我们介绍一种用于复杂生命机制高通量研究的微流控系统，该系统包含1500个培养单元、一组增强型蠕动泵以及一个现场混合模块。该微流控芯片可实现对体内高度复杂且动态变化的微环境条件进行分析。
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本文内容
摘要
摘要
模拟体内环境条件对于体外研究复杂生命机制至关重要。然而，目前针对活细胞和器官的研究技术要么成本极高（如机器人技术），要么在液体操控的纳升级体积和毫秒级时间精度方面存在不足。本文提出了一种微流控系统的设计与制备方法，该系统包含1,500个培养单元、一组增强型蠕动泵以及一个现场混合模块。为展示该微流控装置的功能，我们在该系统中维持了神经干细胞（NSC）球体的培养。我们观察到，当NSC球体在第1天暴露于CXCL、第2天暴露于EGF时，其圆形形态得以良好维持。输入6种药物的顺序变化会导致NSC球体形态改变，以及NSC干性代表性标志物（即Hes5和Dcx）表达水平的变化。这些结果表明，动态且复杂的环境条件对NSC的分化与自我更新具有显著影响，而所提出的微流控装置是开展复杂生命机制高通量研究的适宜平台。
引言
高通量技术对于生物医学和临床研究至关重要。通过并行开展数以百万计的化学、遗传或活细胞及类器官实验，研究人员能够快速鉴定调控特定生物分子通路的基因，并根据个体的具体需求定制序贯药物处理方案。机器人技术1与微流控芯片结合设备控制程序，可实现包括细胞/组织操作、液体处理、成像以及数据处理与控制在内的复杂实验流程自动化2,3。因此，根据所需的通量，单个芯片上可同时维持数百乃至数千种实验条件4,5。
在本方案中，我们描述了一种微流控装置的设计与制备流程，该装置包含1500个培养单元、一组增强型蠕动泵以及原位混合模块。两级细胞培养腔室可防止在换液过程中产生不必要的剪切力，从而为长期活细胞成像提供稳定的培养环境。研究表明，所提出的微流控装置是研究复杂生命机制的适宜平台。此外，该微流控芯片的先进功能可实现对体内高度复杂且动态的微环境条件（如不断变化的细胞因子和配体组成6,7）进行自动化重建，而使用传统平台（如96孔板）完成此类任务通常需要数月时间。
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方案
1. 微流控芯片设计
- 设计包含18个入口的微流控多路复用器，每个入口由一个独立的阀门和蠕动泵控制。为了增加每次泵送循环所驱动的液体体积，使蠕动泵由3条控制通道（特意加宽至200 µm）和10条相连的流道组成。
- 设计无剪切力培养室。双层培养单元的结构包括下方的细胞培养腔（400 µm × 400 µm × 150 µm）和上方的缓冲层（400 µm × 400 µm × 75 µm），可在培养基更换过程中避免细胞受到不必要的剪切应力（图1）。
- 设计高通量功能模块。将培养单元复制形成30 × 50的矩阵布局，占据约7 cm × 5 cm的面积。
2. 芯片制备与操作
- 使用紫外光刻技术制备复制模具
注意：复制模具在硅晶圆上按照标准光刻工艺制备8。- 制备通道结构
- 旋涂光刻胶：在硅晶圆上旋涂5 mL SU-8 3025负性光刻胶，先以500 rpm转速旋转10秒，再以3000 rpm转速旋转30秒。
- 前烘：将晶圆置于热板上，65 °C加热2分钟，然后95 °C加热10分钟，之后冷却至室温。
- 对准与曝光固化：将晶圆和掩模固定在对准器的夹具上，开启光源照射18秒，使曝光区域的光刻胶固化。
- 曝光后前烘：从室温开始以110 °C/h的升温速率将晶圆升温至95 °C，并保持至少40分钟，随后取出。
- 显影：将晶圆浸入显影液（SU-8显影剂）中，搅拌2.5分钟，以去除多余的光刻胶，获得高度为25 µm的通道结构。
- 坚膜烘焙：用玻璃培养皿覆盖晶圆，在65 °C下加热2分钟，然后以120 °C/h的升温速率升至160 °C，并保持3小时。
- 利用缓冲层制备细胞培养腔室
- 采用步骤2.1.1.1的参数，在上述晶圆上旋涂7 mL SU-8 3075负性光刻胶。
- 对晶圆进行软烘（见步骤2.1.1.2），更换掩模并使其与晶圆上的标记对准良好，然后开启光源照射24秒，使曝光区域的光刻胶固化。
- 将晶圆浸入显影液（SU-8显影剂）中，搅拌4分钟40秒，以去除多余的光刻胶，形成围绕先前制备的25 µm高通道结构的75 µm高层状结构。对晶圆进行坚膜烘焙（见步骤2.1.1.6），以增强复合结构的强度。
- 重复步骤2.1.2.1至2.1.2.3，制备一个堆叠在层状结构上的75 µm高腔室结构。
- 制备阀结构
- 采用步骤2.1.1.1的参数，在上述晶圆上旋涂5 mL AZ 50x正性光刻胶。
- 对晶圆进行软烘（见步骤2.1.1.2），使掩模与晶圆上的标记对准良好，然后开启光源20秒，关闭30秒，重复该开/关过程共5个循环，以固化曝光区域的光刻胶。
- 将晶圆浸入匹配的显影液中，搅拌约8分钟，以去除多余的光刻胶，获得圆形阀门结构，使其与控制通道重叠以确保良好连接。对图案化晶圆进行坚膜烘焙（见步骤2.1.1.6），以增强整体模型的强度。
- 制备通道结构
- 利用软光刻技术生产微流控芯片
- 用三甲基氯硅烷处理图案化硅晶圆和空白硅晶圆，持续15分钟。
- 分别准备三份PDMS凝胶（单体/催化剂比例为10:1），对应质量分别为50 g的流体层、20 g的控制层2和20 g的膜层。
- 将50 g PDMS凝胶浇注在图案化硅晶圆上，并在-0.85 MPa的真空腔中脱气1–2小时，以复制流体层。
- 对两份各20 g的PDMS进行脱气处理，然后在2000–2800 rpm转速下分别旋涂于图案化晶圆和空白硅晶圆上，持续30秒，以制备控制层和膜层。
- 将覆盖PDMS的晶圆放入通风烘箱中，在80 °C下孵育60分钟。
- 通过定制的光学装置（放大100倍）和等离子体刻蚀机对不同层进行对准和键合，然后在通风烘箱中80 °C下保持2小时，以增强芯片的键合强度。
- 在芯片上打孔作为入口，随后将其键合到PDMS涂层的盖玻片上，并在80 °C下固化至少12小时后使用。
- 芯片操作
- 将微型气动电磁阀连接至芯片的控制层，并打开定制的MATLAB图形用户界面8，以连接并控制开关。
- 设定推动PDMS膜阀门的关闭压力为25 psi。
- 通过适时开启和关闭阀门，向指定腔室（图2d）输送动态变化的组合/顺序输入信号。
3. 细胞微环境中动态刺激的产生
- 芯片处理与细胞加载
- 在显微镜下维持标准培养条件（37 °C，5% CO2）至少5小时。
- 用包被培养基（即注释中所述）填充芯片，并在标准培养条件（如步骤3.1.1所述）下孵育至少1小时。
- 使用磷酸盐缓冲液（PBS）或细胞培养基（DMEM，达尔伯克改良伊格尔培养基）冲洗芯片，以建立健康的培养环境。
- 在细胞融合度达到80%时收获细胞，并用培养基（DMEM）将细胞重悬至密度约为106/mL。随后通过加压含细胞溶液将细胞加载至芯片中。
注：在芯片上培养不同细胞系时，需使用相应的包被培养基处理细胞培养腔室。通常，在进行3T3成纤维细胞实验及贴壁培养时，所有控制培养腔室的阀门均处于开放状态，细胞可流入同一列中的所有培养腔室。
- 高通量活细胞成像设置
注：图像采集使用配备自动平移载物台和数字互补金属氧化物半导体（CMOS）相机的倒置显微镜。载物台移动和图像采集由定制软件控制。- 使用10倍物镜在明场下观察培养腔室阵列，确认并定义30×50腔室矩阵中每个腔室的位置坐标。
- 切换至20倍或40倍物镜，选择目标腔室的位置坐标，确认后平移载物台将移动至指定位置。精细调节x、y、z焦平面以获得最佳图像。
- 针对每个通道（即明场和荧光成像）分别优化光照强度、曝光时间及其他成像参数。
- 设置成像周期的时间间隔和持续时间，保存路径后开始成像。
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结果
传统的芯片上蠕动泵最初由 Stephen Quake 于 2000 年描述，其蠕动通过 101、100、110、010、011、001 的模式驱动8,10。数字 0 和 1 分别表示 3 条水平控制线的“打开”和“关闭”状态。已有研究报道使用超过 3 个阀门（例如五个）的系统11。尽管由 3 条控制线和 3 条流体通道组成的蠕动泵可实现纳升级别的精度，但其输送速率过慢，无法满足 1,500 个培养腔室的供液需求。为解决该问题，我们增加了流体通道数量（即 10 条连接通道），以提高每个泵送周期（即 101、100、110、010、011、001）所驱动的液体体积。因此，营养物质和药物可被有效输送至指定腔室。蠕动泵每次泵送周期输送的液体体积可增加至原来的 16 倍，达到约 50 纳升。由于蠕动泵阵列由 3 条相连的控制通道控制（图 1b），来自各个入口的溶液可同时被输送至芯片，并实现即时混合。因此，通过适时开启或关闭连...
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讨论
已开发出多种微流控装置用于进行多重化和复杂的实验17,18,19,20。例如，由拓扑凹陷阵列构成的微孔阵列可在无需外加作用力的情况下捕获单个细胞，具有样品量小、可并行操作、材料成本低、响应速度快、灵敏度高等优势21,22,23,24。液滴技术以及由表面张力限制的液滴系统无需微泵等辅助硬件，使液滴运输更加低成本且环境友好25,26。液体液滴可通过微量移液器或喷雾喷嘴直接沉积在表面，实验结束后系统可简便地更新并重复使用...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢中国昌森仪器有限公司程志峰提供的技术支持。本工作由国家自然科学基金（51927804）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2713 Loker Avenue West | Torrey pines scientific | ||
| AZ-50X | AZ Electronic Materials, Luxembourg | ||
| 三甲基氯硅烷（TMCS）92360-25mL | Sigma | ||
| CO2 培养箱 HP151 | Heal Force | ||
| PDMS芯片台式打孔器 WH-CF-14 | 苏州文浩微流控科技有限公司 | ||
| DMEM（L-谷氨酰胺，高糖，酚红） | Invitrogen | ||
| 电子天平 UTP-313 最大量程：600g，e：0.1g，d：0.01g | 上海和创仪器制造有限公司 | ||
| 胎牛血清（FBS） | Sigma | ||
| 纤连蛋白 0.25 mg/mL | Millipore, 奥地利 | ||
| Glutamax 100x | Gibco | ||
| 恒温培养箱 BGG-9240A | 上海比朗仪器有限公司 | ||
| 尼康 Eclipse Ti2-E 型显微镜 | Nikon | ||
| 青霉素-链霉素双抗溶液 10 单位/mL 青霉素，10 µg/mL 链霉素 | Invitrogen | ||
| 等离子清洗机 PDC-002 | Harrick Plasma | ||
| 聚二甲基硅氧烷（PDMS） | Momentive | ||
| 多聚赖氨酸 0.01% | Sigma | ||
| 匀胶机 ARE-310 | Awatori Rentaro | ||
| 匀胶机 TDZ5-WS | Cence | ||
| 匀胶机 WH-SC-01 | 苏州文浩微流控科技有限公司 | ||
| SU-8 3025 | MicroChem, Westborough, MA, 美国 | ||
| SU-8 3075 | MicroChem, Westborough, MA, 美国 |
参考文献
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