将药物直接注入新生啮齿类动物气管的技术，对于研究局部给药的药物或生物制剂对新生儿肺部疾病的影响具有重要意义。此外，该方法还可用于在动物模型中诱导肺损伤。
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本文内容
摘要
摘要
将药物直接滴注至新生啮齿类动物气管内，可作为研究局部给药影响的有力工具。该方法具有直接的转化应用价值，因为表面活性物质和药物通常需局部递送至肺部。尽管已有大量文献报道了在成年小鼠和大鼠治疗实验中采用微创经口插管技术，但在新生大鼠幼崽中的应用仍较为缺乏。由于幼崽口咽部及喉区结构微小，导致声门（声带）难以观察，从而影响了经气管给药的成功率。本文介绍一种有效的新生大鼠幼崽经口插管技术，该方法无创且创伤极小，适用于多次重复给药。我们使用配备照明系统和放大镜的手术耳镜来观察新生大鼠的气管开口，随后通过连接1 mL注射器与移液器吸头的方式进行药物滴注。通过伊文思蓝染料给药验证了该递送方法的准确性。该技术易于掌握，可有效实现药物向气管内的递送。此外，该方法还可用于接种病原体或致病因子以模拟动物疾病状态，以及用于多种肺部疾病的细胞治疗策略研究。
引言
早产新生儿肺部发育不成熟，需要多种干预治疗，例如长期通气。这些干预措施使存活下来的新生儿面临发生后续并发症的高风险1。实验动物模型在模拟各种疾病状态、研究疾病的病理生物学机制以及评估治疗干预措施方面具有重要作用。尽管已有从小鼠、大鼠、兔到早产羔羊和猪等多种动物模型可供选择，但小鼠和大鼠是最常用的动物模型。
使用小鼠和大鼠的主要优势在于其相对较短的妊娠期和较低的成本。此外，它们易于获得，可在无病环境中方便地维持，具有遗传同质性，且涉及的伦理问题相对较少2,3。啮齿类动物模型的另一大优势是，出生时新生幼鼠的肺部发育处于终末细支气管期/早期囊泡期，其形态学特征相当于即将发生支气管肺发育不良的24周早产人类新生儿的肺部4。此外，由于其肺部发育在出生后的前4周内迅速完成，因此可以在合理的时间范围内研究出生后的肺部成熟过程4。尽管具有这些优势，小鼠和大鼠幼崽体型较小，给多种干预操作带来困难，这使得大多数研究人员倾向于使用成年动物而非幼崽5。新生期肺组织处于发育阶段，新生儿对刺激因子的反应与成年个体不同。因此，使用新生动物模型来研究人类新生儿疾病状态是恰当的。
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方案
所有实验均经凯斯西储大学机构动物照护与使用委员会批准（方案编号 # 2020-0035）。所有动物的处理均遵循美国国立卫生研究院（NIH）关于实验动物照护与使用的指南。
1. 动物
- 从商业渠道获取妊娠的 Sprague Dawley 大鼠。
- 将动物饲养在经批准的兽医设施中，保持 14 小时光照/10 小时黑暗的光暗循环，相对湿度为 45-60%。
2. 测试化合物的制备
- 使用伊文思蓝染料作为测试化合物，以评估经气管滴注操作的有效性。
- 用磷酸盐缓冲液（pH 7.2）配制0.25%（w/v）的染料溶液，并使用0.45 µm注射器滤器过滤除菌。
3. 麻醉给药
- 使用改良的适用于新生小鼠的气体麻醉系统，以3%异氟烷（溶于100%氧气）对幼鼠进行麻醉。
- 检查尾部和足底反射是否消失以及呼吸是否变浅，以确认麻醉深度适合进行操作。
4. 气管内灌注（ITI）
- 使用出生后第5天（PN 5）的大鼠幼崽进行ITI实验。PN 5大鼠幼崽的平均体重为12克。
- 将麻醉后的幼鼠仰卧位固定在倾斜的平板平台上，使用实验室标签胶带进....
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结果
伊文思蓝灌注显示染料呈多灶性分布，累及所有肺叶（图4A、B）。如图4所示，本结果证明染料可有效分布至所有肺叶。图像为经气管内灌注染料后立即拍摄。经气管灌注染料的操作成功率达100%，随后染料扩散至双侧所有肺叶。预计染料可在肺小叶内进一步扩散。通过重复给药，我们已确保将染料成功递送至双侧肺叶及所有肺小叶，成功率均达到100%。我们确认无任何染料进入胃部或肺外区域，这证实了该技术将染料完全递送至肺部的高效性。异氟烷麻醉使幼鼠在操作后恢复更快。
出生第5天的大鼠幼崽可耐受该操作，麻醉后操作时间少于5分钟。部分动物虽出现短暂性呼吸暂停，但在数分钟内即恢复正常的呼吸节律。
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讨论
气管内灌注是一种优异的方法，在呼吸系统疾病干预及疾病模型构建方面相较于现有方法具有多项优势。该方法操作快速，且随着经验积累，每只动物平均可在2-3分钟内完成。成功插管的关键因素包括动物的适当麻醉、正确体位（尤其是头部位置），以及开口器在口咽部插入深度或尺寸的准确性。充分的麻醉可为操作者（特别是初学者）提供充足的操作时间。将动物置于45°角体位，有助于清晰观察声带。开口器插入至合适深度，可在整个操作过程中有效牵开舌头，从而进一步确保声带的良好视野。两人团队可高效协作完成该操作：一人负责麻醉和动物固定，另一人实施灌注。ITI技术中最具挑战性的环节是准确将导管插入气管。插管成功可通过插管后注入染料来确认。确认插管初始步骤的准确性至关重要，因为导管极易误入食管，导致给药物质进入胃部而非肺部。
唯一需要特别注意的部分是误插管可能引起的创伤。操作时还必须非常轻柔谨慎，以避免穿透气管或声带周围组织。此外，若已发生2至3次插管失败，则不建议继续进行气管内插管2。
药物/生物制剂的给药途径有多种，.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作部分由美国国立儿童健康与人类发展研究所（NICHD）向 AH 提供的 R01HD090887-01A1 项目资助。作者同时感谢 Peter Mc Farlane 博士实验室提供的设备支持，如吸入式麻醉/加热垫系统。Catherine Mayer 女士在系统搭建过程中提供的宝贵协助，我们深表感谢。资助机构在本研究的设计、数据收集、分析与解释以及 manuscript 撰写过程中均未发挥任何作用。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 伊文思蓝染料 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | 314-13-6 | 确认药物进入肺部 |
| 盐酸氯胺酮 | Hospira. Inc, Lake Forest, IL, USA | 由动物护理设施提供 | 用于镇静 |
| 手术耳镜 | Welch Allyn, Hillrom, Chicago, IL, USA | 21770- 3.5V | 用于观察声带 |
| 可充电耳镜手柄 | Welch Allyn, Hillrom, Chicago, IL, USA | 71050-C | |
| 移液器吸头（凝胶加样用） | Fisherbrand | 02-707-139 | 给药使用 |
| 固定平台（倾斜平面） | 动物护理设施 | 由动物护理设施提供 | 可使用小鼠笼具的金属网顶 |
| 3M 微孔外科白色胶带 | 3M, St. Paul, MN, USA | 1530-2 | |
| 鲁尔锁注射器（1 ml） | BD Franklin Lakes, NJ , USA | NBD2515 | 给药使用 |
| 赛拉嗪 | Hospira. Inc, Lake Forest, IL, USA | 用于镇静 |
参考文献
- Prakash, Y. S. Pulmonary Cell Biology Lab: Neonatal Lung Disease. Mayo Clinic. , Available from: https://www.mayo.edu/research/labs/pulmonary-cell-biology/projects/neonatal=lung-disease (2020).
- Martínez-Burnes, J., López, A., Lemke, K., Dobbin, G. Transoral intratracheal inoculation method for use with neonatal rats. Comparative Medicine. ....
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重印与许可
