使用高通量微流体设备生成动态环境条件

Summary

我们介绍了一个用于复杂生命机械高吞吐量研究的微流体系统，该系统由 1500 个培养单元、一系列增强的永久泵和现场混合模组组成。微流体芯片可分析体内高度复杂和动态的微环境条件。

Abstract

模仿体内环境条件对于复杂生命机械的体外研究至关重要。然而，目前针对活细胞和器官的技术要么非常昂贵，比如机器人技术，要么在液体操作中缺乏纳米线体积和毫秒时间精度。我们介绍一个微型流体系统的设计和制造，该系统由 1，500 个培养单元、一系列增强的永久泵和现场混合模组组成。为了证明微流体装置的能力，神经干细胞（NSC）球体在拟议的系统中保持。我们观察到，当 NSC 球体在第 1 天接触 CXCL，在第 2 天接触 EGF 时，圆形构象维护良好。6 种药物输入顺序的变化导致 NSC 球体的形态变化和 NSC 茎的表达水平代表标记（即 Hes5 和 Dcx）。结果表明，动态复杂的环境条件对NSC分化和自我更新有重大影响，建议的微流体装置是复杂生命机械高吞吐量研究的适宜平台。

Introduction

高吞吐量技术对生物医学和临床研究至关重要。通过同时进行数百万次化学、遗传或活细胞和器官测试，研究人员可以快速识别调节生物分子通路的基因，并根据自己的特定需求定制顺序药物输入。机器人¹和微流体芯片与设备控制程序相结合，允许复杂的实验程序自动化，包括细胞/组织操作，液体处理，成像和数据处理/控制^2，3。因此，根据所需的吞吐量^4，5，可以在一个芯片上维持成百上千的实验条件。

在此协议中，我们描述了微流体装置的设计和制造过程，该装置由 1500 个培养单元、一系列增强的围流泵和现场混合模组组成。二级细胞培养室可防止在中等交换过程中不必要的剪切，从而确保长期活细胞成像不受干扰的文化环境。研究表明，拟议中的微流体装置是研究复杂生命机械的高吞吐量的合适平台。此外，微流体芯片的先进功能允许在体内自动重组高度复杂和动态的微环境条件，如不断变化的细胞因子和配体组成^6，7，其完成需要几个月的传统平台，如96井板。

Protocol

1. 微流体芯片设计

1. 设计由 18 个入口组成的微流体多路复用器，每个入口都由单个阀门和永久泵控制。为了增加每个泵周期驱动的液体体积，由 3 个控制通道（特意加宽至 200 μm）和 10 条连接的流线组成。
2. 设计无剪切文化室。二级培养单元的复制由较低细胞培养室（400μm x 400 μm x 150 μm）和较高的缓冲层（400μm x 400 μm x 75 μm）组成，可防止在中等交换期间对细胞产生不必要的剪切应力（图1）。
3. 设计高通量功能。复制培养单元，形成 30 x 50 矩阵布局，占地约 7 厘米 x 5 厘米。

2. 芯片制造和操作

1. 使用紫外线光刻制作复制品成型
   注:复制品成型是根据标准光刻协议⁸在硅晶片上制造的。
   1. 制造通道结构
      1. 旋转光分辨率:在硅晶片上旋转 5 mL 的 SU-8 3025 负光分辨率，在 10s 的 500 rpm 和 30s 的 3000 rpm 上旋转涂层。
      2. 软烘烤:将晶圆放在热板上2分钟，然后在95°C下加热10分钟，冷却至室温。
      3. 对齐和固化:修复对齐器支架上的晶圆和面膜，打开光源18s，以治愈暴露的光分辨率。
      4. 暴露前烘烤:将晶圆从室温提升至 110°C/h 95°C，并保持至少 40 分钟，直到移除。
      5. 开发:将晶圆浸入开发解决方案（SU-8 开发人员）中，搅拌 2.5 分钟，以冲洗多余的光分辨率，并获得 25μm 高通道结构。
      6. 硬烘烤:用玻璃培养皿盖住晶圆，在 65 °C 下烘烤 2 分钟，然后以 120 °C/h 的速度加速至 160°C，并保持 3 小时。
   2. 用缓冲层制造细胞培养室
      1. 使用步骤 2.1.1.1 的参数在上述晶圆上旋转 SU-8 3075 负光分辨率的 7 mL。
      2. 软烘烤（在第 2.1.1.2 步中描述）晶圆并更改面膜，以便与晶圆上的标记物很好地对齐。然后打开24s的光源来治愈暴露的光电。
      3. 将晶圆浸入开发解决方案（SU-8 开发人员），搅拌 4 分 40 秒，以洗掉多余的光分辨率，并获得 75μm 高的层结构，该结构围绕 25μm 高通道结构制造。硬烘烤（在步骤 2.1.1.6 中描述）晶圆，使复杂的结构更坚固。
      4. 重复步骤 2.1.2.1-2.1.2.3，以构建堆叠在层结构上的 75μm 高室结构。
   3. 阀门结构的制造
      1. 使用步骤 2.1.1.1 的参数在上述晶圆上旋转 AZ 50 倍正光分辨率的 5mL。
      2. 软烘烤（在第 2.1.1.2 步中描述）晶圆，使面膜与晶圆上的标记物保持良好对齐，然后保持光源打开 20s，然后立即关闭 30s。在 5 个圆圈中重复开/关程序，以治愈暴露的光分辨率。
      3. 将晶圆浸入匹配的开发人员，搅拌约 8 分钟，以冲洗多余的光分辨率，并获取与控制通道重叠的圆形阀门，以确保良好的连接。硬烘焙（在步骤 2.1.1.6 中描述）图案晶圆，使整个模型更坚固。
2. 使用软光刻技术进行微流体芯片生产
   1. 用硅氯硅烷处理图案和空白硅晶片15分钟。
   2. 分别准备 3 份 PDMS 凝胶（10:1 的单体/催化剂比），对应 50 克流层、20 克控制层 2 和 20 克膜。
   3. 在图案硅晶片上铸造 50 克 PDMS 凝胶，在真空室中以 -0.85 MPa 对它们进行 1-2 小时的除气，以复制流层。
   4. 将 20 克 PDMS 的 2 部分分解，并在图案晶圆和空白硅晶片上旋转 2000-2800 rpm，30s，以准备控制层和膜层。
   5. 将 PDMS 覆盖的晶圆放入通风烤箱中 60 分钟，在 80 °C 下进行孵化。
   6. 通过定制光学设备（放大 100 倍）和等离子蚀刻机将不同层对齐并粘合在一起。然后在 80 °C 的通风烤箱中保存 2 小时，以增强芯片的粘接。
   7. 在芯片上打入孔，然后将其粘接到 PDMS 涂层盖上，并在使用前在 80 °C 下固化至少 12 小时。
3. 芯片操作
   1. 将微型气动电磁阀连接到芯片的控制层，并打开自定义的 MATLAB 图形用户界面⁸ 来连接和控制开关。
   2. 将俯卧撑 PDMS 膜阀的闭合压力设置为 25 psi。
   3. 通过及时关闭阀门，向指定腔室（图 2d）提供动态变化的组合/顺序输入。

3. 在细胞微环境下生成动态输入

1. 芯片处理和细胞加载
   1. 在显微镜上保持标准培养条件（37 °C，5% CO_2）至少5小时。
   2. 将芯片填充涂层介质（即注释中提及的），并在标准培养条件下（第 3.1.1 步中描述）孵育至少一小时。
   3. 通过磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 或细胞培养介质 （杜尔贝科的改良鹰的介质， DMEM） 冲洗芯片， 以建立一个健康的文化环境。
   4. 以 80% 的二致性收获细胞，并使用培养介质 （DMEM） 以大约 10^6/mL的密度恢复细胞。然后通过加压含细胞的溶液将细胞加载到芯片中。
      注意:在芯片上培养不同的细胞系需要相应的涂层介质来治疗细胞培养室。通常，对于 3T3 成纤维细胞和母鸡的粘附培养物的实验，控制培养室的所有阀门都是开放的，细胞流入同一列内的所有培养室。
2. 用于高吞吐量活细胞成像的设置
   注意:在图像采集方面，使用了具有自动转换阶段的倒显微镜和数字互补金属氧化物半导体 （CMOS） 相机。舞台和图像采集通过自定义软件进行控制。
   1. 在明亮的领域中使用 10 倍目标透镜可视化文化室的矩阵，以确认和定义 30 乘 50 腔室矩阵中每个腔室的位置坐标。
   2. 将目标镜头转换为 20 倍或 40 倍，然后选择所需腔室的位置坐标，并在确认后将转换阶段移动到指定位置。微调 x、y、z 焦距平面以获得最佳图像。
   3. 优化每个通道的光强度、暴露时间和其他图像参数（即亮场和荧光成像）。
   4. 设置成像周期的间隔和持续时间，保存路径，然后开始成像。

Results

传统的芯片上渗透泵最初由斯蒂芬·奎克在2000年描述，使用这种渗透是由模式101，100，110，010，011，001^8，10激活的。 数字 0 和 1 表示 3 个水平控制线的"打开"和"关闭"。使用超过3个阀门（例如，5个）的研究也报告了¹¹个。尽管由 3 条控制线和 3 条流线组成的永久泵提供了纳米线精度，但传输速度太慢，无法养活 1，500 个培养室。为了解决这个问题，我们包括更多的流线（即10个连接通道），以增加每个泵送周期（即101，100，110，010，011，001）驱动的液体体积。因此，营养物质和药物可以有效地输送到指定的腔室。每泵周期的永久泵输送液体体积可增加 16 倍至约 50 纳米升。由于围产泵阵列由 3 个连接控制通道（图 1b）控制，因此每个入口的解决方案同时交付到芯片中，并允许即时混合。因此，通过及时关闭连接到不同解决方案的入口，可以生成组合和顺序输入。使用相同的方法，也可以产生动...

Discussion

各种微流体装置已开发出来，以执行多路复用和复杂的实验17，18，19，20。例如，由一系列拓扑凹槽制成的微井可以捕获单个细胞，而无需使用外部力，表现出有利的特性，包括样本量小、平行、材料成本更低、响应更快、灵敏度高 21、22、23、24。液滴和表面张力密闭液滴消除了对微泵等辅助硬件的需求，使水滴的运输成本更低^，环保性更友好^。液体滴可以通过微喷头或喷雾器喷嘴轻易地沉积在表面，经过实验，这些系统可以很容易地刷新和重复...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2713 Loker Avenue West	Torrey pines scientific
AZ-50X	AZ Electronic Materials， Luxembourg
氯三甲基硅烷 （TMCS） 92360-25mL	Sigma
CO2 培养箱 HP151	Heal Force
台式 PDMS 芯片打孔器 WH-CF-14	苏州文浩微流控科技有限公司
DMEM（L-谷氨酰胺，高葡萄糖，赫诺红）	Invitrogen
电子天平 UTP-313 Max：600g， e：0.1g， d：0.01g	上海合思仪器制造有限公司
FBS	Sigma
纤维分离 0.25 mg/mL	Millipore，奥地利
Glutamax 100x	Gibco
加热培养箱 BGG-9240A	上海蓝帕德仪器有限公司
尼康 Eclipse Ti2-E	尼康
笔/链球菌 10 单位/mL 青霉素 10 微克/毫升 链霉素	Invitrogen
血浆清洁剂 PDC-002	Harrick 血浆
聚二甲基硅氧烷 （PDMS）	Momentive
聚赖氨酸 0.01%	Sigma
旋涂机 ARE-310	Awatori Rentaro
旋涂机 TDZ5-WS	Cence
旋涂机 WH-SC-01	苏州文浩微流控科技有限公司
SU-8 3025	MicroChem， 韦斯特伯勒， 马萨诸塞州， 美国SU-8
3075	MicroChem， 韦斯特伯勒， 马萨诸塞州， 美国