方法文章

可视化大鼠颅顶硬脑膜中降钙素基因相关肽免疫反应性神经支配：免疫荧光与神经示踪技术

DOI：

10.3791/61742

⸱

2021年1月6日

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1Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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本文介绍了一种利用免疫荧光和荧光组织化学技术，分别使用降钙素基因相关肽（CGRP）和鬼笔环肽对颅脑硬脑膜中CGRP免疫反应性神经纤维与血管的空间分布关系进行可视化观察的实验方案。此外，还采用荧光神经示踪剂对这些神经纤维的起源进行了逆行示踪。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究旨在利用免疫荧光、三维（3D）重建和逆行示踪技术，探讨颅脑硬脑膜中降钙素基因相关肽（CGRP）免疫反应性感觉神经纤维的分布及其起源。在此，分别采用免疫荧光和组织化学技术，使用CGRP抗体和荧光标记的鬼笔环肽对神经纤维和血管进行染色。通过三维重建技术展示了硬脑膜CGRP免疫反应性神经纤维与血管之间的空间关系。同时，利用荧光金（FG）逆行神经示踪技术，从颅脑硬脑膜中脑膜中动脉（MMA）周围区域至三叉神经节（TG）及颈段（C）背根神经节（DRGs）检测CGRP免疫反应性神经纤维的起源。此外，还通过双重免疫荧光染色联合CGRP，检测TG和DRGs中FG标记神经元的化学特性。借助透明化整体样本和三维重建技术，结果显示在三维视角下，CGRP免疫反应性神经纤维与鬼笔环肽标记的小动脉可共同走行或独立分布，形成硬脑膜神经血管网络；而FG标记的神经元则位于TG的眼支、上颌支和下颌支，以及与示踪剂注射侧同侧的C2-3 DRGs中，其中部分FG标记的神经元呈现CGRP免疫反应性表达。通过这些方法，我们揭示了颅脑硬脑膜血管周围CGRP免疫反应性神经纤维的分布特征及其来源于TG和DRGs的神经解剖基础。从方法学角度来看，本研究可为理解生理或病理状态下颅脑硬脑膜复杂的神经血管结构提供有价值的参考。

引言

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硬脑膜是脑膜中最外层的结构，具有保护大脑的作用，其内含有丰富的血管和多种神经纤维1,2。大量研究表明，敏化的硬脑膜可能是引发头痛的关键因素，涉及血管异常扩张及神经支配的变化3,4,5。因此，了解硬脑膜中的神经血管结构对于认识头痛，尤其是偏头痛的发病机制具有重要意义。

尽管硬脑膜的神经支配此前已通过常规免疫组织化学方法进行过研究，但颅顶硬脑膜中神经纤维与血管之间的空间关系仍较少被深入探讨6,7,8,9。为了更详细地揭示硬脑膜的神经血管结构，本研究选用降钙素基因相关肽（CGRP）和鬼笔环肽（phalloidin）作为标记物，分别通过免疫荧光和荧光组织化学方法对颅顶硬脑膜整体组织中的神经纤维和血管进行染色10，这可能是获得神经血管结构三维（3D）图像的最佳选择。此外，在颅顶硬脑膜的....

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方案

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本研究经中国中医科学院针灸研究所伦理委员会批准（批准号：D2018-09-29-1）。所有操作均遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》（国家科学院出版社，华盛顿特区，1996年）。本研究共使用12只成年雄性Sprague-Dawley大鼠（体重220 ± 20 g）。实验动物[许可证号SCXK（JING）2017-0005]由国家药品监督管理局食品药品检定研究院提供。

1. 大鼠颅顶硬脑膜的神经支配

  1. 灌注
    1. 向大鼠腹腔注射过量三溴乙醇溶液（250 mg/kg）以实施安乐死。
    2. 待呼吸停止后，经心脏灌注100 mL 0.9%生理盐水，随后灌注250–300 mL含4%多聚甲醛的0.1 M磷酸盐缓冲液（PB，pH 7.4）。
    3. 灌注完成后，去除头部皮肤并打开颅骨，暴露硬脑膜及大脑背侧。随后以整体组织方式沿脑干至嗅球完整剥离颅部硬脑膜（图1）。在4%多聚甲醛中后固定2小时，然后在4 °C条件下用含25%蔗糖的0.1 M PB溶液保护至少24小时。
  2. CGRP与鬼笔环肽荧光免疫组织化学染色
    注：采用CGRP与鬼笔环肽联合荧光染色，以在整体组织模式下揭示大鼠颅部硬脑膜中神经纤维与血管的空间关系。
      ....

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结果

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颅骨硬脑膜的神经血管结构
通过CGRP和鬼笔环肽进行免疫荧光及荧光组织化学染色后，在颅骨硬脑膜全组织标本中，以三维形式清晰显示了CGRP免疫反应性神经纤维以及鬼笔环肽标记的硬脑膜小动脉和结缔组织（图2C、D、E、F）。结果显示，粗细不等的CGRP免疫反应性神经纤维与硬脑膜小动脉平行走行，分布于血管壁周围或血管之间（图2D、E、F）。借助三维重建技术，可从不同角度清晰展示硬脑膜小动脉的形态特征及其与硬脑膜CGRP免疫反应性神经纤维之间的空间关系。

三叉神经节和背根神经节中逆行标记的神经元
在将荧光金（FG）应用于大鼠颅脑硬脑膜中脑膜中动脉（MMA）区域后7天（

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讨论

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本研究中，我们成功利用CGRP抗体和FG神经示踪剂，通过免疫荧光、三维重建及神经示踪技术，揭示了颅脑硬脑膜中CGRP免疫反应性神经纤维的分布及其起源，为深入理解硬脑膜神经血管网络提供了组织学和化学证据。

已知降钙素基因相关肽（CGRP）在偏头痛的发病机制中起着关键作用4,17。研究表明，CGRP水平升高可导致血管扩张和神经源性炎症，从而引起三叉神经通路中的外周和中枢敏化4,18。CGRP免疫反应性神经纤维属于无髓鞘的肽能感觉轴突，负责传递伤害性刺激信号19。与既往研究一致，本文中我们清晰地展示了CGRP免疫反应性神经纤维在颅脑硬脑膜中的分布，并追溯其起源于三叉神经节（TG）和背根神经节（DRGs）中的小至中等直径的感觉神经元。这些细胞结构可能是合成和释放CGRP的来源。另一方面，鬼笔环肽（phalloi.......

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究由国家重点研发计划项目资助&中国国家重点研发计划（项目编号：2019YFC1709103；2018YFC1707804）和国家自然科学基金（项目编号：81774211；81774432；81801561）

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Alexa Fluor 488 驴抗小鼠 IgG (H+L)Invitrogen by Thermo Fisher ScientificA21202避光保存；RRID: AB_141607
脑立体定位仪NarishigeSR-50
CellSens DimensionOlympus版本 1.1荧光显微镜软件
共聚焦成像系统OlympusFV1200
Fluorogold (FG)Fluorochrome52-9400避光保存
荧光成像系统OlympusBX53
冷冻切片机ThermoMicrom International GmbH
Olympus FV10-ASW 4.2aOlympus版本 4.2共聚焦图像处理软件系统
微型钻孔机Saeyang MicrotechMarathon-N7
小鼠抗 CGRP 抗体Abcamab81887RRID: AB_1658411
正常驴血清Jackson ImmunoResearch017-000-121
Phalloidin 568Molecular ProbesA12380避光保存
Photoshop 和 IllustratorAdobeCS6图像编辑软件
兔抗 Fluorogold 抗体Abcamab153RRID: AB_90738
Sprague Dawley 大鼠中国食品药品检定研究院SCXK (JING) 2014-0013
Superfrost plus 显微镜载玻片Thermo#4951PLUS-00125×75×1 mm

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kekere, V., Alsayouri, K. Anatomy, Head and Neck, Dura Mater. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2020).
  2. Shimizu, T., et al. Distribution and origin of TRPV1 receptor-containing nerve fibers in the dura mater of rat. Brain Research. 1173, 84-9....

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