利用高通量微流控装置产生动态环境条件

摘要

我们介绍一种用于复杂生命机制高通量研究的微流控系统，该系统包含1500个培养单元、一组增强型蠕动泵以及一个现场混合模块。该微流控芯片可实现对体内高度复杂且动态变化的微环境条件进行分析。

摘要

模拟体内环境条件对于体外研究复杂生命机制至关重要。然而，目前针对活细胞和器官的研究技术要么成本极高（如机器人技术），要么在液体操控的纳升级体积和毫秒级时间精度方面存在不足。本文提出了一种微流控系统的设计与制备方法，该系统包含1,500个培养单元、一组增强型蠕动泵以及一个现场混合模块。为展示该微流控装置的功能，我们在该系统中维持了神经干细胞（NSC）球体的培养。我们观察到，当NSC球体在第1天暴露于CXCL、第2天暴露于EGF时，其圆形形态得以良好维持。输入6种药物的顺序变化会导致NSC球体形态改变，以及NSC干性代表性标志物（即Hes5和Dcx）表达水平的变化。这些结果表明，动态且复杂的环境条件对NSC的分化与自我更新具有显著影响，而所提出的微流控装置是开展复杂生命机制高通量研究的适宜平台。

引言

高通量技术对于生物医学和临床研究至关重要。通过并行开展数以百万计的化学、遗传或活细胞及类器官实验，研究人员能够快速鉴定调控特定生物分子通路的基因，并根据个体的具体需求定制序贯药物处理方案。机器人技术¹与微流控芯片结合设备控制程序，可实现包括细胞/组织操作、液体处理、成像以及数据处理与控制在内的复杂实验流程自动化^2,3。因此，根据所需的通量，单个芯片上可同时维持数百乃至数千种实验条件^4,5。

在本方案中，我们描述了一种微流控装置的设计与制备流程，该装置包含1500个培养单元、一组增强型蠕动泵以及原位混合模块。两级细胞培养腔室可防止在换液过程中产生不必要的剪切力，从而为长期活细胞成像提供稳定的培养环境。研究表明，所提出的微流控装置是研究复杂生命机制的适宜平台。此外，该微流控芯片的先进功能可实现对体内高度复杂且动态的微环境条件（如不断变化的细胞因子和配体组成^6,7）进行自动化重建，而使用传统平台（如96孔板）完成此类任务通常需要数月时间。

....

方案

1. 微流控芯片设计

1. 设计包含18个入口的微流控多路复用器，每个入口由一个独立的阀门和蠕动泵控制。为了增加每次泵送循环所驱动的液体体积，使蠕动泵由3条控制通道（特意加宽至200 µm）和10条相连的流道组成。
2. 设计无剪切力培养室。双层培养单元的结构包括下方的细胞培养腔（400 µm × 400 µm × 150 µm）和上方的缓冲层（400 µm × 400 µm × 75 µm），可在培养基更换过程中避免细胞受到不必要的剪切应力（图1）。
3. 设计高通量功能模块。将培养单元复制形成30 × 50的矩阵布局，占据约7 cm × 5 cm的面积。

2. 芯片制备与操作

1. 使用紫外光刻技术制备复制模具
   注意：复制模具在硅晶圆上按照标准光刻工艺制备⁸。
   1. 制备通道结构
      1. 旋涂光刻胶：在硅晶圆上旋涂5 mL SU-8 3025负性光刻胶，先以500 rpm转速旋转10秒，再以3000 rpm转速旋转30秒。
      2. 前烘：将晶圆置于热板上，65 °C加热2分钟，然后95 °C加热10分钟，之后冷却至室温。
      3. 对准与曝光固化：将晶圆和掩模固定在对准器的夹具上，开启光源照射18秒，使曝光区....

结果

传统的芯片上蠕动泵最初由 Stephen Quake 于 2000 年描述，其蠕动通过 101、100、110、010、011、001 的模式驱动^8,10。数字 0 和 1 分别表示 3 条水平控制线的“打开”和“关闭”状态。已有研究报道使用超过 3 个阀门（例如五个）的系统¹¹。尽管由 3 条控制线和 3 条流体通道组成的蠕动泵可实现纳升级精度，但其输送速率过慢，无法满足 1,500 个培养腔室的供液需求。为解决该问题，我们增加了流体通道数量（即 10 条连接通道），以提高每个泵送周期（即 101、100、110、010、011、001）所驱动的液体体积。因此，营养物质和药物可被有效输送至指定腔室。蠕动泵每次泵送周期输送的液体体积可增加 16 倍，达到约 50 纳升。由于蠕动泵阵列由 3 条相连的控制通道控制（图 1b），来自各个入口的溶液可同时被输送至芯片，并实现即时混合。因此，通过适时开启或关闭连接不同溶液的.......

讨论

已开发出多种微流控装置用于进行多重化和复杂的实验^17,18,19,20。例如，由拓扑凹陷阵列构成的微孔阵列可在无需外加作用力的情况下捕获单个细胞，具有样品量小、可并行操作、材料成本低、响应速度快、灵敏度高等优势^21,22,23,24。液滴技术以及由表面张力限制的液滴系统无需微泵等辅助硬件，使液滴运输更加低成本且环境友好^25,26。液体液滴可通过微量移液器或喷雾喷嘴直接沉积在表面，实验结束后系统可简便地更新并重复使用.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2713 Loker Avenue West	Torrey pines scientific
AZ-50X	AZ Electronic Materials, Luxembourg
三甲基氯硅烷（TMCS）92360-25mL	Sigma
CO2 培养箱 HP151	Heal Force
PDMS芯片台式打孔器 WH-CF-14	苏州文浩微流控科技有限公司
DMEM（L-谷氨酰胺，高糖，酚红）	Invitrogen
电子天平 UTP-313 最大量程：600g，e：0.1g，d：0.01g	上海和创仪器制造有限公司
胎牛血清（FBS）	Sigma
纤连蛋白 0.25 mg/mL	Millipore, 奥地利
Glutamax 100x	Gibco
恒温培养箱 BGG-9240A	上海比朗仪器有限公司
尼康 Eclipse Ti2-E 型显微镜	Nikon
青霉素-链霉素双抗溶液 10 单位/mL 青霉素，10 µg/mL 链霉素	Invitrogen
等离子清洗机 PDC-002	Harrick Plasma
聚二甲基硅氧烷（PDMS）	Momentive
多聚赖氨酸 0.01%	Sigma
匀胶机 ARE-310	Awatori Rentaro
匀胶机 TDZ5-WS	Cence
匀胶机 WH-SC-01	苏州文浩微流控科技有限公司
SU-8 3025	MicroChem, Westborough, MA, 美国
SU-8 3075	MicroChem, Westborough, MA, 美国