本方案描述了一种在大鼠中保留视神经鞘的视神经横断术。通过向视神经内进行微量注射产生流体静压力，实现完全横断，从而无需缝合即可重新对合横断的视神经断端，并在横断模型中直接靶向轴突区室。
本文内容
摘要
摘要
视网膜神经节细胞（RGC）的轴突在视神经乳头处汇聚，将视觉信息从视网膜传递至大脑。青光眼、外伤和缺血性视神经病变等病理状况会损伤RGC轴突，破坏视觉刺激的传导，导致视力丧失。模拟RGC轴突损伤的动物模型包括视神经挤压和横断模型。每种模型都有其固有的优缺点。视神经挤压损伤通常比横断损伤轻微，可用于检测轴突在损伤部位的再生能力。然而，挤压力度和持续时间的差异可能影响组织反应，导致可重复性和损伤完全性存在变异。视神经横断则造成严重且可重复的损伤，可完全破坏所有轴突。但横断视神经会因破坏视神经鞘而显著改变血脑屏障，使视神经暴露于外周环境。此外，在不重新对接切断的神经末端的情况下，无法评估轴突在横断部位之外的再生情况。再者，挤压或横断损伤会激活不同的退行性变化和细胞通路。
本文所述方法结合了视神经 crush 和横断模型的优点，同时克服了各自的缺点。通过显微注射将流体静压施加于视神经，可实现视神经的完全横断，同时保持视神经鞘的完整性。横断后的视神经断端可重新对合，便于进行轴突再生检测。该方法的一个潜在局限性在于无法直接观察到完全横断的情况，这可能带来一定的变异性。然而，若能通过肉眼确认视神经可见部分已被横断，则提示视神经已实现完全横断，成功率可达90–95%。该方法可用于在横断模型中评估促进轴突再生的策略，或研究针对轴突区室的干预措施。
引言
在创伤或神经退行性疾病（如青光眼）后，视网膜神经节细胞（RGCs）会发生轴突损伤和变性1,2。RGCs的丢失以及离心性视网膜投射的中断会导致永久性视力丧失3。为了理解导致变性过程的分子通路，并开发减轻轴突和RGC丢失或促进RGC轴突再生的策略，研究人员已采用实验动物模型来模拟视神经损伤，包括视神经 crush 模型和视神经横断模型。在选择实验模型时，必须考虑每种方法的优缺点以及损伤所激活的分子通路4。
建立本方法的原理在于充分利用视神经 crush5 和横断6 模型的优势，同时克服其局限性。本方法的目标是建立一种可重复的视神经损伤模型，其中所有轴突均被明确且完全地横断，尽量减少与外周免疫系统的接触，并使视神经的横断端易于重新对接，以便评估视网膜神经节细胞（RGC）的再生能力。此外，该方法的设计还允许对受损 RGC 的轴突部分进行分隔化操作，并可在眶后视神经局部递送针对轴突的干预措施（例如神经营养因子、细胞移植）。
与替代方法相比，该技术具有多种优势。相较于视神经 crush 损伤，本方法可完全且可靠地横断视神经，从而解决了可能存在的轴突保留问题7。此外，本方法所造成的轴突损伤程度严重，且不依赖于操作者施加的力的大小和持续时间（如 crush 损伤中那样），从而减少了实验变异性8。与已建立的视神经横断方法相比，本方案所述方法保持了视神经鞘的完整性。保留视神经鞘的优点在于可防止视神经暴露于外周免疫系统。此外，视神经鞘对横断后的视神经施加的机械力可使切断的神经断端自然贴合，无需复杂的显微外科操作9,10,11。最后，在视神经鞘保持完整的情况下，该方法可在视神经残端之间形成一个物理空间，便于将干细胞、神经营养因子或聚合物直接递送至受损的视网膜神经节细胞轴突。
视神经 crush 模型是评估视神经再生策略以确定治疗效果的金标准模型。啮齿类动物视神经的尺寸限制了可能的操作，尤其是视神经的完全横断和再适应。然而，在脊髓损伤与再生领域，学界普遍认为完全横断是区分轴突再生与残留轴突的最理想模型12。本文所述方法降低了在视神经横断模型中评估再生策略的技术难度。因此，该模型可用于通过视神经横断实验验证在视神经 crush 范式中发现的有前景的治疗策略。此外，由于该模型直接作用于轴突区室，因而能够研究针对受损成年 RGC 轴突的干预措施，以及介导轴突退变和再生过程的相关机制。
本研究中描述的视神经横断模型在保留视神经鞘的同时完全横断视神经。这一新颖的方法适用于旨在评估轴突再生的横断模型实验，而无需进行技术上较具挑战性的视神经断端重新对接操作。该技术的部分操作与视神经挤压类似，因此有视神经挤压操作经验的研究人员也可完成该手术。该手术入路无需特殊设计的器械，仅使用常规可获取的外科器械和微注射系统即可完成，具有良好的可及性和经济性。
方案
涉及动物的实验程序已获得退伍军人事务圣地亚哥医疗系统机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。手术器械和溶液在手术前均经过灭菌处理，以减少术后感染和并发症。
1. 手术技术
- 使用无菌技术进行实验，并遵循各机构特定的动物使用规程。
- 对接触活体组织的器械和材料进行灭菌，以防止感染，避免对动物福利造成不利影响，并尽量减少对研究结果的潜在负面影响。使用水和洗涤剂或酶类产品彻底清洁手术器械，以去除异物，并通过蒸汽或快速灭菌法进行灭菌。
- 在组织培养超净台中将液体分装至无菌容器中。通过用70%乙醇冲洗并用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤的方式对微升注射器进行灭菌。
2. 麻醉
- 使用异氟烷麻醉机系统对大鼠进行麻醉。通过麻醉机将异氟烷以4.5%的浓度、1 L/min的流速，用医用级氧气通入连接的麻醉箱中。将动物放入麻醉箱，直至其呼吸减慢并进入镇静状态。
注意：如果操作者已熟练掌握对未镇静动物注射麻醉药物的技术，则可省略此使用气体麻醉的初始步骤。 - 用30 G结核菌素注射器抽取足够体积的麻醉混合液，其成分为氯胺酮（50 mg/kg）、赛拉嗪（2.6 mg/kg）和乙酰丙嗪（0.5 mg/kg）。将已镇静的动物从麻醉箱中取出，经腹腔注射给予麻醉剂，以在整个实验过程中维持稳定的麻醉深度，随后将动物放回笼中。
- 当脚趾夹捏刺激不再引起反应时，开始手术操作。在手术过程中每5分钟评估动物的呼吸深度与频率，并通过脚趾夹捏测试确认无痛觉反应。
- 手术完成后，将动物从立体定位仪上取下。皮下注射生理盐水（3 mL）、氨苄青霉素（0.15–0.2 mg/kg）和氟尼辛（banamine，2.5–5 mg/kg），以提供镇痛和液体支持。将动物转移至加热的孵育箱中，以维持其体温。
3. 手术入路
- 将大鼠（7–8 周龄，Fischer 344 品系）置于立体定位仪框架中，并放置在加热垫上。调整立体定位仪框架，使大鼠头部朝向术者的左侧，并将左眼眶居中于手术视野中。
- 向左眼滴加一滴丙美卡因，并用 5% 聚维酮碘清洁眼睑及眼球表面。在双眼角膜上涂抹眼用软膏，以维持角膜湿润并预防白内障形成。
- 使用 4–0 聚乳酸羟基乙酸共聚物缝线穿过上眼睑表皮至睑缘中央部位，该缝线用于后续步骤中的临时睑缝合。利用此缝线翻转眼睑，暴露上方穹窿部。
- 将聚乳酸羟基乙酸共聚物缝线固定于立体定位仪框架上，以提供持续牵拉并充分暴露术区。避免过度牵拉，以免限制眶后内容物的暴露。
- 使用 Colibri 镊子抬起上方结膜，并用 Vannas 剪刀沿角膜缘剪开结膜。在上方角膜缘处做 4 点钟方向的结膜切开术（peritomy）。
- 通过在上方角膜缘处放置一带环的聚丙烯缝线（线头位于眼球下方），对眼球施加轻度向下牵拉。结膜切开术后残留在上方角膜缘的组织足以提供牵拉力，无需将缝线穿过巩膜或角膜缘。
- 用动脉夹固定缝线两端，并使夹子自由悬垂于空中。夹子的重量将对眼球施加向下的牵拉力，从而更充分地暴露眶后间隙。
- 沿巩膜使用 Vannas 剪刀钝性分离，路径沿眼球后部并位于上直肌下方。用 Vannas 剪刀切断上直肌肌腱，离断上直肌与眼球的连接，以进入眶后间隙。
4. 暴露视神经
- 使用Dumont #5/45镊子沿眼球后部颞侧进行钝性分离，辨认出上方外侧涡静脉。在上方外侧涡静脉的鼻侧进一步钝性分离，以暴露视神经周围的眶肌锥，避免过早损伤视神经。注意避免损伤涡静脉，以免引起明显出血。若发生出血，可用棉签轻压止血，直至出血停止。
- 使用Dumont #5/45镊子，小心将镊尖插入眶肌锥的颞侧部分，并沿肌纤维走行方向张开镊子，以显露视神经。用镊子将覆盖在视神经上方的肌纤维向侧方移开，充分暴露视神经。确保仅有视神经鞘膜覆盖视神经，残留的肌纤维会阻碍拉制的玻璃毛细管针顺利刺入视神经。
- 将两把Dumont #5/45镊子分别置于视神经两侧外缘并张开，以维持视神经的暴露状态。暴露范围应足以在眼球后方1.5–2.0 mm处实施视神经压榨损伤，并允许从背侧将拉制的玻璃毛细管针插入视神经内。
5. 在视神经鞘内横断视神经
- 使用Dumont #5/45镊子，将镊尖置于视神经两侧，位置至少在眼球后方1.5–2.0 mm处。确保镊尖跨度覆盖视神经的整个直径。完全闭合镊子持续5秒，以压榨视神经，并记录压榨部位的位置。
- 使用微量注射器，将1–2 µL PBS吸入玻璃拉制毛细移液管中，并将该移液管安装至移液管固定器上。将移液管固定器安装到显微操作仪上，并将显微操作仪固定于立体定位架上。
- 调节显微注射系统，使每次按下按钮时释放一个持续时间为4 ms、压力为20 psi的单次脉冲。将移液管置于手术视野中。
- 在手术显微镜下，使用一对#55镊子将移液管尖端折断并修整成斜面，使其直径约为20–30 µm，既能输送小体积液体，又具备足够的刚性以穿透视神经鞘。通过施加一次脉冲并观察移液管尖端是否有液体流出，确认移液管通畅。
- 精细调节移液管尖端位置，使其位于视神经中心、视神经压榨部位正上方，并与视神经鞘接触。记录此时显微操作仪上移液管的垂直位置，以便后续确定200 µm的注射深度。
- 在手术显微镜下观察移液管尖端的同时，缓慢下移移液管，直至其进入视神经。若移液管尖端发生弯曲且刚性不足无法穿透视神经鞘，则回撤移液管，并使用一对#55镊子缩短尖端长度并增大其直径。完成尖端调整后，重新尝试用移液管穿透视神经鞘。
- 当移液管尖端进入视神经后，必要时可回撤移液管。此时移液管尖端的位置应根据立体定位显微操作仪的读数，位于步骤5.5中记录的初始位置下方200 µm处。
- 在手术显微镜下观察视神经的同时，使用显微注射系统施加静水压脉冲。随着脉冲的施加，应观察到视神经远端与近端之间出现线性分离，以确认视神经已被完全切断。
注：通常注入250–500 nL的液体体积已足以提供切断视神经所需的力。若注射量超过1 µL，可能提示需要重新定位注射位点。向完整实质内注入较大体积液体并不会进一步加重RGC损伤，因为该方法已完全切断视神经，但液体更可能沿视神经束走行。即使注入足够液体体积后仍未观察到视神经的线性切断，很可能表明移液管在压榨部位定位不准，需重新调整位置。此时也可考虑将注射压力增加50%。
6. 关闭与恢复
- 回撤移液管，并取下回缩的Dumont #5/45镊子。通过移除眼球上的动脉夹和环状聚丙烯缝线，使眼球恢复至中立位置。
- 将结膜复位于角膜缘处，确保释放任何已内翻的结膜组织，以实现组织的正确对合和愈合。在眼部涂抹眼科局部抗生素软膏。
- 从眼睑上的4-0聚乙醇酸缝线上取下胶带，保留该缝线用于临时睑缘缝合。将缝线穿过下眼睑睑缘，经皮下区域向下穿出表皮。打结时施加适当张力，以刚好闭合眼睑为宜。
- 根据机构的术后镇痛方案及动物护理管理机构的指导原则给予镇痛药物。将动物单独饲养于加热笼中以利于术后恢复。恢复笼内不得放置垫料，以防发生意外吸入。
结果
视神经横断通常导致损伤后14天内约80–90%的受损视网膜神经节细胞（RGCs）发生凋亡性丢失。本方法所述技术在保持视神经鞘完整性的前提下进行视神经横断（图1）。RGC的丢失程度与传统的视神经横断及视神经 crush 模型相当，其优势在于采用本方法可轻松地将横断后的视神经断端紧密贴合（图2）。以这种方式重新连接横断的视神经断端，可在横断模型中为评估RGC轴突再生提供一个轴突可生长的基质，且无需显微外科操作来重新连接神经断端（图3）。使用霍乱毒素B亚单位（CTB）对RGC轴突进行顺行示踪显示，在保留鞘膜的视神经横断术后，CTB阳性轴突被完全横断（图4）。在横断视神经的同时保留其鞘膜，还可形成一个封闭空间，便于将研究性物质（如神经营养因子或细胞）递送至受损的RGC轴突并维持其位置（图5）。在初期训练阶段，完全横断的成功率预计为60–70%；随着操作经验的积累，完全横断的成功率可达约90–95%。
图1：在保留视神经鞘的同时横断视神经。（A）手术区域示意图，显示横断前完整暴露的视神经。（B）视神经横断后的图像。一根精细的玻璃微量移液管刺穿横断部位的视神经鞘，并将细胞悬液（浑浊溶液）注入视神经断端之间的空隙。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：视神经鞘保留式视神经切断术后视网膜神经节细胞的丢失。 分别来自具有（A）完整视神经、（B）保留视神经鞘的视神经切断术、（C）传统视神经切断术或（D）14天前实施视神经 crush 损伤的眼睛的代表性全视网膜铺片，经γ-突触核蛋白（SNCG）免疫标记。图像使用10倍物镜在荧光显微镜下获取，经阴影校正后拼接生成单幅图像。在受损眼中，整个视网膜中视网膜神经节细胞（RGC）胞体的丢失明显可见。插图显示视网膜的高倍放大图像，表明视神经损伤后RGC显著丢失。（E）RGC存活率的定量分析显示，与对照组完整视神经相比，视神经损伤后RGC丢失显著。*p< 0.05，与完整视神经组比较；采用单因素方差分析及事后Tukey检验。每组n = 3只动物；误差线表示标准差。SP-ONT，保留鞘膜的视神经切断术；ONT，视神经切断术；ONC，视神经压榨损伤。比例尺 = 1,000 µm。插图中的比例尺 = 100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：视神经损伤后视神经的切片。 显示在视神经损伤后14天的视神经纵切面代表性图像，分别为（A-C）保留视神经鞘膜的横断损伤，（D-F）传统的视神经横断损伤，或（G-I）视神经挤压损伤。（A,D,G）胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫标记显示损伤范围，而（B,E,H）使用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）进行DNA标记，显示视神经全长及损伤部位的连续细胞分布。（C,F,I）合并图像，显示GFAP阳性神经组织及细胞在损伤部位的定位。比例尺 = 200 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：视神经鞘保留性视神经切断术后视神经横断面。在视神经鞘保留性横断术后 14 天，通过玻璃体内注射霍乱毒素 B 亚单位（CTB）进行顺行轴突示踪，获得视神经纵切面的代表性图像。(A) 可观察到从眼球（左侧）向脑部（右侧）延伸的 CTB 标记的视网膜神经节细胞（RGC）轴突完全中断。(B) 胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫标记显示损伤范围广泛，累及整个视神经直径。(C) 使用 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）进行 DNA 标记，显示损伤部位存在细胞浸润。(D) 合并图像，展示 CTB 标记的轴突、GFAP 阳性神经组织以及损伤部位细胞分布的定位情况。比例尺 = 200 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 5：接受细胞移植的横断视神经的纵切面。在保留视神经鞘的视神经横断并移植表达荧光蛋白 tdTomato 的神经干细胞（NSCs）后 14 天，视神经纵切面的代表性图像。(A) 胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫标记显示横断视神经的两端完全分离。(B) 表达 tdTomato 的 NSCs 被限制在所述技术所形成的空腔内，并在移植后持续存活。(C) 移植的 NSCs 直接紧贴横断视神经的两个断端。比例尺，200 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
描述视神经横断模型的手术操作此前已有发表6。然而，这些方案中详述的技术需要切开脑膜鞘以横断视神经。此外，在以往的横断模型中，为评估视网膜神经节细胞（RGC）轴突再生，需进行技术难度较高的显微外科操作，将切断的视神经断端或外周神经移植物与视神经近端残端对接10,13。本文所述方案在横断视神经的同时最大程度减少了对视神经鞘的损伤，并可在无需复杂显微外科操作的情况下，实现对横断模型中RGC轴突再生的评估。
本方案中有多个步骤至关重要。操作时应避免损伤眼动脉及供应视盘的血管系统。因此，第5.1步的操作位置应至少位于眼球后方1.5–2.0 mm处。若不慎损伤眼动脉并导致视网膜血供中断，则该眼球应排除在后续实验之外，因其很可能继发眼球萎缩。在执行第5.4–5.6步时，需保持视神经鞘的完整性，并尽量缩小玻璃移液管进入视神经时所形成的开口。这样做可在移液管尖端周围形成紧密密封，以减少液体反流，并有助于产生足够的静水压以切断视神经。将玻璃移液管尖端磨成斜面，可使其更顺利地进入视神经，同时避免造成附带损伤。
操作者可进行一些潜在的改进以提高该方法的可及性。所述操作步骤涉及最小程度的解剖及眶内组织的清除，同时保留面神经和三叉神经。虽然这种方法可降低并发症及出血风险，但眶脂肪等组织和泪腺可能限制对关键结构的视野。为改善视野，可能需要仔细清除阻碍手术区域的组织，尤其是在老年动物中。也可采用外侧入路以更好地接触视神经。然而，外侧解剖存在损伤其他结构（包括三叉神经）的风险，操作更为复杂，且在注射时对器械方向的控制可能带来额外挑战。
该方法的一个可能局限性是无法直接操作视神经并完全观察整个横断过程，因此存在横断不完全的可能性。然而，我们观察到，在步骤5.8中视神经断端分离的视觉确认是横断成功且完全可靠的指标。如果神经断端未能分离，可重新调整注射移液管的位置，或将注射压力增加50%，即可提供足够的力量实现神经的完全横断。
与现有方法相比，该方法能够保持视神经鞘的完整性。通过维持视神经鞘的完整性，横断后的视神经断端不会暴露于眶内环境及外周免疫系统，从而限制了可能影响视网膜神经节细胞（RGC）反应的免疫因子的接触。此外，在横断视神经的同时保留视神经鞘的完整性，可在视神经断端与视神经鞘之间形成一个封闭的物理空间。通过将神经营养因子、细胞或聚合物注射至这一新形成的空间，可实现对损伤RGC轴突区室的局部递送14。 Alternatively, RGC axon regeneration can be evaluated in a transection model by allowing the transected optic nerve ends to anastomose without the need for challenging microsurgical techniques.
该方法的应用包括利用轴突特异性干预手段评估受损的视网膜神经节细胞（RGC）轴突区室，以鉴定导致轴突变性的通路，并防止横断损伤后轴突的丢失。此外，该方法通过免除技术难度较高的视神经吻合操作，使更广泛的研究群体能够开展在横断模型中对RGC轴突再生的研究。旨在促进RGC轴突再生的干预措施可通过这一严重的损伤模型进行评估，并获得一致且可重复的结果，而无需担心残留轴突的干扰。
披露
作者声明无任何竞争性或利益冲突需要披露。
致谢
本研究工作部分得到了国家眼科研究所 K12 职业发展资助（5K12EY024225-04）、P30 核心资助（P30EY022589，国家眼科研究所）、美国青光眼学会“促进医师科学家发展”导师奖，以及防盲研究基金会（纽约，纽约州）提供的无限制资助的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4-0 聚乳酸羟基乙酸缝合线 | Ethicon | J315H | |
| 9-0 聚丙烯缝合线 | Ethicon | 1754G | |
| 乙酰丙嗪 | Butler | 003845 | 0.5–4 mg/kg 储存浓度：10 mg/mL 最终浓度：0.25 mg/mL |
| 氨苄西林 | Sandoz | 0781-3404-85 | 80–100 mg/kg 最终浓度：50 mg/mL |
| 麻醉系统 | VetEquip | 901806 | |
| 动物培养箱 | Precision Incubators | Chick Chalet II | |
| 氟尼辛葡甲胺 | Schering-Plough | 0061-0851-03 | 2.5–5 mg/kg 储存浓度：50 mg/mL 最终浓度：0.5 mg/mL |
| 硼硅酸盐玻璃毛细管 | World Precision Instruments | 1B150F-4 | |
| Colibri 镊子 | Katena | K5-1500 | |
| Dumont #5/45 镊子 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| 热疗泵 | Kent Scientific | HTP-1500 | |
| 异氟烷 | Covetrus | 29404 | |
| 约翰斯·霍普金斯 Bulldog 夹 | Roboz | RS-7440 | |
| 氯胺酮 | Putney | 26637-411-01 | 40–80 mg/kg 储存浓度：100 mg/mL 最终浓度：25 mg/mL |
| 微量注射系统（Picospritzer II） | General Valve, Inc | ||
| 5 µL 微量注射器 | Hamilton | 88000 | |
| 微电极拉制仪 | Sutter Instrument Co. | Model P-77 Brown-Flaming | |
| 新霉素/硫酸多粘菌素B/杆菌肽锌眼膏 | Bausch + Lomb | ||
| PBS | Millipore | BSS-1005-B | |
| 聚维酮碘 | Healthpets | BET16OZ | |
| 0.5% 盐酸丙帕他卡因 | Bausch + Lomb | ||
| 林格氏液 | Abbott | 04860-04-10 | 2–3 mL/次注射 |
| 立体定位仪 | Kopf | ||
| 手术显微镜 | Zeiss | ||
| Vannas 剪刀 | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| 赛拉嗪 | Lloyd | 0410 | 2.5–8 mg/kg 储存浓度：100 mg/mL 最终浓度：5.8 mg/mL |
参考文献
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