方法文章

小鼠心肌梗死模型中注射型水凝胶负载间充质干细胞的心肌内移植

DOI：

10.3791/61752

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2020年9月20日

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1Cardiovascular Research Institute for Intractable Disease, College of Medicine, The Catholic University of Korea, 2Division of Cardiology, Department of Internal Medicine, Seoul St. Mary's Hospital, College of Medicine, The Catholic University of Korea, 3Division of Cardiology, Department of Internal Medicine, Uijeongbu St. Mary's Hospital, College of Medicine, The Catholic University of Korea

本文内容

摘要

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基于干细胞的治疗已成为修复心肌梗死后受损心肌组织的有效策略。我们提供了一种利用可被酶促交联的明胶水凝胶进行干细胞移植的最佳体内应用方法。

摘要

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目前用于预防心肌梗死后心力衰竭的干细胞治疗面临的主要问题之一，是移植细胞在受损心肌中的滞留率和存活率较低，从而限制了其治疗效果。近年来，支架类生物材料的应用受到关注，因其有望改善并最大化干细胞治疗的疗效。本实验方案旨在介绍一种简单直接的技术，利用可注射的羟基苯基丙酸（GH）水凝胶来移植骨髓来源的间充质干细胞（MSCs）；由于这类水凝胶具备原位交联能力和高生物相容性，因此非常适合作为心脏组织工程中细胞递送的载体平台。我们展示了一种制备负载MSCs的GH水凝胶（MSC/水凝胶）的简便方法，并在三维（3D）体外培养条件下评估其细胞存活与增殖情况。此外，我们还演示了在小鼠体内进行心肌内移植MSC/水凝胶的技术，详细描述了通过结扎左前降支（LAD）冠状动脉诱导心肌梗死（MI）的手术操作，以及随后的MSC/水凝胶移植过程。

引言

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心脏干细胞治疗已成为心肌修复与再生的一种潜在策略1,4。尽管近年来在动物模型和临床试验中取得了积极成果，但由于移植细胞在梗死心肌组织中的滞留率低且存活率差，干细胞治疗在心肌修复中的应用仍受到限制3,4。因此，基于细胞的组织工程技术，包括可注射生物材料5、心脏贴片6和细胞片层7，已被广泛研究，以提高细胞在宿主心肌中的滞留与整合能力。

在各种生物工程心脏组织修复的潜在方法中，将可注射水凝胶与适当类型的细胞（如间充质干细胞（MSCs）、胚胎干细胞（ESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs））相结合，是一种有效将细胞递送至心肌区域的有吸引力的策略8,9。明胶是一种广为人知的天然聚合物，由于其良好的生物相容性、显著的生物可降解性以及相较于多种用于生物医学应用的生物材料更低的免疫原性，可被用作可注射基质。尽管基于明胶的可注射平台具有巨大潜力，但其在体内的适用性仍受限于其较低的机械刚度以及在生理环境中易....

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方案

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所有动物实验操作均依照韩国天主教大学医学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）颁布的《实验动物福利法》、《实验动物照护与使用指南》以及《啮齿类动物实验指导原则与政策》进行。

1. 间充质干细胞和可注射明胶水凝胶的制备

  1. 在37 °C和5% CO2条件下，将MSCs培养于100 mm培养皿中。当MSCs生长至80%融合度时，用DPBS洗涤培养皿两次，并加入1 mL 37 °C的胰蛋白酶替代液，孵育3分钟。
    注意：MSCs按照常规方法从小鼠骨髓中分离16，在含10%胎牛血清（FBS）和1%抗生素-抗真菌溶液的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养，并在第7至9代用于本研究。
  2. 加入9 mL培养基，以500 × g离心3分钟。随后弃去上清液，将细胞重悬于1 mL PBS中，并将细胞悬液置于冰上保存。
  3. 取10 µL细胞悬液与10 µL台盼蓝混合，使用自动细胞计数仪测定细胞浓度。
  4. 将MSCs重悬并转移至1 mL离心管中，细胞密度为1 × 107 个细胞/mL。
  5. 在PBS中配制6.25 wt%的GH偶联物溶液，并分装至两个小瓶中。随后将GH溶液分别与6 µg/mL的HRP（GH溶液A）或0.07 wt%的H2O2

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结果

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为了有效将间充质干细胞（MSCs）递送至梗死心肌，本实验方案采用了如图1所示的可原位交联的负载MSCs的水凝胶。在体内移植前，通过三维体外活/死细胞染色实验（活细胞：绿色；死细胞：红色）验证了MSCs在GH水凝胶中的增殖与存活情况。如图2所示，代表性图像显示MSCs在GH水凝胶内充分增殖，形成分支状网络结构。此外，在第14天可清晰观察到MSCs形成的复杂多细胞三维结构，表明GH水凝胶能够为包封的细胞提供适宜的微环境。

通过左前降支结扎法诱导心肌梗死（MI）后，将负载间充质干细胞（MSC）的GH水凝胶直接移植到梗死周围区域（图3A）。如图3B所示，MSCs和凝胶在梗死区域得到了良好维持。用PHK26（红色）染色的MSCs很好地整合在用FITC（绿色）染色的GH水凝胶中，表明在体内应用中，MSCs在梗死心脏中成功植入并长期保留。

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讨论

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可注射GH水凝胶因其能够在体内均匀地原位包载多种治疗剂，而在体内应用方面具有巨大潜力。此外，其物理和生化特性可根据疾病相关需求进行灵活调控。鉴于此，可注射水凝胶已被提出用于解决当前心脏干细胞治疗中存在的主要局限性，即细胞存活率低和细胞滞留效果差（例如 < 移植后24小时内损伤心脏中的10%19,20为克服这一不良结果，本文所述方案提供了一种简单且可行的方法，通过使用可在心肌移植后原位交联的GH水凝胶，以提高细胞滞留率与存活率，该方法在小鼠心肌梗死模型中已显示出对心脏结构和功能的有利作用。

该技术的主要优势在于其广泛的体内适用性，可与任何类型的细胞和生物分子联用，只需在注射前将细胞或生物分子与预凝胶GH溶液简单混合即可实现负载。此外，为了全面了解供体与宿主之间的相互作用，可采用一种直接的标记方法对GH偶联物和/或包封的生物分子进行标记，以追踪其在体内的稳定性、宿主整合性及吸收动力学的变化。据我们所知，将可注射的明胶基水凝胶与治疗性干细胞联合使用，是首次在体外和.......

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披露

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作者声明本研究无任何利益冲突。

致谢

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本研究由韩国国家研究基金会（NRF）通过教育部长资助的基础科学研究中心项目（NRF-2018R1D1A1A02049346）支持

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4 % 多聚甲醛 (PFA)IntronIBS-BP031-2
5-0 丝线缝合线AILEESK534
8-0 聚丙烯缝合线ETHICONM8732H
8孔细胞培养板Nunc LAB-TEK154534
Angiocath Plus (22GA) 导管BD Angiocath PlusREF382423
抗生素-抗真菌剂Gibco15240-062
离心机GYROGEN1582MGR
共聚焦显微镜ZeissLSM 510
盖玻片MARIENFELD101242
高级高温电灼套装BovieQTY1
DMEMGibco11995-065
DPBSGibco14040-133
双筒注射器
伊红SIGMA-ALDRICHHT110116
乙醇EMSUREK49350783 739
胎牛血清 (FBS)Gibco16000-044
Fechtner 钛合金结膜镊WORLD PRECISISON INSTRUMENTSWP1820
异硫氰酸荧光素同分异构体 I (FITC)SIGMA-ALDRICHF7250
镊子HEBUHB0458
脱毛膏Ildong Pharmaceutical
加热垫Stoelting50300恒温毯系统
5030150300 型加热垫替换件 (10 X 12.5 cm)
苏木精SIGMA-ALDRICHHHS80
辣根过氧化物酶 (HRP; 250-330 U/mg)SIGMA-ALDRICHP8375
过氧化氢 (H2O2; 30 wt % in H2O)SIGMA-ALDRICH216763
碘Green Pharmaceutical
LIVE/DEAD 细胞染色试剂盒Thermo FisherR37601
机械呼吸机Harvard Apparatus
微量离心机HANILMicro 12
显微持针器KASCO37-1452
显微剪刀HEBUHB7381
显微镜OLYMPUSSZ61
MT 染色试剂盒SIGMA-ALDRICHHT1079-1SETWeigert’s 铁苏木精溶液
HT15-1KT三色染色 (Masson) 试剂盒
石蜡LK LABKOREAH06-660-107
PBS 缓冲液Gibco10010-023
PHK26 染色试剂盒SIGMA-ALDRICHMINI26
切片扫描仪LeicaSCN400
手术剪刀HEBUHB7454
手术胶带3M micopore1530-1
组织包埋盒Scilab KoreaCas3003
超声耦合剂SUNGHEUNGSH102
Trout-Barraquer 弯头持针器KASCO50-3710c
超声系统PhilipsAffiniti 50
二甲苯JUNSEI25175-0430

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jhund, P. S., McMurray, J. J. Heart failure after acute myocardial infarction: a lost battle in the war on heart failure. Circulation. 118 (20), 2019-2021 (2008).
  2. Cahill, T. J., Kharbanda, R. K.

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