本文介绍了一种用于细菌性眼内炎小鼠模型的玻璃体内注射方法及后续细菌定量技术。该方案可进一步扩展用于检测宿主免疫反应以及细菌和宿主基因的表达。
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方法文章
小鼠细菌性眼内炎模型中的玻璃体内注射及感染参数定量分析
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
眼内细菌感染对视力具有严重威胁。研究人员利用动物模型研究与感染相关的宿主和细菌因子以及免疫应答通路，以确定可行的治疗靶点，并测试预防失明的药物。玻璃体内注射技术用于将病原体、药物或其他物质直接注入眼球后段的玻璃体腔内。本文中，我们演示了该注射技术在小鼠眼部诱导感染的方法，以及定量检测眼内细菌的技术。Bacillus cereus 在脑心浸液液体培养基中培养18小时后，重悬至浓度为100菌落形成单位（CFU）/0.5 µL。使用氯胺酮和赛拉嗪混合物对C57BL/6J小鼠进行麻醉。利用皮升级微注射仪和玻璃毛细管针头，将0.5 µL的Bacillus菌悬液注入小鼠眼球的玻璃体中部。对侧对照眼则注射无菌培养基（手术对照）或不进行注射（绝对对照）。感染后10小时，处死小鼠，使用无菌手术镊摘取眼球，放入含有400 µL无菌PBS和1 mm无菌玻璃珠的离心管中。如需进行ELISA或髓过氧化物酶检测，则在管中加入蛋白酶抑制剂；如需提取RNA，则加入相应的裂解缓冲液。眼球组织在组织匀浆机中匀浆1–2分钟。将匀浆液用PBS进行10倍系列稀释，并涂布于琼脂平板上。剩余匀浆液储存于-80 °C，用于其他检测。平板在37 °C孵育24小时后，定量每只眼球的菌落形成单位（CFU）。这些技术可在小鼠眼中建立可重复的感染模型，并有助于定量活菌数量、宿主免疫应答以及宿主与细菌基因表达的组学分析。
引言
细菌性眼内炎是一种破坏性感染，可引起眼部炎症，若未得到妥善治疗，可能导致视力丧失甚至失明。眼内炎是由于细菌进入眼内所致1,2,3,4,5。一旦进入眼内，细菌会进行复制，产生毒素及其他有害因子，从而对精细的视网膜细胞和组织造成不可逆的损伤。此外，由于炎症通路被激活，导致炎性细胞浸润至眼内，由此引发的炎症反应也可造成眼部损伤1,5,6。眼内炎可继发于眼内手术（术后）、眼球穿透性损伤（外伤后），或由身体其他解剖部位的细菌经血行播散至眼部引起（内源性）7,8,9,10。细菌性眼内炎的治疗包括使用抗生素、抗炎药物或外科干预3....
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方案
所有操作均遵循《实验动物护理和使用指南》以及视觉与眼科研究协会关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明中的建议。相关方案已获俄克拉荷马大学健康科学中心机构动物护理和使用委员会批准（方案编号：15-103、18-043 和 18-087）。
1. 无菌玻璃针
- 转动 开启 针状移液器拉制仪
- 调节 加热器 旋钮直至显示屏显示12.6。
- 打开门，手动将5 μL毛细管穿过上部夹具和加热丝，直至一半管段延伸至加热丝下方（图1A).
- 确认毛细管位于上部夹具的“V”形槽内。拧紧上部夹具。
- 下夹具打开时，手动向上调节垂直滑块，直至下夹具到达其上限位置。确认试管位于下夹具的“V”型槽内。拧紧下夹具。
- 关闭门并确认“Ready”指示灯已亮起。按下 开始 启动加热器和拉制程序的按钮（图1B).
- 确保加热器在加热完成后自动关闭，且重力将毛细管拉开（图1C），载玻片向下移动。
- 打开门。在握住毛细管顶端的同时，松开顶部夹具。取下上部的毛细管并放置一旁。
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结果
制备可重复的接种物以及准确执行玻璃体内注射操作，是建立微生物性眼内炎模型的关键步骤。本文中，我们以革兰氏阳性菌Bacillus cereus为例，演示了玻璃体内注射的操作过程。我们将100 CFU/0.5 μL的B. cereus注射至五只C57BL6小鼠眼球的玻璃体中部。感染后10小时，观察到每只眼内B. cereus增殖至约1.8 × 105 CFU/眼。图1展示了用于将细菌注入小鼠眼球玻璃体中部的玻璃毛细针的制备方法。Bacillus cereus在血琼脂平板及培养管中的生长情况见图2。图3展示了使用气压驱动注射系统进行小鼠玻璃体内注射的操作过程。图4演示了在感染后预定时间点采集感染眼球的步骤。图5展示了对感染眼球进行匀浆处理的技术。
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讨论
尽管已有强效抗生素、抗炎药物和玻璃体切除手术，细菌性眼内炎仍可能导致患者失明。临床研究在眼内炎的探索中具有一定价值；然而，眼内炎的实验模型能够提供快速且可重复的结果，这些结果可转化为临床诊疗标准的进步，从而改善患者的视力预后。
小鼠眼球的玻璃体容积约为 7 µL40。如此小的容积仅能允许注射有限量的物质。为避免眼部损伤，注射体积不应超过 1.0 µL。该操作需要特定设备，并需熟练掌握相关技术以确保可重复性和准确性。内源性眼内炎已在灵长类动物、猪、兔、大鼠、豚鼠和小鼠中进行研究28,41,42,43,44,45。在体型较大的物种中，其眼球大小更接.......
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披露
作者没有需要披露的财务利益冲突。
致谢
作者感谢冯·李博士（Dr. Feng Li）和马克·迪特马尔（Mark Dittmar）（美国俄克拉荷马城俄克拉荷马大学健康科学中心P30活体动物成像中心，迪恩·A·麦吉眼科研究所）提供的协助。本研究获得了美国国立卫生研究院资助项目R01EY028810、R01EY028066、R01EY025947和R01EY024140的支持。本研究还获得了P30EY21725（美国国立眼科研究所核心资助，用于活体动物成像与分析、分子生物学和细胞成像）的支持。此外，本研究还得到了美国国立眼科研究所视觉科学博士前培训项目5T32EY023202、长老会健康基金会研究资助以及防盲研究组织（Research to Prevent Blindness）向迪恩·A·麦吉眼科研究所提供的无限制资助的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-20 µL 移液器 | RANIN | L0696003G | NA |
| 37°C 培养箱 | Fisher Scientific | 11-690-625D | NA |
| 脑心浸出液培养基（Bacto Brain Heart Infusion） | BD | 90003-032 | NA |
| 细胞显微注射仪 | MicroData Instrument, Inc. | PM2000 | NA |
| 细尖镊子 | Thermo Fisher Scientific | 12-000-122 | NA |
| 玻璃珠，1.0 mm | BioSpec | 11079110 | NA |
| 摇床培养箱 | New Brunswick Scientific | NB-I2400 | NA |
| 5 微升微量毛细移液管 | Kimble | 71900-5 | NA |
| 微量移液管斜面打磨仪 | Sutter Instrument Co. | BV-10 | NA |
| 显微镜 Axiostar Plus | Zeiss | NA | |
| 显微镜 OPMI Lumera | Zeiss | NA | |
| Mini-Beadbeater-16 高通量组织研磨器 | BioSpec | Model 607 | NA |
| 多通道移液器，30-300 µL | Biohit | 15626090 | NA |
| 多通道移液器，5-100 µL | Biohit | 9143724 | NA |
| 拉针仪/移液管拉制仪 | Kopf | 730 | NA |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | GIBCO | 1897315 | 分子生物学级 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 4693159001 | 分子生物学级 |
| 反向操作镊子 | Katena | K5-8228 | NA |
参考文献
- Ramadan, R. T., Ramirez, R., Novosad, B. D., Callegan, M. C. Acute inflammation and loss of retinal architecture and function during experimental Bacillus endophthalmitis. Current Eye Research. 31 (11), 955-965 (2006).
- Callegan, M. C., Booth, M. C., Jett, B. D., Gilmore, M. S.
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重印与许可
