细菌性心内膜炎小鼠模型中感染参数的内注射与定量

Summary

在这里，我们描述了一种细菌性心内膜炎小鼠模型中的内注射和随后的细菌定量方法。该协议可以扩展用于测量宿主免疫反应和细菌和宿主基因表达。

Abstract

眼内细菌感染对视力有危险。研究人员使用动物模型来研究宿主和细菌因素以及与感染相关的免疫反应途径，以确定可行的治疗靶点，并测试预防失明的药物。体内注射技术用于将生物体、药物或其他物质直接注射到眼后段的玻璃腔中。在这里，我们演示了这种注射技术，以启动小鼠眼感染和量化眼内细菌的技术。 脑杆菌在脑 心输液介质中生长18小时，并重新灌注至浓度为100个菌落形成单位（CFU）/0.5μL。使用氯胺酮和西拉辛的组合对一只C57BL/6J小鼠进行麻醉。使用皮奥利特微注射器和玻璃毛细管针，将0.5μL 的杆 菌悬浮液注射到小鼠眼的中层。反向对照眼要么注射了无菌介质（手术控制），要么没有注射（绝对控制）。感染后10小时，小鼠被安乐死，用无菌手术钳子采集眼睛，并放入含有400μL无菌PBS和1毫米无菌玻璃珠的管子中。对于ELISAs或性内洛西达酶测定，蛋白质酶抑制剂被添加到管子中。对于RNA提取，添加了适当的解解缓冲液。眼睛在组织均质器中均质1-2分钟。在PBS中，同质酸盐被连续稀释10倍，并跟踪稀释到加糖板上。其余同质物储存在-80°C，用于其他测定。板孵育24小时，每只眼睛的CFU被量化。这些技术导致小鼠眼睛的可重复感染，并促进活体细菌的定量，宿主免疫反应，宿主和细菌基因表达的奥米。

Introduction

细菌性内膜炎是一种导致炎症的破坏性感染，如果治疗不当，可能导致视力丧失或失明。心内膜炎的结果是细菌进入眼睛内部^{1，2，3，4，5。}一旦进入眼睛，细菌复制，产生毒素和其他有害因素，并可能导致不可逆转的损害微妙的视网膜细胞和组织。眼部损伤也可以由炎症引起，由于炎症途径的激活导致炎症细胞流入眼内^1，5，6。内膜炎可能发生在眼内手术（术后），对眼睛的穿透性损伤（创伤后），或从转移传播细菌到眼睛从不同的解剖位点（内源）7，8，9，10。细菌性内膜炎的治疗包括抗生素、抗炎药或外科介入^{3、4、11。}

Protocol

所有程序都是按照《实验室动物护理和使用指南》和《眼科和视觉研究动物使用视觉和眼科声明协会》中的建议进行的。协议得到俄克拉荷马大学健康科学中心机构动物护理和使用委员会的批准（协议号15-103、18-043和18-087）。

1. 无菌玻璃针

1. 打开 指针 移液器拉拔器。
2. 调整加热器 旋 钮，直到显示屏显示 12.6。
3. 打开门，通过上部夹具和加热器灯丝手动馈送 5 μL 毛细管，直到管子的一半延伸到灯丝以下（图 1A）。
4. 确认毛细管位于上夹的"V"槽中。拧紧上部夹具。
5. 打开下部夹具后，手动向上调整垂直滑动，直到下夹达到其上限。确认管子位于下夹的"V"槽中。拧紧下部夹具。
6. 关上门并确认"就绪"指示灯已打开。按下"开始"按钮启动加热器和拉力顺序（图 1B）。
7. 确保加热器在热和重力将毛细管拉开后自动关闭（图 1C），并且滑轨向下移动。
8. 开门。握住毛细管顶部时，请解开顶部夹紧。拆下上毛细管并将其放在一边。
9. 将毛细管放在底部滑轨中，并解....

Results

生成可重复的宫内注射过程和准确性是开发微生物内膜炎模型的关键步骤。在这里，我们演示了使用革兰阳性杆菌 的静脉注射程序。我们向5只C57BL6小鼠的中层注射了100个CFU/0.5μL的 B.cereus。 感染后10小时，我们观察到 B.cereus的眼内生长到 大约1.8 x 10⁵ CFU/眼睛。 图1 演示了玻璃针的构造，将细菌送入小鼠眼睛的中游。 图2显示了在 血脂板和培养管中生长的杆 菌。 图 3 显示了使用空气加压喷射系统的小鼠内注射程序。 图 4 演示了感染后所需时间采集受感染眼睛的过程。 图 5 显示了受感染眼睛均质化的技术。 图 6 显示了感染后 10 小时五个不同小鼠眼睛.......

Discussion

即使有有效的抗生素、抗炎药和玻璃切除术，细菌性内膜炎也可以使患者失明。临床研究对治疗内膜炎是有益的;然而，眼膜炎的实验模型提供了快速和可重复的结果，可以转化为护理标准的进步，从而为患者提供更好的视觉结果。

小鼠眼的玻璃体积约为7μL^40。这种小体积只允许注入有限的材料。不应注入大于 1.0 μL 的体积，以避免眼部损伤。该过程需要特定的设备和技术实践，以确保可重复性和准确性。内皮炎已被研究在灵长类动物，猪，兔子，老鼠，豚鼠和^{在老鼠28，41，42，43，44，45。}在较大的物种中，眼睛的大小更接近于人眼，在没有特殊设备的情况下，可以对较大的眼睛.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-20 和微;L 移液器	RANIN	L0696003G	NA
37oC 培养箱	Fisher Scientific	11-690-625D	NA
Bacto Brain Heart Infusion	BD	90003-032	NA
细胞显微注射器	MicroData Instrument， Inc.	PM2000	NA
细尖镊子	Thermo Fisher Scientific	12-000-122	NA
玻璃珠 1.0 mm	BioSpec	11079110	NA
培养箱摇床	New Brunswick Scientific	NB-I2400	NA
微量毛细管移液器 5 微升	Kimble	71900-5	NA
微量移液器 斜口机	Sutter Instrument Co.	BV-10	NA
显微镜 Axiostar Plus	蔡司		NA
显微镜 OPMI Lumera	Zeiss		NA
Mini-Beadbeater-16	BioSpec	型号 607	NA
多通道移液器 30-300 µL	Biohit	15626090	NA
多通道移液器 5-100 µ	L Biohit	9143724	NA
针头/移液器拉拔器	Kopf	730	NA
PBS	GIBCO		分子级
蛋白酶抑制剂混合物	Roche	4693159001	分子级
反向作用镊子	Katena	K5-8228	NA