使用高通量微流体设备生成动态环境条件

Summary

我们介绍了一个用于复杂生命机械高吞吐量研究的微流体系统，该系统由 1500 个培养单元、一系列增强的永久泵和现场混合模组组成。微流体芯片可分析体内高度复杂和动态的微环境条件。

Abstract

模仿体内环境条件对于复杂生命机械的体外研究至关重要。然而，目前针对活细胞和器官的技术要么非常昂贵，比如机器人技术，要么在液体操作中缺乏纳米线体积和毫秒时间精度。我们介绍一个微型流体系统的设计和制造，该系统由 1，500 个培养单元、一系列增强的永久泵和现场混合模组组成。为了证明微流体装置的能力，神经干细胞（NSC）球体在拟议的系统中保持。我们观察到，当 NSC 球体在第 1 天接触 CXCL，在第 2 天接触 EGF 时，圆形构象维护良好。6 种药物输入顺序的变化导致 NSC 球体的形态变化和 NSC 茎的表达水平代表标记（即 Hes5 和 Dcx）。结果表明，动态复杂的环境条件对NSC分化和自我更新有重大影响，建议的微流体装置是复杂生命机械高吞吐量研究的适宜平台。

Introduction

高吞吐量技术对生物医学和临床研究至关重要。通过同时进行数百万次化学、遗传或活细胞和器官测试，研究人员可以快速识别调节生物分子通路的基因，并根据自己的特定需求定制顺序药物输入。机器人¹和微流体芯片与设备控制程序相结合，允许复杂的实验程序自动化，包括细胞/组织操作，液体处理，成像和数据处理/控制^2，3。因此，根据所需的吞吐量^4，5，可以在一个芯片上维持成百上千的实验条件。

在此协议中，我们描述了微流体装置的设计和制造过程，该装置由 1500 个培养单元、一系列增强的围流泵和现场混合模组组成。二级细胞培养室可防止在中等交换过程中不必要的剪切，从而确保长期活细胞成像不受干扰的文化环境。研究表明，拟议中的微流体装置是研究复杂生命机械的高吞吐量的合适平台。此外，微流体芯片的先进功能允许在体内自动重组高度复杂和动态的微环境条件，如不断变化的细胞因子和配体组成^6，7，其完成需要几个月的传统平台，如96井板。

....

Protocol

1. 微流体芯片设计

1. 设计由 18 个入口组成的微流体多路复用器，每个入口都由单个阀门和永久泵控制。为了增加每个泵周期驱动的液体体积，由 3 个控制通道（特意加宽至 200 μm）和 10 条连接的流线组成。
2. 设计无剪切文化室。二级培养单元的复制由较低细胞培养室（400μm x 400 μm x 150 μm）和较高的缓冲层（400μm x 400 μm x 75 μm）组成，可防止在中等交换期间对细胞产生不必要的剪切应力（图1）。
3. 设计高通量功能。复制培养单元，形成 30 x 50 矩阵布局，占地约 7 厘米 x 5 厘米。

2. 芯片制造和操作

1. 使用紫外线光刻制作复制品成型
   注:复制品成型是根据标准光刻协议⁸在硅晶片上制造的。
   1. 制造通道结构
      1. 旋转光分辨率:在硅晶片上旋转 5 mL 的 SU-8 3025 负光分辨率，在 10s 的 500 rpm 和 30s 的 3000 rpm 上旋转涂层。
      2. 软烘烤:将晶圆放在热板上2分钟，然后在95°C下加热10分钟，冷却至室温。
      3. 对齐和固化:修复对齐器支架上的晶圆和面膜，打开光源18s，以治愈暴露的光分辨率。
      4. 暴露前烘烤:将晶圆....

Results

传统的芯片上渗透泵最初由斯蒂芬·奎克在2000年描述，使用这种渗透是由模式101，100，110，010，011，001^8，10激活的。 数字 0 和 1 表示 3 个水平控制线的"打开"和"关闭"。使用超过3个阀门（例如，5个）的研究也报告了¹¹个。尽管由 3 条控制线和 3 条流线组成的永久泵提供了纳米线精度，但传输速度太慢，无法养活 1，500 个培养室。为了解决这个问题，我们包括更多的流线（即10个连接通道），以增加每个泵送周期（即101，100，110，010，011，001）驱动的液体体积。因此，营养物质和药物可以有效地输送到指定的腔室。每泵周期的永久泵输送液体体积可增加 16 倍至约 50 纳米升。由于围产泵阵列由 3 个连接控制通道（图 1b）控制，因此每个入口的解决方案同时交付到芯片中，并允许即时混合。因此，通过及时关闭连接到不同解决方案的入口，可以生成组合和顺序输入。使用相同的方法，也可以产生动.......

Discussion

各种微流体装置已开发出来，以执行多路复用和复杂的实验17，18，19，20。例如，由一系列拓扑凹槽制成的微井可以捕获单个细胞，而无需使用外部力，表现出有利的特性，包括样本量小、平行、材料成本更低、响应更快、灵敏度高 21、22、23、24。液滴和表面张力密闭液滴消除了对微泵等辅助硬件的需求，使水滴的运输成本更低^，环保性更友好^。液体滴可以通过微喷头或喷雾器喷嘴轻易地沉积在表面，经过实验，这些系统可以很容易地刷新和重复.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2713 Loker Avenue West	Torrey pines scientific
AZ-50X	AZ Electronic Materials， Luxembourg
氯三甲基硅烷 （TMCS） 92360-25mL	Sigma
CO2 培养箱 HP151	Heal Force
台式 PDMS 芯片打孔器 WH-CF-14	苏州文浩微流控科技有限公司
DMEM（L-谷氨酰胺，高葡萄糖，赫诺红）	Invitrogen
电子天平 UTP-313 Max：600g， e：0.1g， d：0.01g	上海合思仪器制造有限公司
FBS	Sigma
纤维分离 0.25 mg/mL	Millipore，奥地利
Glutamax 100x	Gibco
加热培养箱 BGG-9240A	上海蓝帕德仪器有限公司
尼康 Eclipse Ti2-E	尼康
笔/链球菌 10 单位/mL 青霉素 10 微克/毫升 链霉素	Invitrogen
血浆清洁剂 PDC-002	Harrick 血浆
聚二甲基硅氧烷 （PDMS）	Momentive
聚赖氨酸 0.01%	Sigma
旋涂机 ARE-310	Awatori Rentaro
旋涂机 TDZ5-WS	Cence
旋涂机 WH-SC-01	苏州文浩微流控科技有限公司
SU-8 3025	MicroChem， 韦斯特伯勒， 马萨诸塞州， 美国SU-8
3075	MicroChem， 韦斯特伯勒， 马萨诸塞州， 美国