小鼠细菌性眼内炎模型中的玻璃体内注射及感染参数定量分析

摘要

本文介绍了一种用于细菌性眼内炎小鼠模型的玻璃体内注射方法及后续细菌定量技术。该方案可进一步扩展用于检测宿主免疫反应以及细菌和宿主基因的表达。

摘要

眼内细菌感染对视力具有严重威胁。研究人员利用动物模型研究与感染相关的宿主和细菌因子以及免疫应答通路，以确定可行的治疗靶点，并测试预防失明的药物。玻璃体内注射技术用于将病原体、药物或其他物质直接注入眼球后段的玻璃体腔内。本文中，我们演示了该注射技术在小鼠眼部诱导感染的方法，以及定量检测眼内细菌的技术。Bacillus cereus 在脑心浸液液体培养基中培养18小时后，重悬至浓度为100菌落形成单位（CFU）/0.5 µL。使用氯胺酮和赛拉嗪混合物对C57BL/6J小鼠进行麻醉。利用皮升级微注射仪和玻璃毛细管针头，将0.5 µL的Bacillus菌悬液注入小鼠眼球的玻璃体中部。对侧对照眼则注射无菌培养基（手术对照）或不进行注射（绝对对照）。感染后10小时，处死小鼠，使用无菌手术镊摘取眼球，放入含有400 µL无菌PBS和1 mm无菌玻璃珠的离心管中。如需进行ELISA或髓过氧化物酶检测，则在管中加入蛋白酶抑制剂；如需提取RNA，则加入相应的裂解缓冲液。眼球组织在组织匀浆机中匀浆1–2分钟。将匀浆液用PBS进行10倍系列稀释，并涂布于琼脂平板上。剩余匀浆液储存于-80 °C，用于其他检测。平板在37 °C孵育24小时后，定量每只眼球的菌落形成单位（CFU）。这些技术可在小鼠眼中建立可重复的感染模型，并有助于定量活菌数量、宿主免疫应答以及宿主与细菌基因表达的组学分析。

引言

细菌性眼内炎是一种破坏性感染，可引起眼部炎症，若未得到妥善治疗，可能导致视力丧失甚至失明。眼内炎是由于细菌进入眼内所致^1,2,3,4,5。一旦进入眼内，细菌会进行复制，产生毒素及其他有害因子，从而对精细的视网膜细胞和组织造成不可逆的损伤。此外，由于炎症通路被激活，导致炎性细胞浸润至眼内，由此引发的炎症反应也可造成眼部损伤^1,5,6。眼内炎可继发于眼内手术（术后）、眼球穿透性损伤（外伤后），或由身体其他解剖部位的细菌经血行播散至眼部引起（内源性）^7,8,9,10。细菌性眼内炎的治疗包括使用抗生素、抗炎药物或外科干预^3,4,11。即使接受上述治疗，仍可能丧失视力或眼球。细菌性眼内炎后的视力预后通常取决于治疗效果、就诊时的视力水平以及致病菌的毒力。

Bacillus cereus（B. cereus）是导致创伤后内源性眼内炎的主要细菌病原体之一^7,12。大多数B. cereus引起的眼内炎病程进展迅速，可在数天内导致失明。B. cereus眼内炎的典型特征包括快速发展的玻璃体炎症、眼痛、视力迅速下降以及发热。B. cereus在眼内的生长速度较其他常见致眼感染细菌更快^2,4,12，并具有多种毒力因子。因此，有效治疗干预的时间窗相对较短^{1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25}。针对该感染的常规治疗方法对其他毒力较弱的病原体所致眼内炎通常有效，但B. cereus引起的眼内炎常导致超过70%的患者出现显著视力丧失。约50%的患者需接受感染眼的眼球内容物剜除术或眼球摘除术^7,16,22,23。B. cereus眼内炎的破坏性和快速进展特性要求立即采取正确治疗。近年来在阐明疾病发生机制方面的进展已识别出潜在的干预靶点^19,26,27。实验性小鼠B. cereus眼内炎模型在揭示感染机制及测试可能预防视力丧失的潜在治疗手段方面仍具有重要价值。

小鼠眼内感染 B. cereus 的实验模型在研究细菌与宿主因素及其在眼内炎过程中的相互作用方面发挥了重要作用²⁸。该模型模拟了创伤后或术后事件，即在眼部受伤时细菌被引入眼内。该模型具有高度可重复性，已被广泛用于测试实验性疗法，并为改进临床诊疗标准提供数据支持^1,6,19,29,30。与许多其他感染模型类似，该模型允许独立控制多种感染参数，从而高效且可重复地评估感染结果。过去几十年中，在兔类相似模型中开展的研究已探讨了 B. cereus 毒力因子在眼部的作用^2,4,13,14,31。通过注射缺失单个或多个毒力因子的 B. cereus 突变菌株，可通过感染后不同时间点的眼内细菌浓度或视觉功能丧失等指标，量化这些毒力因子对疾病严重程度的贡献^{13,14,27,31,32}。此外，通过感染缺失特定炎症相关宿主因子的基因敲除小鼠品系，该模型也可用于研究宿主因素的作用^{26,29,33,34,35}。该模型还可用于评估潜在治疗方法，例如在感染后向眼内注射新型化合物^30,36。在本论文中，我们描述了一项详细的操作流程，包括对小鼠眼部进行 B. cereus 感染、感染后取材、定量检测眼内细菌载量，以及保存样本以进一步评估疾病严重程度的其他参数。

方案

所有操作均遵循《实验动物护理和使用指南》以及视觉与眼科研究协会关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明中的建议。相关方案已获俄克拉荷马大学健康科学中心机构动物护理和使用委员会批准（方案编号：15-103、18-043 和 18-087）。

1. 无菌玻璃针

1. 转动 开启 针状移液器拉制仪
2. 调节 加热器 旋钮直至显示屏显示12.6。
3. 打开门，手动将5 μL毛细管穿过上部夹具和加热丝，直至一半管段延伸至加热丝下方（图1A).
4. 确认毛细管位于上部夹具的“V”形槽内。拧紧上部夹具。
5. 下夹具打开时，手动向上调节垂直滑块，直至下夹具到达其上限位置。确认试管位于下夹具的“V”型槽内。拧紧下夹具。
6. 关闭门并确认“Ready”指示灯已亮起。按下 开始 启动加热器和拉制程序的按钮（图1B).
7. 确保加热器在加热完成后自动关闭，且重力将毛细管拉开（图1C），载玻片向下移动。
8. 打开门。在握住毛细管顶端的同时，松开顶部夹具。取下上部的毛细管并放置一旁。
9. 将毛细管固定在底片上，松开下部夹具。取下下部的毛细管并放置一旁。
10. 使用微电极斜面研磨仪和粒径为0.05 μm的氧化铝研磨板对拉制好的毛细管进行斜面打磨，以制备注射针。
11. 用移液器吸取足量水滴加到研磨板上，以覆盖其表面（图1D).
12. 转动 开启 将修边器调至以60 rpm的转速开始旋转。将拉制好的毛细管插入移液管夹具的“V”形槽中。拧紧夹具，并将移液管夹具的角度调整至30°。
13. 将毛细管尖端调整至距研磨板旋转中心约三分之二距离的位置。
14. 通过调节操纵器顶部的粗调控制旋钮，降低夹紧的毛细管。继续降低毛细管，直至其尖端伸入水面以下，并接触到研磨板的磨削表面。
15. 使用修针仪上连接的显微镜监测拉针的磨削进程。5分钟后，调节微调控制装置，将玻璃针从磨针板上抬起。
16. 移除玻璃针，将其置于10倍放大镜下检查毛细管尖端图1E，F).
17. 为确保无堵塞，将玻璃针插入连接注射器的移液器 holder 中，并向含有 1 mL 99% 乙醇的离心管中推入空气。若针尖处形成气泡，则表明玻璃针无堵塞，可用于显微注射。此步骤还可确保玻璃针的无菌性。
18. 一根毛细管最多可容纳 5 μL 液体。将毛细管分为 10 个等分段，以计算针头上每 0.5 μL 体积对应的刻度间距。标记出容纳 0.5 μL 液体的距离刻度，供后续使用。对于 5 μL 的针头，间距为 0.7 mm 时相当于 0.5 μL（图1G).

2. Bacillus cereus 培养

1. 本节所有操作均须在生物安全二级条件下进行。
2. 取蜡样芽孢杆菌（B. cereus）ATCC 14579 冻存菌种，在 5% 羊血琼脂平板上划线以分离单菌落，并于 37 ˚C 培养过夜（图 2A）。
3. 用移液器将 5 mL 无菌脑心浸液（BHI）肉汤加入一支 10 mL 无菌带盖试管中（图 2B）。使用无菌接种环或接种针，从琼脂平板上挑取一单菌落的 B. cereus ATCC 14579，接种至液体 BHI 培养基中。
4. 短暂涡旋混匀样品，将带盖试管放入旋转培养箱中，设置温度为 37 °C、转速为 200 rpm。培养 18 小时后，从培养箱中取出培养物（图 2B）。

3. 玻璃体内注射用细菌稀释

1. 本节所有操作均须在生物安全二级条件下进行。
2. 计算需加入10 mL新鲜BHI培养基中的过夜培养B. cereus菌液体积，以达到每微升200个菌落形成单位（CFU/μL）。例如，B. cereus在BHI培养基中过夜培养后浓度约为2 × 10⁸ CFU/mL，取10 μL过夜培养物加入10 mL新鲜BHI培养基中，即可稀释至200 CFU/μL。
3. 将1 mL新鲜稀释后的菌液移入1.5 mL微量离心管中。将该管置于冰上保存，直至进行玻璃体内注射。在菌液稀释后60分钟内完成玻璃体内注射操作。

4. 小鼠玻璃体内注射

1. 本节所有操作均须在生物安全二级条件下进行。
2. 在手术台上放置医用垫巾以准备操作区域。
3. 转动 开启 打开连接至显微注射仪的压缩空气罐上的气体阀门。调节气罐调压阀，使气体输送压力约为60 psi。
4. 在显微注射仪上按下 模式 直到屏幕显示 平衡. 按压 平衡 将计算机鼠标放置于手术台上。将不锈钢移液器支架连接至与注射器“填充/输出”端口相连的管路。该管路始终与注射器保持连接。
5. 将毛细玻璃针插入移液器 holder 的另一端，通过拧紧移液器 holder 连接头固定针头。
6. 打开眼科显微镜，将光源强度调至50%。调整显微镜至手术台操作区域上方，并调节显微镜至所需焦距。
7. 在开始操作前，通过测试小鼠的足底回缩反射来确认其已充分麻醉。务必遵循经机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的麻醉操作规程。 
8. 将麻醉后的小鼠置于医用垫巾上，使其鼻部朝右，身体向左侧倾斜。
9. 通过眼科显微镜观察小鼠右眼，使用反向持针钳在眼睛两侧轻轻撑开眼睑，以暴露注射部位（图3C).
10. 用鼠标左键点击连接至显微注射仪的触控板，将毛细玻璃针填充200 CFU/μL的菌液稀释液图 3D).
11. 用左手固定动物头部，将针头尖端置于眼睛的角膜缘处。针头斜面朝上，与眼球呈45°角刺入小鼠眼内，注射时确保仅针尖锐利部分（约0.5 mm）插入眼内。
12. 针尖插入后，将左手从鼠头移开，放至鼠标垫上，右键点击鼠标垫以注入 0.5 μL 的液体 B. cereus 稀释。为防止泄漏，在拔出前将针头尖端留在小鼠眼内 2-3 秒图3E)^{1,19,26,27,32,34,36,37,38}.
13. 松开镊子，将小鼠放入置于加热垫上的笼子中。持续观察小鼠，直至其从麻醉状态中恢复图3F).
14. 小鼠从麻醉中恢复后，将鼠笼放回相应的架位。若小鼠需接受视网膜电图检测以分析视网膜功能，应将鼠笼放回暗室，以确保充分的暗适应。

5. 收集管的制备

1. 将1 mm无菌玻璃珠放入1.5 mL螺口管中。
2. 在干燥模式下使用高压灭菌器对这些管子进行灭菌。使用前让管子冷却至室温。
3. 向无菌的15 mL离心管中加入10 mL 1×无菌磷酸盐缓冲液（PBS）。
4. 向管中加入1片蛋白酶抑制剂混合物片剂。通过涡旋混合^{19,27,29,34,35}。
5. 将含有蛋白酶抑制剂的400 μL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）移液至每个已高压灭菌的收获管中。标记管子并置于冰上。（图4A）。

6. 收集眼球

1. 本节所有操作均须在生物安全二级条件下进行。
2. 通过吸入 CO₂ 处死小鼠，并采用第二种方法确认动物已安乐死。
3. 固定安乐死小鼠的头部，将精细镊子张开并置于感染眼的两侧，向下朝向头部方向推动以使眼球突出。当镊子尖端到达眼球后方时，夹紧镊子，然后将镊子向外拉离头部，以摘除眼球（图 4B）。
4. 立即将摘下的眼球放入已标记的收集管中，并将收集管置于冰上，保存时间不得超过 60 分钟（图 4C）。

7. 眼内细菌计数

1. 本节所有操作均须在生物安全二级条件下进行。
2. 确认所有收集管已紧密封闭，并在组织匀浆器中保持平衡（图5A）。开启组织匀浆器匀浆1分钟，暂停30秒后，再次开启1分钟。将管子置于冰上（图5B,C）。
3. 将匀浆液依次进行10倍系列稀释：每次取20 μL匀浆液加入180 μL无菌1x PBS中。连续稀释至稀释倍数达到10^-7（图5D）。
4. 在预热的方形BHI平板上，用适当的稀释倍数标记每一行。将每种稀释液各取10 μL，依次加到倾斜约45°的BHI平板顶部。让样品液沿斜面流下，接近平板底部时，将平板放平（图5E）³⁹。
5. 待样品完全被BHI琼脂吸收后，将平板放入37 °C培养箱中培养。接种后约8小时应开始可见菌落生长。
6. 在B. cereus菌落生长至相互重叠影响单个菌落识别之前，及时将平板从培养箱中取出（图5F）。
7. 为准确反映样品中的菌液浓度，应计数含有10–100个菌落的行。例如，稀释倍数为10^-4的行中若计得45个菌落，则其浓度为4.5 × 10⁵ CFU/mL。
8. 计算每只眼中的细菌总数时，将上述浓度乘以0.4（代表用于匀浆眼球的1x PBS体积，单位为毫升）。例如，4.5 × 10⁵ CFU/mL的浓度相当于每只眼含有1.8 × 10⁵ CFU B. cereus。

8. 样品保存

1. 将匀浆样品放入已标记的冻存盒中，并将该冻存盒置于 -80 °C 超低温冰箱中。这些样品日后可用于通过 ELISA 检测炎症介质。

结果

制备可重复的接种物以及准确执行玻璃体内注射操作，是建立微生物性眼内炎模型的关键步骤。本文中，我们以革兰氏阳性菌Bacillus cereus为例，演示了玻璃体内注射的操作过程。我们将100 CFU/0.5 μL的B. cereus注射至五只C57BL6小鼠眼球的玻璃体中部。感染后10小时，观察到每只眼内B. cereus增殖至约1.8 × 10⁵ CFU/眼。图1展示了用于将细菌注入小鼠眼球玻璃体中部的玻璃毛细针的制备方法。Bacillus cereus在血琼脂平板及培养管中的生长情况见图2。图3展示了使用气压驱动注射系统进行小鼠玻璃体内注射的操作过程。图4演示了在感染后预定时间点采集感染眼球的步骤。图5展示了对感染眼球进行匀浆处理的技术。

讨论

尽管已有强效抗生素、抗炎药物和玻璃体切除手术，细菌性眼内炎仍可能导致患者失明。临床研究在眼内炎的探索中具有一定价值；然而，眼内炎的实验模型能够提供快速且可重复的结果，这些结果可转化为临床诊疗标准的进步，从而改善患者的视力预后。

小鼠眼球的玻璃体容积约为 7 µL⁴⁰。如此小的容积仅能允许注射有限量的物质。为避免眼部损伤，注射体积不应超过 1.0 µL。该操作需要特定设备，并需熟练掌握相关技术以确保可重复性和准确性。内源性眼内炎已在灵长类动物、猪、兔、大鼠、豚鼠和小鼠中进行研究^{28,41,42,43,44,45}。在体型较大的物种中，其眼球大小更接...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-20 µL 移液器	RANIN	L0696003G	NA
37°C 培养箱	Fisher Scientific	11-690-625D	NA
脑心浸出液培养基（Bacto Brain Heart Infusion）	BD	90003-032	NA
细胞显微注射仪	MicroData Instrument, Inc.	PM2000	NA
细尖镊子	Thermo Fisher Scientific	12-000-122	NA
玻璃珠，1.0 mm	BioSpec	11079110	NA
摇床培养箱	New Brunswick Scientific	NB-I2400	NA
5 微升微量毛细移液管	Kimble	71900-5	NA
微量移液管斜面打磨仪	Sutter Instrument Co.	BV-10	NA
显微镜 Axiostar Plus	Zeiss		NA
显微镜 OPMI Lumera	Zeiss		NA
Mini-Beadbeater-16 高通量组织研磨器	BioSpec	Model 607	NA
多通道移液器，30-300 µL	Biohit	15626090	NA
多通道移液器，5-100 µL	Biohit	9143724	NA
拉针仪/移液管拉制仪	Kopf	730	NA
磷酸盐缓冲液（PBS）	GIBCO	1897315	分子生物学级
蛋白酶抑制剂混合物	Roche	4693159001	分子生物学级
反向操作镊子	Katena	K5-8228	NA