可视化大鼠颅顶硬脑膜中降钙素基因相关肽免疫反应性神经支配：免疫荧光与神经示踪技术

摘要

本文介绍了一种利用免疫荧光和荧光组织化学技术，分别使用降钙素基因相关肽（CGRP）和鬼笔环肽对颅脑硬脑膜中CGRP免疫反应性神经纤维与血管的空间分布关系进行可视化观察的实验方案。此外，还采用荧光神经示踪剂对这些神经纤维的起源进行了逆行示踪。

摘要

本研究旨在利用免疫荧光、三维（3D）重建和逆行示踪技术，探讨颅脑硬脑膜中降钙素基因相关肽（CGRP）免疫反应性感觉神经纤维的分布及其起源。在此，分别采用免疫荧光和组织化学技术，使用CGRP抗体和荧光标记的鬼笔环肽对神经纤维和血管进行染色。通过三维重建技术展示了硬脑膜CGRP免疫反应性神经纤维与血管之间的空间关系。同时，利用荧光金（FG）逆行神经示踪技术，从颅脑硬脑膜中脑膜中动脉（MMA）周围区域至三叉神经节（TG）及颈段（C）背根神经节（DRGs）检测CGRP免疫反应性神经纤维的起源。此外，还通过双重免疫荧光染色联合CGRP，检测TG和DRGs中FG标记神经元的化学特性。借助透明化整体样本和三维重建技术，结果显示在三维视角下，CGRP免疫反应性神经纤维与鬼笔环肽标记的小动脉可共同走行或独立分布，形成硬脑膜神经血管网络；而FG标记的神经元则位于TG的眼支、上颌支和下颌支，以及与示踪剂注射侧同侧的C2-3 DRGs中，其中部分FG标记的神经元呈现CGRP免疫反应性表达。通过这些方法，我们揭示了颅脑硬脑膜血管周围CGRP免疫反应性神经纤维的分布特征及其来源于TG和DRGs的神经解剖基础。从方法学角度来看，本研究可为理解生理或病理状态下颅脑硬脑膜复杂的神经血管结构提供有价值的参考。

引言

硬脑膜是脑膜中最外层的结构，具有保护大脑的作用，其内含有丰富的血管和多种神经纤维^1,2。大量研究表明，敏化的硬脑膜可能是引发头痛的关键因素，涉及血管异常扩张及神经支配的变化^3,4,5。因此，了解硬脑膜中的神经血管结构对于认识头痛，尤其是偏头痛的发病机制具有重要意义。

尽管硬脑膜的神经支配此前已通过常规免疫组织化学方法进行过研究，但颅顶硬脑膜中神经纤维与血管之间的空间关系仍较少被深入探讨^6,7,8,9。为了更详细地揭示硬脑膜的神经血管结构，本研究选用降钙素基因相关肽（CGRP）和鬼笔环肽（phalloidin）作为标记物，分别通过免疫荧光和荧光组织化学方法对颅顶硬脑膜整体组织中的神经纤维和血管进行染色¹⁰，这可能是获得神经血管结构三维（3D）图像的最佳选择。此外，在颅顶硬脑膜的脑膜中动脉（MMA）周围区域施加氟金（FG），以确定CGRP免疫反应性神经纤维的起源，并追踪其至三叉神经节（TG）和颈段（C）背根神经节（DRGs）；同时通过免疫荧光技术联合检测FG标记的神经元与CGRP的共表达情况。

本研究旨在提供一种有效工具，用于探究颅部硬脑膜中降钙素基因相关肽免疫反应性神经支配及其起源的神经血管结构。通过利用透明的整体硬脑膜标本，结合免疫荧光、逆行示踪、共聚焦技术及三维重建方法，我们期望呈现颅部硬脑膜中神经血管结构的全新三维视图。这些方法学手段可为进一步探索不同类型头痛的发病机制提供支持。

方案

本研究经中国中医科学院针灸研究所伦理委员会批准（批准号：D2018-09-29-1）。所有操作均遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》（国家科学院出版社，华盛顿特区，1996年）。本研究共使用12只成年雄性Sprague-Dawley大鼠（体重220 ± 20 g）。实验动物[许可证号SCXK（JING）2017-0005]由国家药品监督管理局食品药品检定研究院提供。

1. 大鼠颅顶硬脑膜的神经支配

1. 灌注
   1. 向大鼠腹腔注射过量三溴乙醇溶液（250 mg/kg）以实施安乐死。
   2. 待呼吸停止后，经心脏灌注100 mL 0.9%生理盐水，随后灌注250–300 mL含4%多聚甲醛的0.1 M磷酸盐缓冲液（PB，pH 7.4）。
   3. 灌注完成后，去除头部皮肤并打开颅骨，暴露硬脑膜及大脑背侧。随后以整体组织方式沿脑干至嗅球完整剥离颅部硬脑膜（图1）。在4%多聚甲醛中后固定2小时，然后在4 °C条件下用含25%蔗糖的0.1 M PB溶液保护至少24小时。
2. CGRP与鬼笔环肽荧光免疫组织化学染色
   注：采用CGRP与鬼笔环肽联合荧光染色，以在整体组织模式下揭示大鼠颅部硬脑膜中神经纤维与血管的空间关系。
   1. 将颅部硬脑膜在0.1 M PB中漂洗约1分钟。
   2. 将硬脑膜置于封闭液中孵育30分钟，封闭液组成为：0.1 M PB含3%正常驴血清和0.5% Triton X-100。
   3. 将硬脑膜转移至含小鼠抗-CGRP抗体（1:1000）的溶液中，该溶液为0.1 M PB含1%正常驴血清和0.5% Triton X-100，4 °C孵育过夜¹¹。
   4. 次日，用0.1 M PB将硬脑膜清洗三次。
   5. 将硬脑膜在混合溶液中室温（26 °C）孵育1.5小时，混合溶液为0.1 M PB含1%正常驴血清、0.5% Triton X-100、驴抗小鼠Alexa Fluor 488二抗（1:500）和鬼笔环肽568（1:1000）。
   6. 用0.1 M PB将硬脑膜清洗三次。
   7. 修剪边缘后，将组织置于显微镜载玻片上（见材料表）。
   8. 观察前加盖盖玻片，并滴加50%甘油封片。
3. 观察与记录
   1. 在荧光显微镜或共聚焦成像系统下观察荧光样品。
   2. 使用配备数码相机的荧光显微镜（4x，NA: 0.13）拍摄整体硬脑膜图像，曝光时间为500 ms。硬脑膜图像拼接通过荧光显微镜配套软件完成（见材料表）。
   3. 使用共聚焦显微镜拍摄硬脑膜中CGRP免疫阳性神经纤维与鬼笔环肽标记血管的图像。激发波长和发射波长分别为488 nm（绿色）和594 nm（红色）。共聚焦针孔大小为110（20x）和105 µm（40x）。图像采集分辨率为640 × 640像素。
   4. 对每片40 µm厚组织切片，在2 µm步长下连续采集20张图像，并使用共聚焦图像处理软件系统进行单焦点图像整合，用于三维分析，操作流程如下：设定起始焦平面 | 设定终止焦平面 | 设定步长 | 选择深度模式 | 图像采集 | Z序列。
   5. 使用图像编辑软件调整图像亮度和对比度以优化可视化效果，注意不得删除图像中的任何数据。

2. 使用FG进行逆行示踪研究

1. 外科手术操作
   1. 确定大鼠颅部硬脑膜中的目标坐标区域。
   2. 准备一支10 µL微量注射器，并用液体石蜡进行测试。
   3. 通过腹腔注射三溴乙醇溶液（150 mg/kg）对大鼠进行麻醉。通过脚趾夹捏无反应来判断麻醉深度。
   4. 用电剃刀剃除大鼠头部的毛发。
   5. 将钝头耳棒插入大鼠耳孔，并将其固定于立体定位仪上。随后安装口腔固定器，并在眼睛表面涂抹眼用软膏。
   6. 使用10%聚维酮碘清洁头部皮肤手术区域，随后使用75%乙醇。
   7. 沿头皮中线做一切口。
   8. 使用无菌棉签钝性剥离颅骨上的骨膜和肌肉组织（图1A).
   9. 使用圆头钻头（#106）的磨钻在左侧顶骨和颞骨的中脑膜动脉（MMA）上方钻一个小孔（约5–7 mm）¹²，并确保颅骨硬脑膜保持完整（图1B).
   10. 用牙科硅酸盐水泥在孔周围筑起围堰，以限制示踪剂的扩散（图1C).
   11. 用10 µL微量注射器将2 µL的2% FG加入MMA周围的孔中图1D).
   12. 用一小块止血海绵覆盖该孔洞。
   13. 在孔上覆盖一层石蜡膜，并用骨蜡密封边缘，以防止示踪剂泄漏并避免污染周围组织。
   14. 用无菌缝合线缝合伤口。
   15. 将大鼠置于温暖区域，直至其完全恢复。
   16. 将大鼠放回笼中，并在饮水中加入抗生素和镇痛剂。
2. 灌注与切片
   1. 在存活7天后，按照第1.1节所述步骤对这些大鼠进行灌注。
   2. 解剖取出三叉神经节（TG）和颈1-4段背根神经节（C1-4 DRGs），然后按照第1.1.3节所述方法进行后固定和 cryoprotection（冷冻保护）图1F).
   3. 在矢状方向上使用冷冻切片机系统将TG和DRG切成30 µm厚度，并贴附于硅烷涂层的玻璃载片上。
3. 三叉神经节和背根神经节中FG与CGRP标记的双重免疫荧光
   注意：尽管无需额外染色，即可在汞灯的紫外光照下直接观察到荧光金标记（FG-labeling）^13,14,15,16用FG逆行标记的神经元进一步通过降眼神经节（TG）和颈段背根神经节（DRGs）中FG与CGRP的双重免疫荧光染色，以揭示硬脑膜CGRP免疫反应性神经纤维在TG和DRGs中的起源。
   1. 用组织化学笔圈出相应区域。
   2. 在含有3%正常驴血清和0.5% Triton X-100的0.1 M PB溶液中，将切片于室温孵育30分钟。
   3. 将样品转移至含1%正常驴血清和0.5% Triton X-100的0.1 M PB缓冲液中，加入兔抗fluorogold抗体（1:1000）和小鼠抗CGRP抗体（1:1000），4 °C下孵育过夜。
   4. 次日用 0.1 M PB 洗涤切片三次。
   5. 在含有1%正常驴血清和0.5% Triton X-100的0.1 M PB中，加入驴抗兔Alexa Fluor 594（1:500）和驴抗鼠Alexa Fluor 488（1:500）二抗混合溶液，室温孵育1.5小时。
   6. 按照步骤1.2.6和1.2.8中的操作，清洗并加盖盖玻片于切片上。
4. 观察与记录
   1. 在荧光显微镜下，使用配备数码相机的设备，在紫外光照射下拍摄三叉神经节和背根神经节中荧光金标记的神经元图像。
   2. 在配备数字相机的荧光显微镜下拍摄三叉神经节和背根神经节中FG和CGRP标记神经元的图像。
   3. 使用编辑软件调整图像的亮度和对比度，并在图片中添加标签。

结果

颅骨硬脑膜的神经血管结构
通过CGRP和鬼笔环肽进行免疫荧光及荧光组织化学染色后，在颅骨硬脑膜全组织标本中，以三维形式清晰显示了CGRP免疫反应性神经纤维以及鬼笔环肽标记的硬脑膜小动脉和结缔组织（图2C、D、E、F）。结果显示，粗细不等的CGRP免疫反应性神经纤维与硬脑膜小动脉平行走行，分布于血管壁周围或血管之间（图2D、E、F）。借助三维重建技术，可从不同角度清晰展示硬脑膜小动脉的形态特征及其与硬脑膜CGRP免疫反应性神经纤维之间的空间关系。

三叉神经节和背根神经节中逆行标记的神经元
在将荧光金（FG）应用于大鼠颅脑硬脑膜中脑膜中动脉（MMA）区域后7天（

讨论

本研究中，我们成功利用CGRP抗体和FG神经示踪剂，通过免疫荧光、三维重建及神经示踪技术，揭示了颅脑硬脑膜中CGRP免疫反应性神经纤维的分布及其起源，为深入理解硬脑膜神经血管网络提供了组织学和化学证据。

已知降钙素基因相关肽（CGRP）在偏头痛的发病机制中起着关键作用^4,17。研究表明，CGRP水平升高可导致血管扩张和神经源性炎症，从而引起三叉神经通路中的外周和中枢敏化^4,18。CGRP免疫反应性神经纤维属于无髓鞘的肽能感觉轴突，负责传递伤害性刺激信号¹⁹。与既往研究一致，本文中我们清晰地展示了CGRP免疫反应性神经纤维在颅脑硬脑膜中的分布，并追溯其起源于三叉神经节（TG）和背根神经节（DRGs）中的小至中等直径的感觉神经元。这些细胞结构可能是合成和释放CGRP的来源。另一方面，鬼笔环肽（phalloi...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Alexa Fluor 488 驴抗小鼠 IgG (H+L)	Invitrogen by Thermo Fisher Scientific	A21202	避光保存；RRID: AB_141607
脑立体定位仪	Narishige	SR-50
CellSens Dimension	Olympus	版本 1.1	荧光显微镜软件
共聚焦成像系统	Olympus	FV1200
Fluorogold (FG)	Fluorochrome	52-9400	避光保存
荧光成像系统	Olympus	BX53
冷冻切片机	Thermo	Microm International GmbH
Olympus FV10-ASW 4.2a	Olympus	版本 4.2	共聚焦图像处理软件系统
微型钻孔机	Saeyang Microtech	Marathon-N7
小鼠抗 CGRP 抗体	Abcam	ab81887	RRID: AB_1658411
正常驴血清	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Phalloidin 568	Molecular Probes	A12380	避光保存
Photoshop 和 Illustrator	Adobe	CS6	图像编辑软件
兔抗 Fluorogold 抗体	Abcam	ab153	RRID: AB_90738
Sprague Dawley 大鼠	中国食品药品检定研究院	SCXK (JING) 2014-0013
Superfrost plus 显微镜载玻片	Thermo	#4951PLUS-001	25×75×1 mm