、培养条件（如温度、氧气供应）和培养时间。例如，对于 S. aureus 脑心浸液（Heart Infusion, HI）琼脂平板可用于培养，在37℃下培养16小时 ˚在有氧条件下培养。
- 样品沉积
- 使用无菌接种环，从琼脂平板上的菌落中小心采集细菌，并转移至玻璃管中。仅从菌落顶部采集细菌。若从液体培养物中采集样品，则使用移液器将约1 mL细菌悬液转移至玻璃管中。可根据细菌浓度调整体积。
注意：应尽量避免收集菌落下方的培养基（或尽可能减少培养基的采集）。后续样品制备步骤旨在去除任何可能残留的培养基成分。从初始阶段即尽量减少培养基残留，有助于获得纯净细菌细胞的光谱数据。步骤 2.2.2 和 2.2.3 适用于从琼脂平板制备的样品；对于从液体培养基制备的样品，请直接进入步骤 2.2.4。 - 加入1 mL超纯水至管中，涡旋振荡直至管底不再可见收集的菌体沉淀（通常1–2分钟）。
- 使用例如麦氏比浊标准品通过视觉比较来估计溶液的大致浊度30 将制备的溶液与麦氏比浊标准进行比较。如果细菌悬液的浊度明显偏低，使用无菌接种环从平板中添加更多细菌，并再次涡旋混匀。重复此步骤，直至溶液的浊度大致相当于0.5至1麦氏比浊标准。此浊度通常可获得适量的细菌沉淀。
- 将细菌悬液在 3,000 离心 x g 5 分钟以获得沉淀。
注意：可调整离心参数以获得细菌沉淀。若增加相对离心力，需谨慎操作，避免导致细菌破裂（尤其是革兰氏阴性菌）。 - 使用移液器轻轻移除沉淀物上方的上清液。向管中加入1 mL超纯水，涡旋振荡以重新悬浮沉淀物。随后，按照步骤2.2.4的方法对样品进行离心。
- 重复洗涤步骤（步骤 2.2.2 和 2.2.4）至少三次。若初始样品来自液体培养基，则至少重复四次（先去除培养基，再进行三次洗涤）。
- 最后一次洗涤后，移除上清液，加入超纯水并涡旋振荡至少2分钟。随后，取5 µ样品在基底上的体积（例如，拉曼级 CaF₂）2).
- 如果所需的样品厚度为多层细菌，则让样品自然风干。
- 如果所需厚度为单层或单个细菌，在沉积样品后（步骤 2.2.7），立即加入 20–100 µ加入超纯水，用移液器枪头轻轻混匀，静置晾干。
注意：由于超纯水的精确体积受多种因素影响（例如生物体大小、菌体沉淀密度等），不同实验之间可能存在差异，因此最好通过实验经验确定。通过制备一系列添加不同体积超纯水的样品，可从中选择具有理想细菌厚度/密度的样品。细菌的厚度/密度可在后续步骤中通过原子力显微镜（AFM）轻松观察。单层和单细胞样品的AFM图像示例如下所示 图1A–H. - 使用双面胶带将基底固定在原子力显微镜金属样品盘上。
- 使用无菌接种环，从琼脂平板上的菌落中小心采集细菌，并转移至玻璃管中。仅从菌落顶部采集细菌。若从液体培养物中采集样品，则使用移液器将约1 mL细菌悬液转移至玻璃管中。可根据细菌浓度调整体积。
3. 仪器准备
注意：此处描述的仪器操作步骤适用于材料表中列出的仪器。若使用更新型号的原子力显微-红外光谱仪（AFM-IR），具体仪器操作步骤可能与本文所述略有不同。
- 打开仪器并按下按钮进行初始化 初始化 按钮。确保激光快门处于 开启 激光测试定位。
- 如果设置了吹扫系统，则用 N₂ 吹扫仪器2 通过开启 N 的流动2调节氮气吹扫以达到稳定的湿度水平（例如20%）。确保在测量过程中以及背景和样品数据采集期间湿度保持稳定，不发生波动。建议等待约20分钟，使湿度水平充分稳定。
- 将样品装入样品室，通过按压 加载 按钮。样品加载通过软件向导进行。在操作软件向导时，首先使用箭头键沿Z方向移动显微镜载物台以聚焦探针，并单击 下一步其次，使用箭头调节数据采集位置，引导平面内移动，并通过调节AFM探头顶部的旋钮对准AFM激光器与AFM检测器。随后，通过在Z方向移动显微镜载物台，聚焦样品表面。
注意：样品加载每一步的详细图示均在软件手册中提供31聚焦样品时应小心操作。在Z方向接近样品表面时，应使用较慢的电机速度。 - 不进行接触的情况下接近样品，点击 方法 按钮。
4. 数据采集
- 背景
- 在数据采集之前，先采集背景信号。采集背景时，确保激光快门处于打开位置。选择光谱范围和分辨率（根据分析目的而定），以及背景扫描次数和累加次数。这些参数通常建议设置为较高值（例如，1024次扫描和3次累加）。
注意：通常建议光谱分辨率为4 cm-1或8 cm-1，光谱范围为3,200 cm-1–2,800 cm-1和1,800 cm-1–900 cm-1。 - 背景采集完成后，保存背景文件。该文件不会自动存储。将激光快门位置更改为关闭。
- 在数据采集之前，先采集背景信号。采集背景时，确保激光快门处于打开位置。选择光谱范围和分辨率（根据分析目的而定），以及背景扫描次数和累加次数。这些参数通常建议设置为较高值（例如，1024次扫描和3次累加）。
- 样品——单点光谱
- 按下进针按钮，使探针接触样品。系统将开始接近样品表面，直至检测到直接接触。
注意：本研究中使用的设定点范围为0.15–2 V，反馈增益（I增益和P增益）通常设置为3和10。NIR2接触式探针常与nanoIR2系统配合使用（型号：PR-EX-nIR2-10，共振频率（kHz）：13 ± 4 kHz，弹性常数（N/m）：0.07−0.4 Nm-1）。 - 采集原子力显微镜（AFM）图像以观察表面形貌。首先，以较低空间分辨率（例如，200 × 200点）扫描较大区域（例如，50 × 50 µm）（图1I）。
注意：AFM-IR数据始终在接触模式下采集，但AFM数据可在接触模式或轻敲模式下采集。 - 从AFM高度/偏转图像中选择特定感兴趣区域，并以更高空间分辨率重新成像（图1J–K）。确保数据采集速度适当，探针移动应缓慢（例如，扫描速率0.2–0.4 Hz）。
- 选择测量点（例如，单个细菌），并将探针移至该位置。
- 对准红外（IR）激光。为此，使用样品会吸收的波数。对于生物材料，可选用酰胺I带（1655 cm-1）。确保带通滤波器处于关闭状态，然后点击启动IR。nanoIR仪表右侧图形（显示为振幅随频率变化的偏转快速傅里叶变换FFT）应至少出现一个清晰的峰值，左侧图形（偏转随时间变化）应呈现周期性波形。若未达到此效果，则需优化红外热点。
注意：即使快速傅里叶变换（FFT）和偏转信号显示预期轮廓，仍建议在多个预期有吸收峰的波数下进行红外热点优化。 - 使用选定的波数值优化红外数据采集的热点。可借助细菌的标准红外光谱（例如，细菌压片的ATR光谱）来识别吸收峰位置，并用于优化热点。从不同光谱区域选择多个波数值（例如，8–10个）。
注意：若在AFM-IR数据采集前无法获得目标细菌的标准红外光谱，可参考文献中已有的细菌光谱作为粗略指导。红外热点优化的结果是一幅图像，显示每个x和y位置处FFT幅值信号的分布图，系统将自动选择信号最强的位置。此类图像示例见软件手册31。 - 在对选定波数值完成红外热点优化后，定义光谱数据采集参数：光谱区域、光谱分辨率、扫描次数、施加的激光功率，并将这些参数输入软件中的相应窗口。光谱分辨率应与背景分辨率一致，光谱区域应在采集背景时所用的光谱范围内。
注意：一组通用的初始参数可设为：光谱范围：3200 cm-1–2800 cm-1和1800 cm-1–900 cm-1，光谱分辨率：4 cm-1或8 cm-1，扫描次数：512–2048。 - 如有需要，根据信号强度调整激光功率。通常，激光功率的8%–10%即可获得良好的信号质量。可谨慎使用更高功率，但需注意可能造成样品损伤。
注意：激光功率百分比因红外激光类型而异。此处给出的百分比值适用于OPO激光器。 - 点击采集以收集AFM-IR光谱。
- 在采集AFM-IR光谱后，从同一区域重新采集AFM数据。强烈建议执行此步骤，以便揭示任何可能的漂移和/或对样品的破坏性影响。
- 如果AFM-IR光谱结果满意且未观察到对样品的破坏性影响，则继续进行数据采集。如有需要，使用阵列选项和已采集的AFM高度或偏转图像定义一系列采集点。该选项允许使用与单点光谱相同的光谱参数连续采集各点的光谱。
- 如果采集AFM-IR光谱后获得的AFM图像显示样品受到破坏（通常表现为烧蚀斑点），则降低激光功率，选择新的位置，并重复步骤4.3.8–4.3.11。
- 如果AFM-IR光谱中的信号不理想，检查红外热点优化是否正确（步骤4.3.6）。若确认无误，则轻微提高激光功率，并重复步骤4.3.7–4.3.11。可重复此过程直至获得满意的信号。
- 按下进针按钮，使探针接触样品。系统将开始接近样品表面，直至检测到直接接触。
- 样品——成像方法
注意：在对选定波数值采集强度分布图像之前，强烈建议先记录细菌的单点AFM-IR光谱。- 记录所选样品区域的AFM图像。首先以较低空间分辨率（例如，50 × 50 μm，200 × 200点）采集较大区域的AFM图像，然后选择感兴趣区域，并以更高空间分辨率采集AFM图像（如图1I–K所示）。
- 选择用于AFM-IR成像的波数值。
- 确保激光的红外热点已针对所选波数值完成优化（步骤4.3.6）。若某些波数下热点未优化（无明显最大值），则需对其进行优化。
- 定义成像区域的参数：宽度和高度，X和Y方向的数据点数。
注意：若采用前一幅AFM图像中连续选择位置的方式（如图1I–K所示），在标记区域后，宽度和高度字段将自动填充。 - 定义光谱信号采集参数：波长、扫描次数和激光功率。
注意：扫描次数应保持在合理范围内。通常，32或64次扫描即可获得足够的信号量。 - 通过点击扫描速率定义AFM探针移动参数。前一步中扫描次数越多，X方向数据点越多，探针移动速度就需要越慢。若这些参数未适当匹配，会导致探针移动过快，无法在每个点实际完成设定的扫描次数。
注意：例如，为适当地采集具有64次累加和200个点的红外信号，应将扫描速率设置为0.07 kHz。 - 确保勾选启用红外成像选项框。
- 开始成像。将在选定波数下同步采集该区域的AFM-IR信号强度图像和AFM数据。
注意：当使用OPO激光器时，还可额外同步采集接触共振峰频率图像。该图像可用于获取样品在不同位置相对刚度的信息。 - 使用序列采集窗口设置在同一区域、相同参数下但针对不同波数值连续采集AFM-IR数据。操作方法为：打开序列采集窗口，输入每个波数值，并为每个波数定义所用激光功率。
- 将采集的数据（AFM和AFM-IR，单点光谱和成像数据）导出为多种格式，并根据具体研究目标采用适当方法进行分析。
结果
所述方案能够根据样品的初始浓度和添加的水量，在基底上获得多种类型的细菌细胞分布。图1展示了使用本方案制备的革兰氏阳性菌（S. aureus）和革兰氏阴性菌（Escherichia coli）单层及单细胞样品的原子力显微镜图像（高度和偏转模式）示例。
此处所述方案可用于单个细菌的胞内和胞外结构的原子力显微镜-红外光谱成像（AFM-IR）。该应用的一个示例如下所示 图2，展示了在细胞分裂过程中监测空间定位化学变化的结果 S. aureus 细胞。尽管空气干燥通常被视为细菌制备的一种固定方法，但细菌本身对外界因素（如温度）具有很强的耐受性，并有报道称其可在脱水条件下存活32. 此处展示的结果来自风干样品。通过原子力显微镜成像观察并监测了细胞分裂前隔膜的形成过程图2A–D通过连续采集同一区域的12张图像（单张图像采集约需20分钟）完成。 图2A–D 显示4张选定的原子力显微镜（AFM）图像，每张图像采集间隔时间约为40分钟。所形成的结构（隔膜）高度为45 nm。在AFM高度图和偏转图中均可清晰观察到所形成的隔膜（图2E–F）。从细胞及隔膜区域记录的AFM-IR光谱（图 2G，起点位置已标记 图 2F) 在比较前被归一化至酰胺 I 谱带，以最小化数据采集点之间样品厚度差异的影响。隔膜的原子力显微红外（AFM-IR）光谱特征表现为在 1240 和 1090 cm⁻¹ 处的谱带相对强度更高。-1 与从细胞区域采集的AFM-IR光谱相比，这些归属于细胞壁组分中的碳水化合物和磷酸二酯基团（包括例如肽聚糖和壁磷壁酸）22.
所描述的方案也可用于比较多个不同样本之间的单个光谱。该应用的一个示例及其结果如下所示。 图3 和 图4本研究旨在确定万古霉素间歇性耐药在体内发育过程中所发生的化学变化 S. aureus （VISA）。为此，采集了患者的临床配对样本，其中亲本菌株于患者入院时、抗生素治疗（万古霉素敏感）前分离获得 S. aureus，VSSA）以及同一患者在使用抗生素后因治疗失败而分离出的子代菌株。样本进一步在琼脂培养基上培养，并根据方案进行制备（图3A–B）。AFM-IR 谱图采集自 VSSA 和 VISA 的多个单个细菌（及多个样品），随后采用多种化学计量学方法进行分析图3C).
在VSSA和VISA细胞之间未观察到形态学差异（图4A–C）。然而，原子力显微-红外光谱（AFM-IR）图谱（图4D,F）及其二阶导数图谱（图4E,G）显示，耐药菌株与敏感菌株在化学组成上存在明显差异。与细胞壁组分相关的碳水化合物和磷酸二酯基团的谱带相对强度（特别是1088 cm-1处的谱带）在耐药菌株中较敏感菌株显著增强。值得注意的是，所有记录的光谱（VISA：81条，VSSA：88条）均显示出较小的标准偏差，表明来自同一菌株的不同样本所记录的数据具有良好的可重复性，因为同一菌株不同样本间的光谱无法区分。观察到的差异提示耐药菌株的细胞壁厚度较敏感菌株增加，这一结果与其他文献报道一致33,34。
图1：用于AFM-IR测量的不同细菌样品的代表性原子力显微镜（AFM）图像。根据样品在基底上的稀释程度，本方案可获得细菌的多层结构、单层结构以及单细胞样品。代表性AFM图像包括：(A–D) 单层样品和 (E–H) 单细胞样品，其中(A,B,E,F)为革兰氏阳性菌（S. aureus），(C,D,G,H)为革兰氏阴性菌（E. coli）。(A,C,E,G)为高度图像，(B,D,F,H)为对应的悬臂偏转图像。成像区域尺寸：(A-D,G,H) 20 × 20 µm，(E,F) 50 × 50 µm。(I–K) AFM-IR映射区域的连续选择过程，以单个S. aureus细胞为例，通过逐步提高空间分辨率的AFM成像实现。每幅图像均采集200 × 200个数据点，随着成像区域尺寸减小，空间分辨率逐步提高。成像区域尺寸分别为：(I) 40 × 40 µm，(J) 20 × 20 µm，(K) 2.24 × 2.24 µm。(I)中的黑色方框标示了(J)中成像的区域，(J)中的黑色方框标示了(K)中成像的区域。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：通过 AFM-IR 监测 S. aureus 细胞分裂。（A–D）S. aureus 细胞的原子力显微镜（AFM）图像，显示细胞分裂前隔膜的形成过程。成像区域大小：2 × 2 µm。图像选自一系列更大的图像集（每 20 分钟记录 12 幅图像），代表每 40 分钟记录的数据。（E–F）在细胞隔膜形成结束时记录的 AFM 高度图和偏转图，图中标记了 AFM-IR 光谱采集的位置。成像区域大小为 1.17 × 1.15 µm。新形成结构的高度为 45 nm。（G）从细胞区域（黑色）和隔膜区域（红色）（在 F 中标记）采集的 AFM-IR 光谱，波数范围为 1400–900 cm-1。两条光谱均以酰胺 I 带归一化，显示隔膜区域细胞壁组分的相对强度增加。该图经 K. Kochan 等人22 修改。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：AFM-IR研究抗菌耐药性的实验设计概览。（A）样品来源与初始制备：敏感亲本菌株取自患者在抗生素治疗前，耐药子代菌株则取自同一患者在抗生素治疗失败后（体内耐药性发展）。细菌在心脑浸液（HI）琼脂培养基上于37 °C培养16小时。（B）AFM-IR后续样品制备，包括样品收集、细菌沉淀洗涤（3次）及样品沉积。（C）AFM-IR数据采集与分析：原子力显微镜（AFM）高度图像与AFM-IR光谱（1800–900 cm-1）。AFM成像区域大小为1.7 × 1.4 µm。AFM-IR光谱采集自细胞中部。随后采用化学计量学方法对数据进行分析，包括层次聚类分析。本图经K. Kochan等人19修改。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4：万古霉素中间体化学变化研究的原子力显微镜与原子力显微红外光谱结果 S. aureus （VISA）与万古霉素敏感株相比 S. aureus 临床配对中的VSSA。 AFM图像的（A–BVISA 和（C) VSSA 单细胞样本。成像区域的大小：(A，C40 x 40 µm, (B2.56 x 2.45 µm. (D–E平均AFM-IR光谱及其（F–G) 二阶导数，用于：(D，FVISA 和（E,G) VSSA 细胞在 1800–900 cm⁻¹ 光谱范围内的结果-1光谱图显示的是81个（VISA）和88个（VSSA）独立光谱的平均值，并同时呈现标准差（SD）。所有独立光谱在归一化处理后进行平均。主要谱带已在图中标注。F–G此图改编自 K. Kochan 等人。19. 请点击此处以查看此图的放大版本。
图5：S. aureus 细胞在选定波数下连续进行AFM-IR图谱采集时的图像漂移。（上排）：AFM图像与相应的（下排）AFM-IR图谱同时记录，AFM-IR图谱基于选定波数处红外信号的强度生成。波数值（966、1055、1079、1106、1234、1398、1454、1540、1656、1740 cm-1）标注在下排图像上方。每组图像（AFM图像和AFM-IR图谱）均在前一组图像完成后立即采集（每组约耗时40分钟）。成像/图谱区域大小为1.54 × 1.57 µm。图像之间可明显观察到漂移现象。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
红外光谱技术在表征多种生物样品化学组成方面的有效性已得到广泛认可。在过去十年中，红外光谱已成为细菌研究中一种极具前景的工具12,13,14,15,16,17。由于该技术是少数能够通过化学组成实现表型表征的方法之一，因此在微生物学领域持续受到广泛关注。然而，传统傅里叶变换红外显微技术的主要缺点在于其空间分辨率有限，难以对细菌进行单细胞及亚细胞水平的研究。事实上，细菌体积微小不仅对红外技术构成挑战，也限制了绝大多数分析技术的应用。因此，可用于细菌单细胞和亚细胞研究的实验手段极为有限。原子力显微镜与红外技术的结合能够突破红外光谱的空间分辨率限制，为细菌研究提供一种新型工具，实现对化学组成的纳米尺度探测。
该技术不仅限于单细胞研究，还可用于检测多种不同厚度的样品。毫无疑问，干净且细致的样品制备对于获得高质量图像至关重要。本文提供的方案可用于制备多种细菌的多层、单层和/或单细胞样品（图1）。所获得的样品状态取决于多个因素，包括初始细菌载量、洗涤后的稀释倍数以及在基底上的进一步稀释。将洗涤后的菌体沉淀稀释后、沉积到基底前，通常可获得足量样品，用于制备多个样本。因此，为了在基底上获得理想的样品分布，通常建议制备一系列不同稀释梯度的样品。对于以采集原子力显微-红外光谱（AFM-IR）而非亚细胞成像为主要目标的研究，调整样品量（例如，从单层变为多层）可能有助于增强信号强度。
样本制备中的另一个关键环节是适当去除培养基残留物。根据所选用的样本培养方法，样本可从液体培养基或琼脂平板中收集。在这两种情况下，样本中均可能存在培养基残留，尽管从琼脂平板收集的样本中残留量显著较少。由于细菌培养基含有大量各种生物成分，因此确保充分去除培养基残留至关重要。我们建议对琼脂平板样本进行三次超纯水洗涤，对从液体培养基中收集的样本至少进行四次洗涤。如有需要，可增加洗涤次数；但为了不同样本之间的可比性，各样本间的洗涤次数应保持一致。本方案采用水而非磷酸盐缓冲液（PBS）或生理盐水等溶剂进行洗涤。PBS和生理盐水在空气干燥后均会形成晶体，可能对细菌造成损伤。此外，两者在红外光谱中均会产生强烈的吸收峰，尤其是PBS在指纹区含有多个强吸收峰。目前无法使用生理盐水或PBS是该技术的一个重要局限性。通常情况下，用水洗涤不会对细菌产生破坏性影响；但操作时仍需谨慎，且应尽可能缩短细菌与水接触的时间。若样本制备流程需在洗涤阶段暂停，建议在去除水分后将样本保持为沉淀状态。这一点对于细胞壁较薄、更易破裂的革兰氏阴性菌尤为重要。
为确保获得准确且高质量的原子力显微红外（AFM-IR）数据，数据采集过程中的若干方面至关重要。首先，正确采集背景信号是数据获取的基础。尤其需要在整个背景采集过程以及背景与样品采集之间维持稳定的湿度水平。为实现这一点，我们建议使用氮气对仪器进行吹扫，并将湿度水平控制在不超过25%。在高湿度地区，若不进行吹扫将可能带来显著限制。其次，必须强调对红外光斑进行适当优化的重要性。为获得最佳结果，预先了解吸收峰最大值的位置将非常有益。例如，可利用细菌沉淀物的传统红外光谱来确定样品中预期出现的吸收峰位置。若无法获取此类数据，替代方案是参考文献中已有的红外光谱，或从细菌中合理预期的吸收峰位置开始优化（如酰胺I带和酰胺II带）。第三，在数据采集过程中，需特别强调谨慎选择激光功率的重要性（以实现良好的信噪比），因为过高功率可能对样品造成破坏。推荐的功率取决于样品厚度，仪器手册中提供了大致的指导建议31。我们建议通过采集测量后的原子力显微镜（AFM）图像，经验性地检验样品状态，以识别任何潜在的破坏性影响。此外，在采集AFM-IR光谱前后，对同一区域采集AFM图像，可有效验证未发生样品漂移，从而确认光谱确实来源于细胞中选定的位置。在采用成像模式时，即连续在选定波数下成像红外强度时，漂移的可能性尤为值得关注。图5展示了一个实例。实验开始时定义了成像区域，并期望该区域在所有波数下保持一致。然而，在每幅AFM高度图（及相应的红外波数强度图）之间均可见明显漂移，每幅图谱的采集时间约为40分钟。因此，对于采集成像数据的用户，我们建议始终选择略大于目标样品的成像区域，以确保即使发生漂移，目标样品仍保留在成像范围内。
该方案的潜在局限性包括无法在生理溶液（如生理盐水或PBS）中以水合状态收集数据，如上所述。此外，特别是在高湿度环境中，通常需要使用氮气吹扫。此外，该方案仅能检测小至100 nm的生物体，因此无法用于更小结构的分析。尽管可通过使用不同激光器（例如量子级联激光器，可实现20 nm的空间分辨率）来克服此限制，但这也会带来光谱范围受限以及难以获得良好的信噪比等问题。最后，对柔软表面进行检测时可能存在挑战，探针可能无法准确感知表面而继续下压超过接触点，直至发生断裂。虽然细菌样品通常不会出现此类问题，但在检测较软样品时可能发生。在此类情况下，建议尝试在样品附近的基底洁净表面上进行探针接触。
该方案可用于多种类型的细菌学研究，包括不同样本间的比较研究以及亚细胞水平的检测。根据研究目的，可采用化学计量学方法对单个光谱和成像模式的数据进行分析35。此外，通过增加固定步骤，该方案还可修改后应用于其他生物材料（如真菌、酵母、细胞等）。
披露
我们感谢布鲁克公司支付出版费用。KK、BRW、AP 和 PH 是一项国际专利（PCTIB2020/052339）的发明人，该专利描述了本方法的一些基本方面。
致谢
我们感谢布鲁克（Bruker）提供的支持。本工作由蒙纳士大学女性发展成功基金（K. Kochan）资助。A.Y.P. 获得了澳大利亚国家卫生与医学研究理事会执业研究员奖学金（APP1117940）的支持。本研究由澳大利亚研究理事会发现项目 DP180103484 资助。我们谨向芬利·尚克斯先生（Mr. Finlay Shanks）致以诚挚谢意，感谢他提供的关键支持，同时感谢克塞尼亚·科斯托利亚斯女士（Ms. Xenia Kostoulias）在样品处理方面的技术支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| AFM金属样品圆盘 | PST ProSciTech Pty Ltd | GA530-15 | 推荐使用15 mm |
| Anasys AFM-IR nanoIR2 | Anasys Instruments | 型号：nanoIR2 | |
| nanoIR2接触模式探针 | Bruker / Anasys Instruments | - | 型号：PR-EX-NIR2 |
| Heraeus Pico 17 微型离心机 | Thermo Scientific | - | - |
| Matlab | Mathworks Inc | - | 多元数据处理软件 |
| 1.5 mL 微量离心管 | Heathrow Scientific | HEA4323 | 可用其他品牌微量离心管替代 |
| nanoIR2仪器 | Bruker / Anasys Instruments | - | - |
| PLS工具箱 | Mathworks Inc | - | Matlab图形用户界面 |
| 选用的细菌培养基（例如HBA哥伦比亚平板） | Thermo Fisher | PP2001 | 所列培养基仅为示例，可根据实验类型更换其他类型 |
| 选用的细菌菌株 | - | - | 来源取决于研究目的（如患者分离株、ATCC菌株等） |
| 基底材料（例如拉曼级CaF2） | Crystran | CAFP13-2R | 推荐尺寸：13 mm Ø × 2.0 mm |
| 1000 µl 移液器吸头 | Axygen | T-1000-B | - |
| 200 µl 移液器吸头 | Axygen | T-200-C | - |
| 0.5–10 µl 移液器吸头 | Axygen | T-300-R | - |
| 超纯水 | - | - | - |
参考文献
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