一种富含纤维蛋白且对tPA敏感的光化学血栓性卒中模型

摘要

传统的光化学血栓性卒中（PTS）模型主要诱导形成对组织型纤溶酶原激活物（tPA）溶栓治疗具有高度抵抗性的致密血小板聚集体。本文介绍了一种通过共注射凝血酶和光敏染料进行光激活的改良小鼠PTS模型。该凝血酶增强型PTS模型可形成血小板与纤维蛋白混合的血栓，且对tPA溶栓治疗高度敏感。

摘要

理想的血栓栓塞性卒中模型需具备若干特性，包括手术操作相对简便且死亡率低、梗死灶大小和位置稳定、形成的血栓为血小板与纤维蛋白混合结构，类似于患者体内的血栓，并且对溶栓治疗具有足够的敏感性。基于玫瑰红B（rose bengal, RB）染料的光化学诱导血栓模型满足前两项要求，但其血栓对组织型纤溶酶原激活剂（tPA）介导的溶栓治疗高度抵抗，这可能与其富含血小板但纤维蛋白含量较低的血栓成分有关。我们推测，在大脑中动脉（MCA）近端分支区域进行光激活时，联合使用RB染料（50 mg/kg）和亚致血栓剂量的凝血酶（80 U/kg）可能形成富含纤维蛋白且对tPA敏感的血栓。事实上，凝血酶与RB（T+RB）联合的光化学血栓模型确实诱导出混合型血小板-纤维蛋白血栓，免疫染色和免疫印迹结果均证实了这一点，同时该模型保持了稳定的梗死灶大小和位置，并具有较低的死亡率。此外，在光激活后2小时内静脉注射tPA（阿替普酶，10 mg/kg）可显著减小T+RB光化学血栓模型中的梗死灶体积。因此，凝血酶增强型光化学诱导血栓卒中模型可能是一种用于评估新型溶栓疗法的有效实验模型。

引言

血管内取栓术和tPA介导的溶栓治疗是目前仅有的两种经美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于急性缺血性卒中的治疗方法，该疾病每年在美国影响约70万名患者¹。由于取栓术的应用仅限于大血管闭塞（LVO），而tPA溶栓可能缓解小血管闭塞，因此这两种疗法在急性缺血性卒中的治疗中均具有重要价值²。此外，联合使用这两种疗法（例如，在卒中发病后4.5小时内启动tPA溶栓，随后进行取栓术）可改善脑血流再灌注及患者的功能预后³。因此，即使在取栓术广泛应用的时代，优化溶栓治疗仍是卒中研究的重要目标。

血栓栓塞性模型是旨在改进溶栓治疗的临床前卒中研究中的重要工具。这是因为机械性血管闭塞模型（例如，经腔内缝线法闭塞大脑中动脉）不会形成血凝块，且在机械性阻塞解除后脑血流迅速恢复，这种情况过于理想化^4,5。迄今为止，主要的血栓栓塞性模型包括光化学法血栓形成^6,7,8、局部应用三氯化铁（FeCl₃）⁹

方案

本方案已获得弗吉尼亚大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准，并遵循美国国立卫生研究院《实验动物照护与使用指南》。图1A 概述了本方案的手术操作流程。

1. 手术准备

1. 在手术前至少15分钟，将设定温度为37 °C的加热垫放置于小动物适配器上。准备一个用于适配器的鼻夹卷，以允许动物头部旋转。准备好麻醉剂氯胺酮（60 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）。
2. 使用高压灭菌器（121 °C、15 psi，持续60分钟）对包括剪刀、镊子、显微持针器、止血钳、棉签和缝合线在内的手术器械进行灭菌。准备组织胶和眼膏。为外科医生准备532 nm激光防护眼镜。
   注意：本方案描述的是一种主要的存活手术操作，应采用无菌技术进行。
3. 设置配备532 nm激光光源的照明系统。准备牙科钻。
4. 用生理盐水配制玫瑰红溶液（10 mg/mL）。将一份牛凝血酶（0.1 U/µL）置于冰桶中保存。
5. 在手术前30分钟，皮下注射酮洛芬 （4.0 mg/kg）作为小鼠镇痛用药，或按照当地机构推荐的镇痛方案执行。

2. 结扎同侧颈总动脉

1. 通过肌肉注射氯胺酮（60 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg），对体重为22至30 g的10至14....

结果

首先，我们比较了RB与T+RB光诱导血栓形成中纤维蛋白的含量。在光激活后2小时，通过心脏灌注固定剂处死小鼠，并取出脑组织，对大脑中动脉（MCA）分支进行纵向和横向的免疫荧光染色。在RB光诱导血栓模型中，MCA分支被CD41密集填充⁺ 血小板和少量纤维蛋白（图2A，C）。相比之下，T+RB光血栓模型中的MCA分支被随机混合的血小板：纤维蛋白血栓阻塞图2B，D，n>每组3只）。我们还在光激活后2小时经心脏灌注生理盐水，通过免疫印迹法比较两种模型大脑皮层中纤维蛋白（原）的水平。该分析显示 > T+RB光血栓形成中同侧半球纤维蛋白沉积比RB光血栓形成增加两倍图 2E，p=0.027（非配对检验） t-检验；每组 n=3)。在我们的原始报告中，还使用共聚焦显微镜结合单血管光激活和活体成像技术，比较了FITC标记的抗GP1bβ抗体标记血小板的行为。

讨论

1985年提出的传统玫瑰红B（RB）光化学诱导脑卒中模型，因其手术操作简便、死亡率低以及脑梗死结果高度可重复，成为局灶性脑缺血研究中广受欢迎的模型。⁵ 在该模型中，光敏染料RB在光照激发后迅速激活血小板，形成致密的血小板聚集体，导致血管闭塞。^5,8,23 然而，RB诱导形成的血栓中纤维蛋白含量较少（图2），这与急性缺血性脑卒中患者体内取出的血栓中血小板与纤维蛋白相互混杂为主的结构特征存在差异。^21,22 RB诱导血栓中纤维蛋白含量低的特点可能也是其对组织型纤溶酶原激活剂（tPA）溶栓治疗抵抗的原因之一。^7,8

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）	Sigma	T8877	梗死
4-0 尼龙单丝缝线	LOOK	766B	手术用品
5-0 丝线缝线	Harvard Apparatus	624143	手术用品
543 nm 激光束	Melles Griot	25-LGP-193-249	光化学血栓形成
成年雄性小鼠	Charles River	C57BL/6	10~14 周龄（22~30 g）
小鼠适配器用麻醉杆	machine shop, UVA		手术装置
Avertin（2,2,2-三溴乙醇）	Sigma	T48402	安乐死
牙科钻	Dentamerica	Rotex 782	手术装置
数码显微镜	Dino-Lite	AM2111	脑成像
解剖显微镜	Olympus	SZ40	手术装置
精细弯头镊子（带齿）	FST	11370-31	手术器械
精细弯头镊子（光滑）	FST	11373-12	手术器械
山羊抗兔 Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11008	免疫组织化学
Halsted-Mosquito 止血钳	FST	13008-12	手术器械
带加热垫的热泵	Gaymar	TP700	手术装置
输注泵	KD Scientific	200	溶栓治疗
带31G针头的胰岛素注射器	BD	328291	光化学血栓形成
氯胺酮	CCM, UVA		麻醉
532 nm 激光防护眼镜	Thorlabs	LG3	光化学血栓形成
酮洛芬	CCM, UVA		非甾体抗炎镇痛药
微型持针器	FST	12060-01	手术器械
微型剪刀	FST	15000-03	手术器械
MoorFLPI-2 血流成像仪	Moor	780-nm 激光源	激光散斑对比成像
小鼠适配器	RWD	68014	手术装置
Puralube Vet 软膏	Fisher	NC0138063	预防眼干燥
牵开器头端	Kent Scientific	Surgi-5014-2	手术装置
玫瑰红	Sigma	198250	光化学血栓形成
凝血酶	Sigma	T7513	光化学血栓形成
组织胶	Abbott Laboratories	NC9855218	手术用品
tPA	Genetech	Cathflo activase 2mg	溶栓治疗
振动切片机	Stoelting	51425	TTC 梗死
赛拉嗪	CCM, UVA		麻醉