小鼠心肌梗死模型中注射型水凝胶负载间充质干细胞的心肌内移植

摘要

基于干细胞的治疗已成为修复心肌梗死后受损心肌组织的有效策略。我们提供了一种利用可被酶促交联的明胶水凝胶进行干细胞移植的最佳体内应用方法。

摘要

目前用于预防心肌梗死后心力衰竭的干细胞治疗面临的主要问题之一，是移植细胞在受损心肌中的滞留率和存活率较低，从而限制了其治疗效果。近年来，支架类生物材料的应用受到关注，因其有望改善并最大化干细胞治疗的疗效。本实验方案旨在介绍一种简单直接的技术，利用可注射的羟基苯基丙酸（GH）水凝胶来移植骨髓来源的间充质干细胞（MSCs）；由于这类水凝胶具备原位交联能力和高生物相容性，因此非常适合作为心脏组织工程中细胞递送的载体平台。我们展示了一种制备负载MSCs的GH水凝胶（MSC/水凝胶）的简便方法，并在三维（3D）体外培养条件下评估其细胞存活与增殖情况。此外，我们还演示了在小鼠体内进行心肌内移植MSC/水凝胶的技术，详细描述了通过结扎左前降支（LAD）冠状动脉诱导心肌梗死（MI）的手术操作，以及随后的MSC/水凝胶移植过程。

引言

心脏干细胞治疗已成为心肌修复与再生的一种潜在策略^1,4。尽管近年来在动物模型和临床试验中取得了积极成果，但由于移植细胞在梗死心肌组织中的滞留率低且存活率差，干细胞治疗在心肌修复中的应用仍受到限制^3,4。因此，基于细胞的组织工程技术，包括可注射生物材料⁵、心脏贴片⁶和细胞片层⁷，已被广泛研究，以提高细胞在宿主心肌中的滞留与整合能力。

在各种生物工程心脏组织修复的潜在方法中，将可注射水凝胶与适当类型的细胞（如间充质干细胞（MSCs）、胚胎干细胞（ESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs））相结合，是一种有效将细胞递送至心肌区域的有吸引力的策略^8,9。明胶是一种广为人知的天然聚合物，由于其良好的生物相容性、显著的生物可降解性以及相较于多种用于生物医学应用的生物材料更低的免疫原性，可被用作可注射基质。尽管基于明胶的可注射平台具有巨大潜力，但其在体内的适用性仍受限于其较低的机械刚度以及在生理环境中易于降解的特性。

为了克服这些局限性，已提出一种基于明胶、含有羟基苯丙酸的新型且简单的水凝胶设计，可用于体内应用。明胶-羟基苯丙酸（GH）共轭物可在辣根过氧化物酶（HRP）的作用下原位交联，并将多种药物、生物分子或细胞包封于水凝胶中，显示出在组织工程应用中的巨大潜力^{10,11,12,13,14}。此外，我们近期研究了包封间充质干细胞（MSCs）的GH水凝胶的治疗效果，并在小鼠心肌梗死（MI）模型中证实了其在心脏修复与再生中的成功应用¹⁵。在本实验方案中，我们描述了一种将MSCs包封于GH水凝胶中并进行体外三维（3D）增殖的简单技术。同时，我们介绍了一种外科手术方法，通过冠状动脉结扎建立小鼠心肌梗死模型，并将负载MSCs的GH水凝胶移植至梗死心脏的心肌内。

方案

所有动物实验操作均依照韩国天主教大学医学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）颁布的《实验动物福利法》、《实验动物照护与使用指南》以及《啮齿类动物实验指导原则与政策》进行。

1. 间充质干细胞和可注射明胶水凝胶的制备

1. 在37 °C和5% CO₂条件下，将MSCs培养于100 mm培养皿中。当MSCs生长至80%融合度时，用DPBS洗涤培养皿两次，并加入1 mL 37 °C的胰蛋白酶替代液，孵育3分钟。
   注意：MSCs按照常规方法从小鼠骨髓中分离¹⁶，在含10%胎牛血清（FBS）和1%抗生素-抗真菌溶液的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养，并在第7至9代用于本研究。
2. 加入9 mL培养基，以500 × g离心3分钟。随后弃去上清液，将细胞重悬于1 mL PBS中，并将细胞悬液置于冰上保存。
3. 取10 µL细胞悬液与10 µL台盼蓝混合，使用自动细胞计数仪测定细胞浓度。
4. 将MSCs重悬并转移至1 mL离心管中，细胞密度为1 × 10⁷ 个细胞/mL。
5. 在PBS中配制6.25 wt%的GH偶联物溶液，并分装至两个小瓶中。随后将GH溶液分别与6 µg/mL的HRP（GH溶液A）或0.07 wt%的H₂O₂（GH溶液B）混合。
   注意：明胶-羟基苯基丙酸（GH）偶联物的制备请参照已发表的实验方案^12,15。
   1. 保持GH偶联物溶液与HRP（GH溶液A）以及GH偶联物溶液与H₂O₂（GH溶液B）的体积比均为9:1。
6. 在将MSCs与GH溶液A混合前，先将细胞悬液以1,000 × g短暂离心，并小心吸除上清液。随后将含有MSCs的细胞沉淀与GH溶液A混合。

2. 原位MSC接种与三维体外培养

1. 将含有间充质干细胞（MSCs）的GH溶液A和GH溶液B分别装入双筒注射器的两侧。将混合后的GH溶液与MSCs共300 µL接种至八孔培养板中，终浓度为5 × 10⁶ 个细胞/mL。
2. 原位水凝胶形成并通过酶促交联实现MSC包封后，加入700 µL含10%胎牛血清（FBS）和1%抗生素-抗真菌溶液的DMEM培养基。
3. 将培养板置于37 °C、5% CO₂条件下孵育，每2–3天更换一次培养液。

3. 确认间充质干细胞在GH水凝胶中的体外增殖与存活

1. 为评估三维培养的间充质干细胞（MSCs）在GH水凝胶中的存活率，在预定的孵育时间后，采用活/死细胞染色法进行检测。
2. 将包埋于GH水凝胶中的MSCs分别孵育3、5、7或14天后，吸除培养基，并用PBS洗涤孔板两次。
3. 配制染色液：在10 mL DPBS中加入5 µL钙黄绿素乙酰甲酯（calcein AM）和20 µL乙啶同型二聚体-1（EthD-1）。
4. 向孔中加入200 µL染色液，在室温避光条件下孵育30分钟。
5. 吸除染色液，并用PBS洗涤孔板两次。
6. 小心将培养腔室从载玻片上分离，将盖玻片完整覆盖在GH水凝胶上。使用共聚焦显微镜观察包埋MSCs的增殖程度及形态学变化。
   注：荧光图像在200倍放大倍数下获取，钙黄绿素的激发/发射波长为470/540 nm，EthD-1的激发/发射波长为516/607 nm。

4. 小鼠心肌梗死的诱导

1. 使用生理盐水配制的 Zoletil（30 mg/kg）和 Rompun（10 mg/kg）混合物，通过腹腔注射麻醉 7 周龄雄性 C57BL/6 小鼠（20‒22 g）。
2. 手术前，使用脱毛膏去除小鼠胸部毛发，并用碘伏对皮肤进行消毒。
3. 将小鼠置于手术台上，通过将导管插入气管进行插管，以机械通气方式提供辅助氧气。
4. 使用手术剪轻轻剪开皮肤，再用显微剪穿透肋间肌。用 5-0 丝线牵开左侧第 2 和第 3 肋骨，以保持胸腔开放。
5. 使用持针器以 8-0 聚丙烯缝线小心结扎左前降支（LAD）冠状动脉，并用电灼法切断缝线。
6. 观察左心室前壁立即出现的颜色变化。

5. 心肌内移植负载MSC的GH水凝胶

1. 通过结扎左前降支（LAD）诱导心肌梗死后，使用配备26G针头的双注射器，在梗死边缘区的两个不同位置各注射10 µL负载间充质干细胞（MSC）的GH溶液（总量：2 × 10⁵ 个MSC/20 µL）。
   1. 按照步骤1中所述相同方法，将负载MSC的GH溶液制备并转移至双注射器中。
      注意：为评估负载MSC的GH水凝胶在梗死区域内的定植情况，MSC和GH偶联物分别预先用PHK26和异硫氰酸荧光素（FITC）标记。
2. 复位打开的胸腔，并使用5-0缝线缝合肌肉和皮肤。
   注意：在关闭胸腔前，需使用导管注射器排出空气。
3. 拔除气管插管，将小鼠置于红外灯下的笼子中进行恢复。
4. 术后镇痛方面， 应皮下注射酮洛芬（Ketoprofen）（5 mg/kg/天），持续至少72小时。所有小鼠均需密切观察足够时间，以确保手术后恢复良好，并获得充分的疼痛治疗。

6. 超声心动图

1. 移植后四周，先用5%异氟烷对小鼠进行初始麻醉，然后将异氟烷浓度调整至1%。
2. 使用脱毛膏去除胸部毛发，将小鼠置于加热垫上，并在胸部涂抹超声探头耦合剂。
3. 获取胸骨旁短轴切面的二维图像，并在乳头肌水平记录M型超声波图。
   注意：将线阵探头（7–15 MHz）置于左侧胸骨旁线，观察解剖结构。
4. 测量左室前壁（LVAW）、左室内径（LVID）和左室后壁（LVPW）的相应数值，以获得心肌壁厚度、心腔大小及缩短分数。
   注意：比较乳头肌水平的心功能指标，包括射血分数（EF）、缩短分数（FS）和收缩末期容积（ESV），以确保在相同的解剖位置进行准确评估。

7. 组织学评估

1. 在将负载MSC的GH水凝胶移植到梗死心脏后的预定时间点，将小鼠置于CO₂麻醉箱中实施安乐死，并取心脏进行组织学分析¹⁵。
2. 对于苏木精-伊红（H&E）染色和马松三色（MT）染色，将分离的心脏组织用4%多聚甲醛（PFA）固定后进行石蜡包埋。随后使用切片机将石蜡包埋的心脏组织切成4 µm连续切片，并按照标准方案进行MT染色¹⁷。
3. 在切片扫描仪上以20倍放大倍数采集图像，并计算各治疗组的梗死面积。
   梗死面积（%）= 梗死区总周长 / 左心室总周长 × 100
4. 通过中线长度测量法计算上述两个周长。对于左心室中线周长，测量心内膜与心外膜表面之间的中心线长度；对于梗死区中线周长，测量梗死区域长度，该区域需包含超过50%全层心肌厚度的部分¹⁸。
   注：所有图像分析均使用ImageJ软件完成。
5. 测量乳头肌水平处瘢痕的心室壁厚度。
6. 计算胶原面积占比。
   胶原面积（%）= 间质纤维化/心肌细胞区域总面积 / 心肌细胞区域总面积 × 100

结果

为了有效将间充质干细胞（MSCs）递送至梗死心肌，本实验方案采用了如图1所示的可原位交联的负载MSCs的水凝胶。在体内移植前，通过三维体外活/死细胞染色实验（活细胞：绿色；死细胞：红色）验证了MSCs在GH水凝胶中的增殖与存活情况。如图2所示，代表性图像显示MSCs在GH水凝胶内充分增殖，形成分支状网络结构。此外，在第14天可清晰观察到MSCs形成的复杂多细胞三维结构，表明GH水凝胶能够为包封的细胞提供适宜的微环境。

通过左前降支结扎法诱导心肌梗死（MI）后，将负载间充质干细胞（MSC）的GH水凝胶直接移植到梗死周围区域（图3A）。如图3B所示，MSCs和凝胶在梗死区域得到了良好维持。用PHK26（红色）染色的MSCs很好地整合在用FITC（绿色）染色的GH水凝胶中，表明在体内应用中，MSCs在梗死心脏中成功植入并长期保留。

讨论

可注射GH水凝胶因其能够在体内均匀地原位包载多种治疗剂，而在体内应用方面具有巨大潜力。此外，其物理和生化特性可根据疾病相关需求进行灵活调控。鉴于此，可注射水凝胶已被提出用于解决当前心脏干细胞治疗中存在的主要局限性，即细胞存活率低和细胞滞留效果差（例如 < 移植后24小时内损伤心脏中的10%^19,20为克服这一不良结果，本文所述方案提供了一种简单且可行的方法，通过使用可在心肌移植后原位交联的GH水凝胶，以提高细胞滞留率与存活率，该方法在小鼠心肌梗死模型中已显示出对心脏结构和功能的有利作用。

该技术的主要优势在于其广泛的体内适用性，可与任何类型的细胞和生物分子联用，只需在注射前将细胞或生物分子与预凝胶GH溶液简单混合即可实现负载。此外，为了全面了解供体与宿主之间的相互作用，可采用一种直接的标记方法对GH偶联物和/或包封的生物分子进行标记，以追踪其在体内的稳定性、宿主整合性及吸收动力学的变化。据我们所知，将可注射的明胶基水凝胶与治疗性干细胞联合使用，是首次在体外和...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4 % 多聚甲醛 (PFA)	Intron	IBS-BP031-2
5-0 丝线缝合线	AILEE	SK534
8-0 聚丙烯缝合线	ETHICON	M8732H
8孔细胞培养板	Nunc LAB-TEK	154534
Angiocath Plus (22GA) 导管	BD Angiocath Plus	REF382423
抗生素-抗真菌剂	Gibco	15240-062
离心机	GYROGEN	1582MGR
共聚焦显微镜	Zeiss	LSM 510
盖玻片	MARIENFELD	101242
高级高温电灼套装	Bovie	QTY1
DMEM	Gibco	11995-065
DPBS	Gibco	14040-133
双筒注射器
伊红	SIGMA-ALDRICH	HT110116
乙醇	EMSURE	K49350783 739
胎牛血清 (FBS)	Gibco	16000-044
Fechtner 钛合金结膜镊	WORLD PRECISISON INSTRUMENTS	WP1820
异硫氰酸荧光素同分异构体 I (FITC)	SIGMA-ALDRICH	F7250
镊子	HEBU	HB0458
脱毛膏	Ildong Pharmaceutical
加热垫	Stoelting	50300	恒温毯系统
		50301	50300 型加热垫替换件 (10 X 12.5 cm)
苏木精	SIGMA-ALDRICH	HHS80
辣根过氧化物酶 (HRP; 250-330 U/mg)	SIGMA-ALDRICH	P8375
过氧化氢 (H2O2; 30 wt % in H2O)	SIGMA-ALDRICH	216763
碘	Green Pharmaceutical
LIVE/DEAD 细胞染色试剂盒	Thermo Fisher	R37601
机械呼吸机	Harvard Apparatus
微量离心机	HANIL	Micro 12
显微持针器	KASCO	37-1452
显微剪刀	HEBU	HB7381
显微镜	OLYMPUS	SZ61
MT 染色试剂盒	SIGMA-ALDRICH	HT1079-1SET	Weigert’s 铁苏木精溶液
		HT15-1KT	三色染色 (Masson) 试剂盒
石蜡	LK LABKOREA	H06-660-107
PBS 缓冲液	Gibco	10010-023
PHK26 染色试剂盒	SIGMA-ALDRICH	MINI26
切片扫描仪	Leica	SCN400
手术剪刀	HEBU	HB7454
手术胶带	3M micopore	1530-1
组织包埋盒	Scilab Korea	Cas3003
超声耦合剂	SUNGHEUNG	SH102
Trout-Barraquer 弯头持针器	KASCO	50-3710c
超声系统	Philips	Affiniti 50
二甲苯	JUNSEI	25175-0430